GST亲和层析介质使用说明书
谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)试剂盒说明书
货号: MS1204 规格：100管/96样谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：GST 是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。
GST 是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与 GSH 的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。
因此，GST 在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。
此外，因为 GST 具有 GSH-Px 活性，亦称为 non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。
注意，GST 催化的反应减少 GSH 含量，但是不增加GSSG 含量。
测定原理：GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm 波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。
自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、和蒸馏水。
试剂组成和配置：试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。
临用前加2 mL蒸馏水溶解。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
GST-FF层析填料说明书
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow原理谷胱甘肽S-转移酶是一种经常被使用的Tag，可以使含有谷胱甘肽S-转移酶的重组蛋白的纯化和检测更加容易，为了使产物的纯化更简单，GST融合蛋白的一步纯化是可用的。
纯化简要概述结合缓冲液：140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4, pH 7.3洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl, 10mM 还原型谷胱甘肽, pH 8.01，用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
2，上样。
3，用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱子。
4，用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
5，用5-10倍体积的结合缓冲液冲洗柱子。
使用注意1，样品上样期间和洗脱期间，保持较低的流速是非常重要的，因为GST和谷胱甘肽互相间的结合动力学作用是相对较低的。
其结合容量是依赖于蛋白质的特性，因此其产量是依赖于蛋白质的类型而变化的。
使用较低的流速或者将样品反复流过柱子几次，或许可以提高产量。
2，柱子的重复使用取决于样品的特性。
对同一样品重复使用时，需考虑避免交叉污染的问题。
在位清洗1，用2-3倍柱体积的，高端pH值为（0.1M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH8.0）和低端pH值为（0.1M 醋酸钠,0.5M NaCl,pH4.5）的缓冲液交替冲洗柱子。
2，重复循环3次。
3，立即用3-5个柱体积的结合缓冲液再平衡柱子。
沉淀蛋白质的去除1，用2倍柱体积的6M的盐酸胍冲洗柱子。
2，立即用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子。
通过疏水性互相作用结合到柱子上的物质的去除1，用3-4倍柱体积的70%的乙醇冲洗柱子（或者2倍柱体积的非离子型去污剂如1%的曲拉通-100冲洗柱子）。
2，立即用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子。
当填料在室温状态下暴露在0.1M柠檬酸盐（pH4.0），0.1M NaOH，70%的乙醇或者6M盐酸胍2小时后，其结合能力没有显著地丢失。
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B（GST 标签纯化树脂）说明书
谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B （GST 标签纯化树脂）说明书货号：P2020规格：5mL/10mL/25mL/50mL保存：4℃保存，有效期至少一年。
产品简介：pGEX 载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。
GSTs 是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。
由于GST 对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST 及其融合蛋白的纯化效率很高。
可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST 融合蛋白。
树脂用3mol/L NaCl 的缓冲液再生。
谷胱甘肽琼脂糖对GST 融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白）。
特性:粒度：45-165µm流速：75cm/h 工作PH ：4-10耐压：0.3Mpa载量：＞5mg 谷胱甘肽S-转移酶使用说明：谷胱甘肽树脂的处理:1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。
2.取部分匀浆放入15mL 聚丙烯管（每100mL 细菌培养物大约需要2mL 匀浆）。
3.4℃500g 离心5分钟，小心去掉上清。
4.在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS ，颠倒数次混匀，4℃500g 离心5分钟，小心去掉上清。
5.每毫升树脂加入1毫升冷的PBS ，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。
制备细胞抽提物：6.每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS 缓冲液中。
7.加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。
8.用针筒将10mL 浓度为0.2%的TritonX-100强行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。
加入DNase 和RNase 至终浓度5ug/mL,4℃振动温育10分钟，4℃3000g 离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT 至终浓度1mmol/L 。
亲和层析预装柱和填料选择指南
亲和层析预装柱和填料选择指南亲和层析是一种常用的生物分离技术，其基本原理是利用靶分子与具有特殊亲和性的固定相相互作用，实现目标分子的分离纯化。
该技术被广泛应用于蛋白质纯化、分析、制备以及药物研发中。
本文将为您介绍亲和层析预装柱和填料选择的指南。
首先，亲和层析的预装柱种类繁多，如Ni-NTA、GST、MBP、Protein A、Protein G、Protein L等。
选择合适的预装柱主要取决于目标蛋白的性质和亲和配体的选择。
以下是几种常见的亲和层析预装柱及其适用性。
1. Ni-NTA柱：适用于His标记蛋白的纯化。
该柱上的Ni2+离子与His标记相互作用，实现蛋白的选择性吸附。
Ni-NTA柱广泛应用于蛋白质纯化和表达系统中。
2. GST柱：适用于GST标记蛋白的纯化。
GST标记用于表达系统和蛋白质亲和纯化，其独特的亲和性可与谷胱甘肽S转移酶 (glutathione S-transferase，GST)结合。
3. MBP柱：适用于MBP标记蛋白的纯化。
麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)可通过特异性辅助蛋白结合一些亲和配体，实现蛋白的纯化和表达。
4. Protein A/G/L柱：适用于免疫球蛋白 (IgG) 的富集。
Protein A/G/L分别与IgG的不同部位结合，用于IgG的富集和纯化，常用于抗体生产和医学诊断。
其次，填料选择也是亲和层析中一项重要的技术选择。
填料是用于填充柱体的固体介质，其性能直接影响到层析分离的效果。
以下是一些常见的填料种类及其特点：1.球形填料：球形填料具有均一的颗粒尺寸和良好的柱层分离性能。
常见的球形填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
2.凝胶填料：凝胶填料通常用于分离较大分子，如蛋白质、核酸等。
常见的凝胶填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
3.磁性填料：磁性填料具有较高的分离效率和灵敏度，常用于磁性亲和层析。
磁性填料结合预装柱可以实现高通量的自动化分离和纯化。
cytivagst亲和层析柱中文说明书
cytivagst亲和层析柱中文说明书CyTiva GST亲和层析柱是一种常用的色谱柱，用于蛋白质的纯化和分离。
亲和层析是一种基于蛋白质与特定配体之间的非共价相互作用而进行的纯化方法。
本文将详细介绍CyTiva GST亲和层析柱的原理、优点、使用方法和注意事项。
一、原理CyTiva GST亲和层析柱采用谷氨酸-S-转移酶(Glutathione-S-Transferase，GST)作为亲和配体。
GST是从谷胱甘肽(glutathione)中分离得到的一种蛋白质。
该配体与GST融合的蛋白质有很高的亲和力，可被其特异性地捕获。
在层析过程中，样品与柱填料表面的GST结合形成复合物。
通过洗脱缓冲液中pH、盐浓度或添加特定配体等的调节，使复合物分离并得到目标蛋白质。
二、优点1.高选择性：CyTiva GST亲和层析柱具有很高的选择性，可以高效地分离和纯化GST融合的目标蛋白质。
2.高纯度：层析过程中，非特异性结合蛋白质可被洗脱掉，从而得到高纯度的目标蛋白质。
三、使用方法1.准备工作：柱前洗脱，根据柱填料要求进行预处理。
2.样品处理：目标蛋白质表达并纯化后，与GST融合的载体进行融合。
此后，将样品溶液等体积注入已平衡的柱中。
3.洗脱条件的选择：根据样品的属性，选择适宜的洗脱缓冲液，进行洗脱。
可以按照pH、盐浓度、添加特定配体等来调节洗脱条件。
4.目标蛋白质洗脱：将目标蛋白质从柱中洗脱出来，收集洗脱液。
四、注意事项1.样品的处理：目标蛋白质应表达和纯化得到GST融合蛋白质。
2.柱前处理：根据柱填料的要求，进行柱前洗脱处理。
3.洗脱缓冲液的调节：根据样品的特性和所需的洗脱条件进行调节。
常用的洗脱条件包括调节pH、盐浓度、添加特定配体等。
4.洗脱收集：在洗脱过程中，及时收集洗脱液。
总结：CyTiva GST亲和层析柱是一种常用的蛋白质纯化和分离工具，基于GST与目标蛋白质的非共价相互作用。
它具有高选择性和高纯度的优点，可广泛应用于生物医药研究领域。
亲和层析纯化可溶性GST标签重组蛋白的标准操作规程
亲和层析纯化可溶性GST标签重组蛋白的标准操作规程（编号：069）1、目的及适用范围利用GST亲和层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。
2、主要仪器GST柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机3、主要试剂3.1 Binding Buffer：1×PBS3.2 Elution Buffer：20-50mM还原型谷胱甘肽3.3 高pH值缓冲溶液：0.1M Tris，0.5M NaCl，pH 8.53.4 低pH值缓冲溶液：0.1M 醋酸钠，0.5M NaCl，pH4.54、GST柱的预处理用5个柱体积的1×PBS缓冲溶液平衡柱子5、操作步骤5.1蛋白的纯化5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；5.1.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体；5.1.3 将收集的菌体用1×PBS重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；5.1.4 将菌体用1×PBS重悬，超声破碎菌体；5.1.5 4℃，12000rpm，离心15min，收集超声后上清；6.1.6 将收集的上清加入GST柱子中，4℃结合2h；5.1.7 流出穿透液；5.1.8 用20-30个柱体积的1×PBS冲洗柱子，除去非特异性结合的杂蛋白；5.1.9 用1-3个柱体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白；5.1.10将诱导前全菌，诱导后全菌，穿透，洗脱样品进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。
5.2 柱子的再生5.2.1 用3个柱体积的高pH缓冲溶液冲洗柱子；5.2.2 用3个柱体积的低pH缓冲溶液冲洗柱子；141。
gst亲和层析步骤
gst亲和层析步骤GST（谷胱甘肽S-转移酶）亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，它基于谷胱甘肽S-转移酶与谷胱甘肽结合的高亲和力，可用于纯化含有GST标签的蛋白质。
第一部分：材料准备在进行GST亲和层析之前，需要准备一些实验材料。
以下是常见的实验材料列表：1. 细菌表达系统：常用的细菌表达系统包括大肠杆菌（E. coli）和酵母菌等。
选择适当的表达系统，并确保表达系统中含有GST融合蛋白的基因。
2. 培养基和抗生素：根据表达系统的需求，准备适当的培养基，并添加相应的抗生素以选择含有GST融合蛋白的菌落。
3. 细胞破碎缓冲液：根据实验需求选择适当的细胞破碎缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或Tris缓冲液，并添加辅助试剂如EDTA（乙二胺四乙酸）和PMSF （苯甲磺酰氟）等。
4. 融合蛋白纯化缓冲液：准备一系列用于融合蛋白纯化的缓冲液，包括洗脱缓冲液、结合缓冲液、平衡缓冲液等。
常用的缓冲液成分包括PBS、NaCl（氯化钠）、DTT（二硫苏糖醇）和Tween-20等。
5. GST树脂：选择合适的GST亲和树脂，如GST-Sepharose或Glutathione Agarose等。
6. 色谱柱：选择合适的色谱柱，如预装的柱子或自制的柱子，并进行消毒和平衡。
7. 蛋白质测定试剂盒：用于测定蛋白质的浓度，如BCA（双硫苏糖酸）蛋白定量试剂盒。
第二部分：GST融合蛋白的表达和纯化1. 转化细菌：将含有GST融合蛋白基因的质粒DNA转化到表达宿主细胞中，如E. coli。
通过热激冷冻法、电穿孔法或化学法等方法将质粒DNA导入细菌细胞内。
2. 培养细菌：将转化后的细菌菌落接种到含有适当抗生素的培养基中，并在适当的条件下培养细菌，如温度、pH值和搅拌速度等。
3. 蛋白表达诱导：当细菌培养达到适当的生长阶段时，添加适当浓度的诱导剂，如IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷），以诱导GST融合蛋白的表达。
4. 细胞收获：在蛋白表达诱导后一定时间，收集细菌细胞。
GST-RESIN
5.
纯化结束以后，使用 20 倍柱体积 1% 醋酸冲洗纯化柱，
再使用 PBS/TBS 平衡 pH，大量纯水洗柱，最后加入 5 ml 20%乙醇，
保存在 4 ℃，不要在-20 ℃冻结，仔细保存可以让一根柱子反复使用。
三、补充说明：
1.
在未知 GST 融合蛋白稳定性的情况下，整个纯化过程最
好在 4℃完成，可以使用蛋白酶抑制剂防止降解。此外，可以使用非
可以使用多根柱子。
3.
如果 GST 融合蛋白是包涵体形式，那么只有做了复性以
后，才可以使用 GST-resin 纯化，通常的复性过程耗时、耗力，并不
容易成功。
4.
洗脱缓冲液中的 GSH 浓度不要太高，否则会改变洗脱缓
冲液的 pH，通常 4-10 mM 就足够了。
5.
可以使用在柱酶切的方法，得到去除 GST 的目标蛋白。
对于 b)需要用严厉一点的条件，但尽量不要用强酸或者强碱处理，GSH 容易发生碱水解。
建议使用8M 尿素洗珠子5倍柱体积，再用纯水冲洗干净。其它的方法如下：
If the gel appears to be loosing binding capacity, it may be due to an accumulation of precipitated, denatured or non-specifically bound proteins.
Amicon Pro Affinity Concentration Kit - GST 产品说明书
Amicon® Pro AffinityConcentration Kit - GSTPurification of GST-tagged recombinant proteins.Catalog Nos. ACR5000GS, ACK5003GS, ACK5010GS, ACK5030GS,ACK5050GS, ACK5100GSFOR RESEARCH USE ONLYNot for use in diagnostic procedures.USA & Canada Phone: +1(800) 437-7500 Fax: +1 (951) 676-9209Australia +61 3 9839 2000IntroductionThe expression and purification of recombinant proteins is central to protein regulation, structure and function studies. Purification has been greatly facilitated by the addition of small affinity tags to protein sequences such as the glutathione S-transferase domain (GST). GST agarose resin is an affinity chromatography matrix, when used in concert with the Amicon®Pro Affinity Concentration device, offers rapid purification of GST fusion proteins, native GST, or glutathione-binding proteins. GST-tagged proteins bind specifically to reduced glutathione in near-neutral, non-denaturing conditions (e.g., phosphate buffer). Following resin capture of the target protein, unbound lysate components are removed by spin-based clearing and washing steps. Bound protein is recovered by centrifugation following competitive displacement with buffer containing free, reduced glutathione.By condensing the entire purification workflow into one device, the Amicon® Pro device eliminates the need for multiple sample transfers thereby minimizing protein loss. The large exchange device reservoir (up to 9ml) accommodates a range of sample capacities as well as reduces the need for multiple spin steps during the wash and elution phases. Direct coupling to an Amicon® Ultra-0.5 device further provides simultaneous concentration during the elution phase. Lastly, the Amicon® Pro device offers highly efficient diafiltration in a single 15 minute spin.The kit contains sufficient GST resin, optimized buffers, and Amicon® Pro devices for 12 standard reactions.Sample Preparation GuidelinesOptimizing lysis parameters is critical for protein extraction and downstream purification. The Amicon®Pro Affinity Concentration GST kit is compatible with a range of conditions, including reducing agents (β-mercaptoethanol, DTT), chelating agents (EDTA), non-ionic detergents, and BugBuster®Protein Extraction Reagent (Cat. No. 70584), a proprietary mixture of non-ionic detergents offering a rapid cost-effective alternative to mechanical cell lysis methods such as sonication.Irrespective of extraction method, we recommend inclusion of rLysozyme™ Solution (Cat. No.71110) and Benzonase®Nuclease (Cat. No. 70746) and during protein extraction for increased cell lysis (protein yield) and a reduction in sample viscosity (improved sample handling), respectively.Protease inhibitors may also be added to the lysis buffers to protect against degradative enzymes.A listing of individual protease inhibitors and cocktails is available at /search on key words “Protease Inhibitor.” Note: Serine proteases should be used with caution if the GST fusion tag is to be cleaved via Thrombin or Factor Xa digestion. If used during protein extraction, we strongly recommend the eluted fraction be buffer exchanged prior to performing the cleavage reaction.In certain systems, high protein expression can lead to aggregation in the form of inclusion bodies.Strong denaturants such as 6 M guanidine or 8 M urea can be used to solubilize aggregates greatly enhancing yield. However, only properly folded, functional GST is capable of binding GST resin. GST fractions recovered from denaturation of inclusion bodies must be refolded to reconstitute active GST fusion constructs. To a degree, this can be accomplished through use of the Protein Refolding Kit (Cat. No. 70123).Cat. No. BWEGSFor more information, consult the GST•Bind™ Resin User Guide available at /chemicals. Search using the Cat. No. 70541.Kit ComponentsCS211421-GST Resin (3 mL) – Crosslinked agarose with immobilized reduced glutathione supplied as 50% slurry in 50 mM Phosphate Buffer pH 7.5, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN3. The resin utilizes an 11-atom spacer arm (~16 Å) for covalent attachment of reduced glutathione via a sulfide linkage. The binding capacity is typically 5-8 mg/mL of settled resin.Buffers:o CS211416-10X GST Bind/Wash Buffer (25 mL) – 43 mM Na2HPO4, 14.7 mM KH2PO4,1.37 M NaCl, 27 mM KCl pH7.2o CS211354-10X Glutathione Reconstitution buffer (5 mL) – 500 mM Tris, pH 8.0o CS211418-Glutathione, reduced, free acid (125 mg)Amicon®Pro Devices – The kit includes 12 complete assemblies. Each device consists of an exchange device, holder tube, 50 mL collection tube, and Amicon®Ultra-0.5 centrifugal filter device. A 2 mL collection tube is included for sample recovery from the AU-0.5 device by reverse spin. The kit is available in five formats based on the nominal molecular weight limit (NMWL) of the AU-0.5: 3 (ACK5003GS), 10 (ACK5010GS), 30 (ACK5030GS), 50 (ACK5050GS), and 100 kDa (ACK5100GS). Consult the Amicon®Pro (/psp, search keywords “Amicon Pro”) and Amicon®Ultra-0.5 centrifugal filter device User Guides (/catalogue/module/c82301) for proper assembly/disassembly and additional product information.All reagents should be stored at 2° to 8°C (do not freeze). The Amicon Pro devices can be stored separately at room temperature.Procedures for using the Amicon® Pro Affinity Concentration Kit - GSTThe protocol is based on purification of GST-tagged protein from 1 mL of E. coli lysate using 200 µl of GST resin slurry (100 µL packed resin). The protocol is linearly scalable for 50-1000 µL of resin slurry. Due to large variability among sample preps, parameters which may require optimization include bead input, binding time, wash, and elution parameters. This protocol includes steps for simultaneous concentration during the elution step as well as buffer exchange using the Amicon®Ultra-0.5 centrifugal filter device.Note: Given the collection tube’s capacity, it is not necessary to remove filtrate between the various centrifugation steps. However, if process samples need be retained for analytical purposes, the collection tube should be cleared.Buffer Preparation10X Bind/Wash Buffer should be diluted to 1X with sterile deionized H2O; 1X Bind/Wash solution may be stored at 4°C for 1 week.Prepare 10X GST Elution Buffer containing 100 mM reduced glutathione as follows: add 4ml 10X Reconstitution buffer directly to the glutathione powder vial. Pipette repeatedly then incubate for30 minutes at room temperature. Divide buffer into working volumes and store at -20o C (400Cat. No. BWEGSµl/standard reaction); 10X GST Elution Buffer is stable for 6 months at -20o C. We do not recommend repeated freeze/thaw cycles. To minimize glutathione oxidation, dilute 10X buffer to 1X using sterile deionized water and pH to 8.0 immediately before use. Discard any unused 1X Elution Buffer.Bead Preparation1. To ensure uniform suspension, vortex the GST resin thoroughly before adding it to the device.2. Remove the collection tube cap and open the exchange device cap.3. Add 200 µL of resin slurry to the base of the exchange device. Close the exchange cap.Up to 500 µl packed resin (1000 µl slurry volume) may be added per device We recommend using wide-bore tips (Cat. No. 02-707-134, Fisher Scientific) for resin transfer.4. To remove storage buffer, centrifuge in a swinging bucket rotor at 1000 g X 1 min.5. Add 500 µL of 1X Bind Buffer. Centrifuge at 1000 g X 1 min.Protein Binding1. Add 500 µL of sample to the exchange device.Up to 9 mL of sample can be added. The volume loaded is determined by the target protein’s expression level and resin’s binding capacity.2. Incubate for 60 min at room temp with gentle agitation.We recommend upright agitation on a plate shaker at low setting.End-over-end mixing, particularly with small volumes or for extended time, may result in substantial bead loss to the sides of the feeder tube.The duration of binding time may vary with application.3. Centrifuge the device at 1000 g X 1 min in a swinging bucket rotor. Recover the sample flow-through from the 50 mL collection tube (optional).To ensure maximal protein capture, collect all resin into solution prior to centrifugation.4. Add1.5 mL of Wash Buffer. Centrifuge at 1000 g X 1 min. Recover the wash fraction from the 50mL collection tube (optional).Due to the large capacity of the exchange device, the volume of the wash can be increased for greater sample purity. There is no need for multiple wash steps.Sample ElutionSamples can be eluted without concentration by adding elution buffer and centrifuging (1000g X 2 minute) directly into a clean 50 ml collection tube. Given the limited volume processing capacity of the AU-0.5 device, we recommend this protocol if elution volumes > 1.5 ml are required.For simultaneous elution with concentration, attach the Amicon® Ultra-0.5 device and follow the steps outlined below.1. Remove the exchange device and insert it into the AU0.5 device.2. Place the exchange device/AU-0.5 assembly back in the holder and return the device to thecollection tube.3. Add up to 1.5 mL of Elution Buffer, gently resuspend the resin, and incubate for 5 min.Under standard conditions, one elution is sufficient for recovery of 90-95% of captured protein.4. Close the exchange device cap and screw on the collection tube cap to ensure a proper seal.5. Centrifuge at 4000 g X 15 min in a swinging bucket rotor. Concentrated samples can be bufferexchanged or recovered from the AU-0.5 device by reverse spin (see below).Cat. No. BWEGSDepending on the starting elution volume, NMWL of AU0.5 device employed, and the degree of concentration desired, the length of the spin time can range for 10-30 minutes. Please consult the Performance Characteristics section in the Amicon®Pro Affinity Concentration System User Guide (/psp, and search keywords "Amicon Pro”) for recommended guidelines., consult.6. Recover the concentrated fraction by reverse spin or proceed to Buffer Exchange (see below).Buffer Exchange (Optional if samples have been collected in the Amicon® Ultra-0.5 device)1. After sample concentration, add 1.5ml desired buffer to the exchange device/AU-0.5 assembly.2. Centrifuge device at 4000g X 15 minutes in a swinging bucket rotor. Concentrated samples canbe recovered from the AU-0.5 device by reverse spin (see below).Collect sample from the AU0.5 device by Reverse Spin(following Concentration or Buffer Exchange)1. Disassemble the exchange device/AU-0.5 assembly from the holder tube.2. Using a gentle twisting motion, detach the AU-0.5 from the exchange device.3. If there is residual sample in the exchange device tip, depress the exchange device cap to expelthe remaining sample volume into the AU-0.5.4. Hold AU-0.5 upright and slide the 2 ml collection tube on top of it.5. Invert the assembly and centrifuge (in a microcentrifuge) with a fixed angle rotor 1000g X 2min.Sample protein yield can be determined by Mid IR-based spectrometry using the DirectDetect™ biomolecular quantitation system and DirectDetect™ Assay Free Sample Cards.TroubleshootingCat. No. BWEGSIssue: Recombinant Protein is present in low amount in eluatePossible Cause SolutionProtein is insoluble and may have formed inclusion bodies. After lysate clearance, check both the supernatant and pellet for protein. Perform lysis and binding procedures under denaturing conditions.The GST fusion protein is not in the proper three dimensional conformation. Attempt to reconstitute native protein structure using Protein Refolding Kit (Cat. No. 70532).The GST-tag is not exposed for binding to the affinityresin.The protein may require denaturing conditions for binding.The GST-tag is not present. Sequence the ligation junctions to ensure that the readingframe is correct. Check for possible internal translation starts(N-terminal tag) or premature termination sites (C-terminal tag). Recombinant protein is degraded during cell lysis. Add protease inhibitors during cell lysis.Protein forms aggregates. Add solubilizing agents such as detergents (0.1% Triton® X-100, TWEEN®-20) or increase salt concentration.pH of the Lysis or Binding buffers is incorrect. Check buffer pH; the acceptable range is 7-8. Acidic bufferswill prevent binding.Protein expression is insufficient. Optimize the growth/induction conditions.Cell Lysis is incomplete. Optimize the Cell Lysis Protocol.Cell Lysate is too viscous. If possible, dilute the lysate in Bind Buffer. Alternatively,include Benzonase® Nuclease during lysis to remove freeRNA/DNA.Protein precipitates during sample concentration while using the AU0.5 device due to over-concentration. Reduce the duration of the centrifugation time during the elution/concentration step.Protein is lost during sample concentration while using AU0.5 device. Check the protein's expected size and MWCO of AU0.5 device used. AU0.5 device is offered in 5 different MWCO formats - 3, 10, 30, 50, and 100 kDa.Issue: High Non-specific bindingPossible Cause SolutionInsufficient washing. Increase the volume of the Wash Buffer used or the number ofwash steps. Alternatively, supplement the Bind/Wash Buffers.Contaminants interact directly with the GST fusion protein. Add reducing agents such as DTT or β-mercaptoethanol to reduce disulfide bonds. Add detergents to disrupt non-specific interactions.GST fusion protein is degraded. Degraded/truncated forms of the recombinant protein will stillbind to the GST resin and appear as contaminating bands inSDS-PAGE. Perform a lysis procedure on ice and includeprotease inhibitors.Cell lysate is too concentrated. Dilute the lysate in Bind Buffer before purification.Cat. No. BWEGSCat. No. BWEGSPerformanceProduct Ordering InformationNo Devices Amicon ® Pro + AU 0.5 ml with MWCO: 3k 10k 30k 50k 100k Amicon ® Pro Affinity Concentration Kit - GSTACR5000GS ACK5003GS ACK5010GS ACK5030GS ACK5050GS ACK5100GS Amicon ® Pro AffinityConcentration System 12PKACS500312 ACS501012 ACS503012 ACS505012 ACS510012 Amicon ® Pro AffinityConcentration System 24PK ACS500324 ACS501024 ACS503024 ACS505024 ACS510024The Amicon ® Pro Affinity Concentration Kit contains reagents and devices sufficient for 12 standard reactions. Amicon ® Pro devices are also sold separately in 12 and 24 packs.Description Catalogue Number Qty/Pack GST•Bind™ Resin 70541-3/4/5 10/50/25 mL GST•Bind™ Buffer Kit 70534 1 KitPurification using Amicon Pro Affinity Concentration Kit – GST purifications of a 50 kDa GST-tagged protein the Amicon ® Pro Affinity Concentration Kit numbered lanes are: 2 – flowthrough fraction 3 – wash fraction 4 – eluted fractionNoticeThe information in this document is subject to change without notice and should not be construed as a commitment by EMD Millipore Corporation (“Millipore”) or an affiliate. Neither EMD Millipore nor any of its affiliates assumes responsibility for any errors that may appear in this document. Technical AssistanceFor more information, contact the office nearest you. Up-to-date world-wide contact information is available on our web site at /offices. You can also visit the tech service page on our web site at /techserves.WarrantyEMD Millipore Corporation(“EMD Millipore”) warrants its products will meet their applicable published specifications when used in accordance with their applicable instructions for a period of one year from shipment of the products. EMD MILLIPORE MAKES NO OTHER WARRANTY, EXPRESSED OR IMPLIED. THERE IS NO WARRANTY OF MERCHANTABILITY OR FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. The warranty provided herein and the data, specifications and descriptions of EMD Millipore products appearing in EMD Millipore’s published catalogues and product literature may not be altered except by express written agreement signed by an officer of EMD Millipore. 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EMD MILLIPORE CORPORATION SHALL NOT BE LIABLE FOR CONSEQUENTIAL, INCIDENTAL, SPECIAL OR ANY OTHER DAMAGES RESULTING FROM ECONOMIC LOSS OR PROPERTY DAMAGE SUSTAINED BY ANY COMPANY CUSTOMER FROM THE USE OF ITS PRODUCTS.Unless otherwise stated in our catalog or other company documentation accompanying the product(s), our products are intended for research use only and are not to be used for any other purpose, which includes but is not limited to, unauthorized commercial uses, in vitro diagnostic uses, ex vivo or in vivo therapeutic uses or any type of consumption or application to humans or animals.(c) 2009 - 2012: Merck KGaA, Darmstadt. All rights reserved. No part of these works may be reproduced in any form without permission in writing.Benzonase®, BugBuster®, and Amicon® are registered trademarks of Merck KGaA, Darmstadt, Germany. DirectDetect™ and GST•Bind™ is a trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany. Triton® is a registered trademark of Dow Chemical Company. Tween® is a registered trademark of ICI Americas, Inc.Cat. No. BWEGS。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性检测试剂盒说明书微量法
谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性检测试剂盒说明书微量法谷胱甘肽S-转移酶（GST）活性检测试剂盒说明书微量法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。
货号：BC0355规格：100T/96S产品内容：试剂一：液体100mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体22mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加2mL蒸馏水溶解。
产品说明：GST是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。
GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。
因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。
此外，因为GST具有GSH-Px活性，亦称为non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。
注意，GST催化的反应减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。
GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST 活性。
自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外-可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板和蒸馏水。
操作步骤：一、粗酶液提取：1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。
8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。
GST融合蛋白柱上酶切
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GST融合蛋白柱上酶切
1. 试剂准备
缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH 值至8.0
缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。
因Glutathione 易氧化，需现用现配
2. 层析柱准备
2.1. 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm 的去离子水
2.2. 将GST亲和树脂悬浮，取2ml加入层析柱中，连接上恒流泵
2.3. 用5倍柱体积的缓冲液A进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用
3.柱上酶切
3.1. 裂解菌体，充分离心后收集上清
3.2. 取上清加入层析柱，置于旋转培养器上，室温孵育1h，收集流出液，留样待检
3.4. 用5倍柱体积的缓冲液A进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液，留样待检
3.5. 向层析柱中添加适量3C酶，并添加适量体积的缓冲液A，室温下进行柱上酶切~3h
3.6. 分别收集流穿和3倍柱体积缓冲液B清洗的洗脱产物，SDS-PAGE分析结果
3.7. 取上一步骤得到的流穿于新的GST亲和树脂再次进行GST亲和层析，收集流穿，即为酶切后的目的蛋白组分
3.8. 将纯化过程中得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分等）以及原始样品使用
SDS-PAGE 检测纯化及酶切效果
详细步骤可参照GST亲和层析介质使用说明书。
GST标记蛋白质微量纯化试剂盒使用说明
GST标记蛋白质微量纯化试剂盒编号名称北京华越洋生物GT172 GST标记蛋白质微量纯化试剂盒GST标记蛋白质微量纯化试剂盒简介：重组蛋白N 端的GST 谷胱甘肽S 转移酶（Glutathione S Transferase）能提高重组蛋白的水溶性，所以常用于蛋白质重组表达。
GST-谷胱甘肽亲和层析是利用GST 标记的蛋白能与谷胱甘肽层析介质结合，并能被还原型谷胱甘肽洗脱的特点而建立，是目前分离纯化GST 标记蛋白质的重要方法。
GST标记蛋白质微量纯化试剂盒规格：成分规格20T 保存条件谷胱甘肽-Agarose 介质，50% 4 ml 4℃10×PBS 缓冲液100 ml RTGST 洗脱缓冲液成分一25 ml RTGST 洗脱缓冲液成分二约80 mg 4℃溶菌酶（20 KU/mg）30 mg -20℃Benzonase（2U/ul）20 ul -20℃PMSF（10 mg/ml）0.5 ml RT6 mL 层析柱(带筛板) 1 套RTGST标记蛋白质微量纯化试剂盒使用方法：注意：1. 每步得到的样品最好都留存少量作为SDS-PAGE 分析的对照，在下面描述中就不再提醒。
2. GST标记蛋白质微量纯化试剂盒实验需要用到的1×PBS 缓冲液可用自备的超纯水稀释本试剂盒提供10×PBS 缓冲液而得。
PBS 缓冲液用超纯水稀释后极其容易长细菌，注意防止污染。
3. GST 洗脱液的配制方法是将约80mg GST 洗脱液成分二干粉全部加入到GST 洗脱液成分一溶液中，摇晃直到干粉全部溶解即得GST 洗脱液，分装成小份放-20℃保存，每次用一管。
一:重组蛋白的表达和细菌收集1. 37℃振荡培养20 mL含表达质粒的细菌到OD600=0.6-0.8。
2. 加IPTG 到终浓度为0.1 mM，30℃振荡培养3 小时或22℃振荡培养8 小时（或过夜）。
3. 4℃ 5000 g 离心10 分钟收集20 mL表达菌液，弃上清。
GST蛋白纯化试剂盒说明书及操作指南
GST蛋白纯化试剂盒说明书及操作指南GST蛋白纯化试剂盒是一种常用的实验工具，用于从细胞裂解液中高效纯化谷胱甘肽S转移酶（GST）标签融合蛋白。
下面将详细介绍试剂盒的组成、使用步骤以及注意事项，以帮助用户顺利进行GST蛋白纯化实验。
一、试剂盒组成蛋白纯化试剂盒由以下几个主要组分组成：1、离心管：提供用于样品处理和离心过程的离心管。
2、细胞裂解缓冲液：含有适量的洗脱缓冲液和辅助物质，在细胞裂解过程中保护目标蛋白的完整性。
3、离心管悬浮粉末：用于牢固固定GST亲和树脂。
4、清洗缓冲液：用于去除非特异性结合物质，保证目标蛋白的纯度。
5、洗脱缓冲液：用于洗脱目标蛋白，使其从GST亲和树脂上解离。
二、操作步骤以下是使用GST蛋白纯化试剂盒进行GST蛋白纯化的基本步骤：1、细胞裂解：将经过表达的GST标签融合蛋白的细胞用细胞裂解缓冲液裂解，并加入适量的离心管悬浮粉末。
轻轻摇晃或旋转离心管，使粉末均匀分布。
2、离心：将裂解液转移至离心管中，并以适当的速度离心使GST亲和树脂沉淀到离心管底部。
3、除去上清：谨慎倒出上清液，避免破坏沉积的GST亲和树脂。
4、清洗：加入适量的清洗缓冲液，轻轻摇晃离心管，使清洗缓冲液与GST 亲和树脂充分接触，去除非特异性结合物质。
重复此步骤两次以确保清洗。
5、洗脱：加入适量的洗脱缓冲液，轻轻摇晃或旋转离心管，使目标蛋白从GST亲和树脂上洗脱。
6、收集洗脱液：将洗脱液收集于新的离心管中，这样就得到了纯化的GST 标签融合蛋白。
三、注意事项在使用蛋白纯化试剂盒过程中，请注意以下几点：1、严格按照说明书中的步骤进行操作，避免操作失误导致结果不准确。
2、所有悬浮粉末和缓冲液应按照说明书中的要求储存，并避免暴露在高温、阳光直射或湿度过高的环境中。
3、使用前请检查试剂盒是否有损坏或过期，如有问题请勿使用。
4、操作过程中请佩戴适当的实验防护设备，避免对自己和他人造成伤害。
准确使用GST蛋白纯化试剂盒可以高效地纯化目标蛋白，为科研工作者提供了一个有效的实验工具。
GST说明 (2)
GST RESIN(4FF)说明
总的蛋白结合能力约为每毫升填料结合10mg标签蛋白
建议的流速** 上样＜1ml/min
介质的清洁
当沉淀物，变性的及非特异性吸附的蛋白累积时，介质的结合能力会下降。
y去除沉淀物及变性蛋白：2倍体积的6M盐酸胍洗涤，然后快速用5倍体积pH7.3，PBS 洗涤。
y去除疏水性结合的蛋白：用3-4倍体积的70%乙醇或2倍体积的1%Triton X-100洗涤，然后快速用5倍体积pH7.3，PBS洗涤。
如果需要去除GST部分（天然蛋白分子量为26KD），当蛋白吸附在柱上，或在洗脱后用位点专一的蛋白酶消化，选用前种方法，可减少额外分离目的蛋白与GST步骤，消化后，目的蛋白直接用结合液洗脱即可。
GST亲和层析介质使用说明书
GST亲和层析介质使用说明书一、简介GST亲和层析介质(GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和,可以保证蛋白的活性.本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶,具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大,是研发与生产的理想选择.二、性能参数三、适用范围分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。
四、操作说明1。
缓冲液配制缓冲液A(平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl,调节pH值至8。
0.缓冲液B（洗脱缓冲液)：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。
因Glutathione易氧化，需现用现配。
（注:各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用).2. 样品预处理：按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体;600w功率,每循环超声3s，冷却3s，循环99×3次,破碎菌体；4℃、15000rpm离心15m,收集上清液,或用0。
45μm滤膜过滤。
3。
装柱:聚苯乙烯层析柱1）将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下,小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡.2）打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质,或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降.3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面,使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡(如对实验结果要求不严，也可不放入上垫片,以提高流速)。
new实验七GST酶亲和层析及SDS-PAGE
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Biochemistry Experiment 7
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c. d.
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样品
杂质
与待分离物质 专一可逆结合 的物质
Biochemistry Experimቤተ መጻሕፍቲ ባይዱnt 7
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亲和层析 的示意图
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Biochemistry Experiment 7
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GST酶的亲和层析
别 的分子 3.电荷性质、分子量大小相近，但构型不同
不连续凝胶电泳洗脱 碱性不连续－分离酸性样品 酸性不连续－分离碱性样品
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Biochemistry Experiment 7
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① 浓缩效应
1.缓冲液与凝胶的离子成分和 pH值不同。Cl-，Gly-，蛋白 质离子。快慢离子迁移快慢 的差别造成电场强度与电导 率的变化。低导电区和高导 电区。蛋白质样品迁移率在 快慢离子之间，压缩聚集成 一条窄带。
单体丙烯酰胺Acr
交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis
化学聚合
光聚合
引发剂 加速剂
（NH4)2S2O8 TEMED
（NH4)2S2O8 DMAPN
核黄素 TEMED
注： （NH4)2S2O8
过硫酸胺在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递， 使丙烯酰胺 成为自由基，发动聚合反应
TEMED DMAPN
⑷ 在收集的珠子中加入20μl GSH溶液悬浮珠子（注意不要颠倒Ep管，以免珠 子粘在管壁上），室温反应5min后，10000g离心1min后收集上清溶液（即 纯化的GST蛋白）至一新Ep管中。（回收含有珠子的Ep管）
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Biochemistry Experiment 7
GST resin产品使用说明书
GST•Bind™树脂
GST•Bind™树脂用于一步法亲和层析纯化融合表达谷胱甘肽S转移酶（GST）的目的蛋白或天然GST或 谷胱甘肽结合蛋白，操作方便快捷。GST•Tag™融合表达蛋白带有220个氨基酸的GST标签（如表达自 Novagen的编号为pET-41，-42，或-49的载体的蛋白），能够用GST树脂非常方便地得到干净一致的纯 化蛋白。采用10mM还原型谷胱甘肽的温和洗脱，也使目的蛋白的活性受到了很好的保护。GST•Bind树 脂采用11个原子的间隔臂（约16 Å），通过硫键共价结合还原型谷胱甘肽。这种特别设计的树脂使纯化 效率得到提高，因此Novagen的GST树脂载量达到每ml树脂结合载量为5–8mg目的蛋白。
默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@
5. 将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上 样于Novagen的纯化树脂（以及其它很多类似纯化系统）。蛋白溶液 在冰上可以短时存放（2-3小时），也可在-20℃长时间存放直至下步 分析。蛋白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋 白经冻融会失活。
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GST亲和层析介质使用说明书
一、简介
GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。
本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。
二、性能参数
三、适用范围
分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。
四、操作说明
1. 缓冲液配制
缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH值至8.0。
缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。
因Glutathione易氧化，需现用现配。
（注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用)。
2. 样品预处理：
按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w功率，每循环超声3s，冷却3s，循环99×3次,破碎菌体；4℃、15000rpm离心15m，收集上清液，或用0.45μm滤膜过滤。
3. 装柱：
聚苯乙烯层析柱
1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。
2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验结果要求不严，也可不放入上垫片，以提高流速）。
4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述
玻璃层析柱
1) 将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。
2) 先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。
4) 在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。
4. 过柱：
1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质；
2) 上样；
3) 用5~10倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质；
4) 用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液；
5) 用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。
注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。
5. 介质清洗
如果在使用一段时间后，介质因表面沉积过多杂质导致蛋白结合能力下降，需对介质进行清洗。
步骤如下：
1) 沉淀或变性物质的清洗：
用2倍介质体积6 M盐酸胍清洗，然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。
2) 疏水缔合物质的清洗：
用3~4倍介质体积70%乙醇(或2倍介质体积去垢剂，如1% Triton™ X-100) 清洗介质；然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。
6. 介质再生
每次层析前，为达到最佳纯化效果，需对介质进行再生，步骤如下：
1) 2倍介质体积高pH缓冲液（0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH8.5）和低pH缓冲液（0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5）交替洗脱三次。
2) 10倍介质体积缓冲液A平衡介质。
7. SDS-PAGE检测：
1) 不同浓度SDS-PAGE分离胶分离范围
2) SDS-PAGE操作流程
A. 每个胶孔最适蛋白上样量为5~10μg。
B. 将含5~10μg蛋白的样品溶液与loading buffer混匀，90℃孵育5min，取出后5000rpm离心1 min。
C. 上样，15mA、30mA恒流或80V、120V恒压电泳。
8.介质保存
4℃~8℃条件下，介质可长期保存于20%乙醇中。
五、GST Agarose分离GST融合蛋白实例
层析介质：GST 1ml；对照GST介质（国际领先品牌）1ml
样品：表达可溶性GST-tag融合thioredoxin的大肠杆菌BL21裂解液
结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0
洗脱缓冲液：10 mM Glutathione（还原型）, 50 mM Tris-HCl, pH8.0
流速：GST 1ml，0.5ml/min；对照GST介质1ml，0.5ml/min
实验结果：
色谱分析结果见图1，色谱各组分的SDS-PAGE结果见图2。
图1 GST Agarose分离GST融合蛋白色谱图
1.低分子量Marker；
2.上样液；
3.GST-流穿液；
4.GST-洗脱液；
5.对照-流穿液；
6.对照-洗脱液
1 2 3 4 5 6
图2 纯化后SDS-PAGE图
六、GST亲和层析介质使用注意事项
1. GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间，因而在上样时要维持较低流速。
在样品中加入5~10mM DTT可以增加介质对目标蛋白的吸附。
对于按常规步骤操作吸附效果不好的样品，可以先把介质和样品混合，轻轻振摇2~4h，再装柱，用平衡缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作。
2. 不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。
必要时需对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。
3.GST融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。
纯化效果取决于复性效率。
4.纯化后出现杂带的常见原因
1) 目标蛋白断裂或酶解
解决方案：向缓冲液A和缓冲液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1％TritonX-100或0.1％Tween-20等稳定剂。
2) GST融合蛋白不完全表达
GST融合蛋白有时候只表达到GST部分就终止，GST标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与介质结合并被洗脱下来，因而洗脱液中出现26KD左右的杂带。
解决方案：尝试用不同浓度的还原型谷胱甘肽洗脱；优化表达条件，降低GST融合蛋白不完全表达量；改变外源基因在载体中插入的酶切位点，重新构建表达载体；在不改变外源基因两端酶切位点的情况下，更换通用载体。
5.如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘肽，可采用超滤或透析的方法。
七、GST标签切除
GST标签可用位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子从融合蛋白中切除。
蛋白酶解后，再用GST亲和层析方法去除GST 标签，目标蛋白存在于流出液中。
一般情况下，与切除GST标签后得到的外源蛋白相比，凝血酶用量极小，如果后续实验要求不严格，不需进一步除去与外源蛋白共存与洗脱液中的凝血酶。
如需除去凝血酶，则可将样品用pH7~8的缓冲液溶解，然后直接过1ml的苯甲脒琼脂糖凝胶或者肝素琼脂糖凝胶吸附凝血酶。