实验 亲和层析纯化IgG教学内容
实验八亲和层析分离纯化蛋白质
3．制作5.0%浓缩胶
按照下表配好浓缩胶，轻轻混匀，灌胶 2ml，插入梳子，聚合15 min。
试剂名称 蒸馏水
30%丙烯酰胺（29:1） 1M Tris-HCl（pH6.8）
10%SDS 四甲基乙二铵（TEMED）
10%过硫酸铵（AP） 总体积
5.0% 1.7 ml 430 ul 310 ul 25 ul 10 ul 25 ul 2.5 ml
• 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在 15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈 线性关系：log MW = K - bm
浓缩胶
• 浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场 中的迁移速度：Cl->蛋白质>Gly-。
• 电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形 成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋 白质加速移动。
亲 和 层 析 原 理
GST亲合层析
• 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱 甘肽GSH特异结合）
• GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上， （Sepharose 4B）
• GST融合目标蛋白 • 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 • 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白
GSH- Sepharose 4B
9．染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液 脱色。（或用蒸馏水加热脱色）
pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化
非诱导 诱导 纯化1 纯化2 Marker
100KD 75KD
50KD
32KD
25KD
37℃，OD=0.8， 0.5mmol/L，IPTG， 28 ℃，200rpm，6h
15KD
SDS-PAGE样品制备
4．把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液， 拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。
纯化及鉴定实验报告
纯化及鉴定实验报告
1. 实验目的
本实验旨在提取、纯化和鉴定人类血浆中的抗体IgG。
2. 实验步骤
1. 血浆样本制备：
- 收集人类血浆样本，并离心去除细胞成分。
2. 抗体IgG的提取：
- 使用亲和层析技术，将血浆样本加入与IgG特异性结合的柱中，洗脱非特异性蛋白质。
3. 抗体IgG的纯化：
- 将柱中特异性结合的IgG洗脱并收集。
4. 抗体IgG的鉴定：
- 使用免疫学技术（如ELISA或免疫印迹），检测提取的IgG 的纯度和特异性。
3. 实验结果
经过上述步骤，实验成功提取和纯化了人类血浆中的抗体IgG。
通过免疫学技术的鉴定，确定提取得到的IgG具有较高的纯度和特
异性。
具体的实验结果表明人类血浆中存在丰富的抗体IgG。
4. 结论
本实验成功地提取、纯化和鉴定了人类血浆中的抗体IgG。
这
对于进一步研究和应用抗体在医学和生物学领域具有重要意义。
5. 讨论和展望
本实验采用了亲和层析技术和免疫学技术，成功实现了对人类
血浆中抗体IgG的提取、纯化和鉴定。
然而，未来的研究可以探索
更有效的提取和纯化方法，以及进一步验证抗体的功能和应用，扩
展该实验研究的深度和广度。
参考文献
[1] 张三, 李四. 血浆抗体IgG的提取与纯化[J]. 实验生物学杂志, 20XX, XX(X): 123-456.。
纯化抗体IgG使用说明
纯化抗体IgG使用说明
Purification Antibody
规格：1mg/5mg/10mg
保存-20℃保存，有效期一年以上
产品说明:
纯化抗体IgG采用Protein A/G亲和层析纯化，制成高纯度（﹥95%）和高活性的纯化羊或兔IgG抗体。
纯化抗体IgG为PBS溶液，可根据用户要求，配成不同浓度，用前最好-20℃存放，可根据使用方法采用不同浓度稀释。
通常不同使用目的可分别用下列缓冲液稀释，注意完全溶解后充分混匀。
冻存过久会产生少量聚合体，用前最好低温高速离心，去除冷聚合球蛋白及变性蛋白后重新定量。
抗体标记：500ug～20mg/ml，ELISA包板：10～20ug/ml，层析金条对照线：2mg/ml等。
胶体金标记：用pH9.0硼酸缓冲液稀释。
HRP标记：用0.01mol/L pH9.0CB或用包被液CB稀释。
荧光素标记：用0.5mol/L pH9.5CB（碳酸盐缓冲液）稀释。
生物素标记：用0.1mol/L NaHCO3稀释。
其它方法：如免疫扩散可用0.01mol/L pH7.2PBS稀释。
浓度：
一般情况10mg/ml，具体信息见标签。
相关试剂：
SP034兔IgG免疫球蛋白抗原
SA134羊抗兔IgG(免疫血清)
SF134羊抗兔IgG-FITC
SE237兔抗猪IgG-HRP
A1820HRP标记的抗体稀释液。
亲和层析纯化
亲和层析纯化亲和层析纯化是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，它基于目标分子与特定配体之间的亲和作用，通过选择性地捕获、洗脱和回收目标分子。
本文将从亲和层析纯化的原理、步骤和应用方面进行阐述。
一、亲和层析纯化的原理亲和层析纯化是基于生物大分子之间特异的相互作用原理进行的。
在该方法中，目标分子与具有亲和性的配体发生结合，形成稳定的复合物。
这种特异的结合使得目标分子能够在混合溶液中被选择性地捕获和富集。
亲和作用可以是多种形式，如氢键、离子键、疏水作用等。
根据目标分子和配体之间的亲和性，可以选择不同类型的亲和层析介质，例如亲和树脂、亲和膜等。
亲和层析纯化通常包括以下几个步骤：样品预处理、柱填充与平衡、样品加载、洗脱和目标分子回收。
1. 样品预处理：首先需要将样品进行预处理，如细胞破碎、蛋白质去除等，以获得目标分子的纯化样品。
2. 柱填充与平衡：将选择的亲和层析介质填充到柱子中，并通过流动缓冲液进行平衡，使介质充分湿润。
3. 样品加载：将样品加入到柱子中，目标分子与配体发生亲和结合，被捕获在柱子内。
4. 洗脱：通过改变流动缓冲液的组成、pH值或离子强度等条件，使非特异性结合的杂质分子被洗脱，而目标分子仍保持与配体的结合。
5. 目标分子回收：通过改变条件，使目标分子与配体的结合解除，从而使目标分子得以回收。
这可以通过改变pH、离子强度、温度等来实现。
三、亲和层析纯化的应用亲和层析纯化在生物技术、生物医药等领域得到了广泛应用。
1. 蛋白质纯化：亲和层析纯化可用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白质。
例如，通过选择性地捕获具有特定亲和性的标签蛋白质，如His标签、GST标签等，实现目标蛋白质的高效纯化。
2. 抗体纯化：亲和层析纯化也被广泛用于抗体的纯化。
通过使用抗体与特定抗原之间的亲和作用，可以高效地纯化特定抗体。
3. 生物药物纯化：亲和层析纯化在生物药物制造中起着重要的作用。
通过选择性地捕获和富集目标生物药物，可以实现高纯度和高产量的生物药物生产。
实验 亲和层析纯化IgG PPT课件
实验步骤
1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出 速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲 液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。 4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
下面开始实验！
2.5ml
2.5ml
2.5 ml
4 ml
2.5ml
3.3 ml
10% SDS 100 μl
100 μl
100 μl
TEMED 10% AP
10 μl 10 μl 10 μl
100 μl 100 μl 100 μl
四、实验步骤
2.SDS-PAGE 纯度测定
3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右， 之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速， 催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注 胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为 了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是 胶与水层之间形成清晰的界面。
特异性
许多IgGs 的Fc 片断 许多IgGs 的Fc 片断 特异的抗体 特异免疫球蛋白
IgG的分离
3. DEAE纤维素离子交换层析步骤
(1) 装柱：取层析柱固定于支架上，关紧下端出口， 将处理好的DEAE纤维素搅拌后均匀装入柱内，柱 高约10cm；
(2) 平衡：打开下端出口， 0.0175M pbs (pH6.3) 平衡， 使DEAE纤维素分布均匀后关闭下端出口；
• DEAE-纤维素层析 (磺柳酸试剂检查蛋白质）（样C）
A、B、C样品 • 醋酸纤维薄膜电泳（鉴定γ-球蛋白的纯度）
1. 盐析实验操作步骤
留取血清2滴电泳用(A液). (1) 取血清2ml+生理盐水2ml ， (2) 取4ml饱和(NH４)２SO４溶液缓慢滴入，边加边摇。
饱和度33%-50%时，球蛋白析出；饱和度大于50%时，白蛋白析出。
固定相中溶质浓度 K= 流动相中溶质的浓度
K与溶质和溶剂的性质有关
固定相：多孔性固体支持物（滤纸、硅藻土、纤维 素等）吸附一种溶剂。 流动相：与固定相溶剂不溶的溶剂。
• 离子交换层析
是利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的 的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂：是含有可解离的阳离子或阴离子基团不 溶性高分子化合物，这些基团能与溶液中的其它阳离 子或阴离子进行可逆的交换。
阴离子交换剂中含有的碱性基团，能释放出阴离 子，与样品溶液中的阴离子进行交换。
强碱型阴离子交换剂：季胺 [R-N+(CH3)3-OH-]
弱碱型阴离子交换剂：伯胺 (R-N+HH2-OH-)
仲胺 (R-N+HCH3H-OH-)
基架
+ +
OHOH-
叔胺 活性基团
亲和层析法离纯化蛋白质的方法
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
IgG纯化指南
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
欧蒙抗核抗体谱(IgG)检测标准操作规程
抗核抗体谱(IgG)检测标准操作规程1.目的规范抗核抗体谱(IgG)检测，保证结果的准确性。
2.适用范围检验科免疫组工作人员。
3.试剂规格名称与组成型号名称：ANA 谱 1靶抗原：nRNP/Sm，Sm，SS-A，Ro-52，SS-B，Scl-70，Jo-1，CENP B，dsDNA，核小体，组蛋白，核糖体 P 蛋白类型：IgG基质：抗原包被的检测膜条规格：16×01(16)4.预期用途：用于体外定性检测人血清或血浆中的抗 nRNP、Sm、SS-A（天然 SS-A 和 Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P 蛋白和 AMA M2 共 14 种不同抗原 IgG 类抗体。
5.适应症：夏普综合征（MCTD），系统性红斑狼疮（SLE），干燥综合征，进行性系统性硬化症，多肌炎皮肌炎、重叠综合征、局限型进行性系统性硬化症（CREST 综合征），原发性胆汁性肝硬化。
6.临床意义：抗核抗体识别是各种细胞核组分（细胞核的生化成份）[1,2]，包含核酸、细胞核蛋白及核糖蛋白。
可特征性地出现于许多疾病中，尤其是风湿性疾病[3,4,5]。
在炎症性风湿性疾病中，这些抗核抗体的阳性率在 20%到 100%之间，以风湿性关节炎的阳性率最低，在 20%至40%之间。
因此，ANA 鉴别诊断在对个别风湿疾病的确认十分必要，而且对自身免疫性疾病的进一步诊断也很有价值。
[3,6,7,8,9,10,11]风湿疾病—夏普综合征（混合结缔组织病＝MCTD)[8]—系统性红斑狼疮（SLE)[8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]—干燥综合征（原发性干燥综合征）[5],—系统性硬化症（系统性硬皮病,SSc)[1, 23],—局限型系统性硬化症（CREST 综合征） [28]—多肌炎/皮肌炎[12,15]—类风湿性关节炎[5]7.主要组成成分：8.储存条件及有效期： 2-8°C 保存，不要冷冻。
IgG片段纯化的实验方法
IgG片段纯化的实验方法制备IgG的片段，Fab和Fc二、材料检测仪，记录仪，沉析柱，Sephadex G-100,木瓜酶, PH7.0,0.1M的PB缓冲液（含有0.01mol/L半胱氨酸、2mmol的EDTA），PH4.6，0.01M乙酸盐缓冲液, PH4.6，0.2、0.5、0.8M乙酸盐缓冲液，0.075M、PH7.0、含0.075M氯化钠PB缓冲液三、操作步骤1、木瓜酶对IgG的裂解木瓜酶，分子量为21KD，为SH-基蛋白酶，在半胱氨酸存在时才显示活性，水溶液PH为5.2-5.8，最适PH为6.5，无激活剂在水中失活很快，在75℃，PH7.2时，活力降低一半用的时间为56分钟.激活剂有：0.5%焦亚硫酸钠，2.0%半胱氨酸盐酸盐，0.1%EDTA钠盐. 抑制剂有：抑没酶醛肽，胱蛋白酶抑制剂等. 将1毫克的木瓜酶溶解在0.1M的PB缓冲液，立即将酶液加入IgG中，温和混匀37℃反应过夜（16H）2、酶解液的初步纯化（凝胶过滤层析）（一）选用葡聚糖凝胶G-100过滤。
（二）将葡聚糖凝胶G-100在蒸馏水中泡胀24小时，或100度水浴煮胀2小时，倾去上层漂浮颗粒。
（三）用0.075M、PH7.0、含0.075M氯化钠PB缓冲液平衡，然后装柱.（四）选择合适层析柱，样品浓度10-20毫克每毫升为宜，样品体积应为柱床体积的5%左右，但不能少于柱床体积的2%。
（五）以0.5ml/min流速收集。
（六）在洗脱峰中，若IgG未完全裂解，则可洗脱三个峰，第一峰是未消化的IgG，第二峰为Fc和Fab的混合物，第三峰为小分子肽；.若IgG完全裂解，则只有两个峰了.当然，第一峰为Fc和Fab的混合物，且峰最大。
（七）收集峰值，浓缩。
3、离子交换层析（一）凝胶选择：选用强阳离子葡聚糖凝胶。
（二）凝胶预处理：用0.2M NaOH洗，过量的碱用水反复洗涤除去，然后用0.2M HCL洗，过量的酸用水反复洗涤除去。
（三）平衡：用PH4.6，0.01M乙酸盐缓冲液为初始缓冲液平衡。
血清IgG的分离纯化及测定
SPA-sepharose亲合层析法
• protein A上柱
•
• •
血清与protein A结合
清洗掉杂蛋白 洗脱下所需IgG
IgG浓度测定
• 物理性质：紫外分光光度法 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法 (Folin-酚法)， BCA法，胶体金法 染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法 其他性质：荧光法Βιβλιοθήκη 体分离多抗纯化方法有很多种：
• • • • • 盐析法 辛酸-硫酸铵沉淀 冷酒精沉淀 离子交换层析 Protein A,G亲和层析
盐析法
• 蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分 子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的 水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质 溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电 荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，导 致蛋白质分子之间聚集而沉淀。
1000—10000 540 20—500 750 595
考马氏亮蓝G-250 50—500
BCA
20—200
562
紫外吸收法测蛋白质含量
• 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm处具有最大吸收量，且各种蛋白质的这三 种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液 在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
• 葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG 分子fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力 有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPAsepharose 柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯 化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
SPA-sepharose亲合层析法
• • • • • Protein A — 葡萄球菌A蛋白 Buffer A — PH8.6 磷酸盐缓冲液 Buffer B1 — PH5.5 枸橼酸缓冲液 Buffer B2 — PH4.0 枸橼酸缓冲液 Buffer C — PH8.6 Tris缓冲液
血浆IgG的分离_纯化及鉴定实验报告
血浆IgG的分离，纯化及鉴定实验报告一、实验目的掌握盐析法的原理及盐析法分离制备血浆IgG的基本过程。
二、实验原理1.血浆IgG是免疫球蛋白（简称Ig）的主要成分之一，相对分子质量为15~16万。
要从身姿中分离出血浆IgG，首先要尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使血浆IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得血浆IgG。
2.盐析法是粗分离蛋白质的重要方法，许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶液度低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象为盐溶。
而当盐浓度继续继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为盐析。
这现象的原理大致是由于蛋白质带有羟基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证了蛋白质不溶于水，当加入少量盐后，破坏水膜结构，增多了蛋白质的极性基团，蛋白质的溶解度增大，出现盐溶的现象，另一方面加入的盐离子中和蛋白质表面电荷，蛋白质分子相互蛋白质混合溶液中的各个成分分步盐析出来，达到分离目的蛋白质。
3.用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般饱和度来表示。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度为100%或1。
盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1的百分之几。
即称为该蛋白质盐析的饱和度。
4.饱和度可以用饱和硫酸铵溶液法计算：在蛋白质要求达到50%以下时采用：V＝V0*（C2－C1）/（1－C2）V0－－蛋白质溶液的原始体积C1－－所要达到硫酸铵饱和度C2－－原来溶液的硫酸铵饱和度三、试剂与仪器饱和硫酸铵溶液，0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，0.0175mol/L,PH6.7的磷酸盐缓冲溶液四、实验步骤1.取1支离心管，向其中加入5ml血浆和5ml0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，混合。
向其中加入2.5ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为20%（加入过滴加边搅拌），加完后，应在4度放置15min，使之充分盐析，然后以3000r/min离心10min，弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白）2.量取10ml清液体积，置于另一离心管，用滴管加入6ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度达到50%，加完后，4度放置15min，以3000r/min离心10min，弃去溶液，留下沉淀。
igg分离纯化和鉴定
igg分离纯化和鉴定分离纯化和鉴定是在生物技术领域中常用的实验技术，用于提取目标物质并确定其纯度和特性。
下面以IGG为例，介绍分离纯化和鉴定的步骤和方法。
分离纯化IGG的第一步是蛋白质提取。
可以选择适当的提取缓冲液，将IGG所在的样品（如血浆或细胞培养液）与提取缓冲液进行适当的混合，使细胞或组织中的蛋白质释放出来。
提取后，可以使用离心等方法去除杂质。
将混合物进行离心，使得IGG和其他蛋白质分离。
离心后，可以将上清液取出，其中含有较高纯度的IGG。
为了进一步提高IGG的纯度，可以使用亲和层析等技术。
亲和层析是利用IGG与特定配体之间的亲和力进行分离的方法。
可以将配体固定在柱子上，然后将提取的上清液通过柱子，IGG会与配体结合，其他蛋白质则流过。
最后，通过改变柱子的条件，如改变pH值或添加特定溶剂，可以使IGG与配体解离，从而获得纯净的IGG。
获得纯净的IGG后，需要对其进行鉴定。
常用的鉴定方法包括SDS-PAGE和Western blotting。
SDS-PAGE可以将蛋白质按照分子量分离出来，可以通过与已知分子量的标准蛋白进行比较，确定IGG的分子量。
Western blotting则可以通过与特异性抗体的结合来确认IGG的存在。
除了分子量和存在性，还可以使用其他方法对IGG进行鉴定，如免疫荧光和ELISA等。
免疫荧光可以通过特异性抗体与IGG结合后的荧光信号来检测IGG的存在。
ELISA可以通过与特异性抗体的结合来定量IGG的含量。
总的来说，分离纯化和鉴定IGG是一个复杂的过程，需要使用多种技术和方法。
通过合理的实验设计和操作，可以获得高纯度的IGG，并对其进行准确的鉴定。
这些技术的应用不仅可以用于IGG的分离纯化和鉴定，还可以应用于其他蛋白质的研究和应用中。
实训 血浆中IgG的分离纯化
实训血浆中IgG的分离纯化［任务描述］IgG是免疫球蛋白（简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万～16万。
IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG 在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，是利用各种蛋白质所带电荷不同、相对分子质量不同，致使在高浓度的盐溶液中溶解度就不同，因此一个含有几种蛋白质的混合液，就可用不同浓度的中性盐来使其中各种蛋白质先后分别沉析下来，达到分离纯化的目的，这种方法称为分级盐析。
其中最常用的盐析剂是硫酸铵，本实训任务利用硫酸铵饱和溶液沉淀并分离目的蛋白质。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集硫酸铵盐析血浆中的IgG工作中的必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备新鲜动物血清（2）试剂饱和硫酸铵溶液：取化学纯（NH4）2SO4800g，加蒸馏水1000ml，不断搅拌下加热至50～60℃，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100％饱和度，使用时用浓NH4OH调至PH7.0。
0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）其配制方法如下：①配A液：0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液（称取磷酸氢二钠5.37g加去离子水定容至100mL）②配B液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液（称取磷酸二氢钠3.12g加去离子水定容至100mL）③取A液约72mL，取B液约28mL，然后将这两种溶液边混合边用高精度pH试纸检测，调配成约100mL浓度为0.2mol/L pH7.2的磷酸盐缓冲液备用。
（3）器具离心机、烧杯（500mL和250mL）、高精度pH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
免疫学实验指导解析
实验一免疫球蛋白的粗提（盐析法）一、实验目的1、学习免疫球蛋白的粗提方法2、实践IgG分离纯化过程3、了解分离纯化抗体的原理二、实验原理随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。
纯化的方法很多，有单一法，常用盐析法、凝胶柱层析、离子交换剂层析以及免疫亲和层析等技术对血清抗体进行分离纯化。
但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过透析或层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。
硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。
不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。
盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。
水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础，在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（NH4）2SO4或Na2SO4盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随之降低。
蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。
33% （NH4）2SO4为沉淀IgG的最适饱和度。
二、实验材料与试剂配制1．人全血清（购买商品）2．硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH 调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3．0.01Mol/L pH7.4 PBS液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至 1 000mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至 1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。
亲和层析教案
亲和层析教案教案标题：亲和层析教案教案目标：1. 学生能够理解和运用亲和层析的基本概念和原理。
2. 学生能够分析和解释亲和层析在实际应用中的作用和意义。
3. 学生能够设计和执行简单的亲和层析实验。
教学重点：1. 亲和层析的定义和基本原理。
2. 亲和层析在生物技术领域中的应用。
3. 亲和层析实验的设计和操作。
教学难点：1. 学生理解亲和层析的原理和应用。
2. 学生能够独立设计和执行亲和层析实验。
教学准备：1. PowerPoint演示文稿。
2. 实验材料和设备：亲和层析柱、蛋白质样品、缓冲液、洗脱液等。
3. 实验操作指导手册。
教学过程：引入：1. 使用具有吸引力的图片或视频，引起学生对亲和层析的兴趣。
2. 提出问题：你知道亲和层析是什么吗？它有什么应用？讲解亲和层析的基本概念和原理：1. 通过PPT演示，简要介绍亲和层析的定义和基本原理。
2. 强调亲和层析与其他层析技术的区别和优势。
探讨亲和层析在生物技术领域中的应用：1. 分组讨论：学生分成小组，讨论亲和层析在生物技术领域中的应用案例，并分享他们的发现。
2. 小组展示：每个小组选择一个应用案例进行展示，并讨论其优势和局限性。
设计和执行亲和层析实验：1. 学生分组，每个小组设计一个简单的亲和层析实验。
2. 指导学生选择合适的亲和层析柱和蛋白质样品，并准备实验所需的缓冲液和洗脱液。
3. 学生按照实验操作指导手册的步骤进行实验，并记录实验结果。
4. 学生讨论实验结果，并总结实验中遇到的问题和解决方法。
总结和评价：1. 学生回顾本节课所学内容，总结亲和层析的基本概念和原理。
2. 学生分享自己在实验中的体验和收获。
3. 教师对学生的实验设计和操作进行评价，并提供反馈和建议。
拓展活动：1. 鼓励学生进一步了解亲和层析的前沿研究和应用。
2. 布置亲和层析相关的作业或项目，以加深学生对该主题的理解和应用能力。
教学延伸：1. 教师可以邀请相关领域的专家进行讲座，深入探讨亲和层析的应用前景。
纯化及鉴定实验报告
纯化及鉴定实验报告简介本实验旨在提取、纯化和鉴定血浆中的免疫球蛋白G（IgG）。
IgG是一种重要的抗体，在免疫反应中起到关键作用。
本实验使用了以下步骤进行提取、纯化和鉴定。
材料和方法1. 血浆样品：收集来源于健康志愿者的血浆样品。
2. 蛋白A亲和树脂：用于IgG的亲和层析纯化。
3. 层析缓冲液：用于洗脱和纯化IgG的缓冲液。
4. SDS-PAGE凝胶：用于鉴定IgG的纯度和分子量。
5. Coomassie Blue染色液：用于染色分析。
提取和纯化步骤1. 加入血浆样品到蛋白A亲和树脂柱，并进行洗涤以去除非特异性结合物。
2. 用层析缓冲液洗脱IgG，并收集纯化的IgG溶液。
3. 确定纯化的IgG样品的浓度。
鉴定步骤1. 将纯化的IgG样品加载到SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。
2. 可选择使用Western blot方法进一步确认IgG的特异性。
3. 使用Coomassie Blue染色液染色，观察IgG在凝胶中的迁移情况并分析纯度。
4. 使用分子量标准品确定纯化的IgG的分子量。
结果根据本实验的步骤和方法，成功提取、纯化并鉴定了血浆中的免疫球蛋白G。
讨论本实验采用蛋白A亲和层析的方法提取和纯化血浆中的IgG。
结果表明提取纯化后的IgG具有一定的纯度，符合实验要求。
通过SDS-PAGE凝胶和Coomassie Blue染色的分析，可进一步确认纯化的IgG的分子量和纯度。
结论本实验成功实现了血浆免疫球蛋白G的提取、纯化和鉴定。
这个实验方法可以用于从血浆中获得高纯度的IgG样品，为后续研究和应用提供基础。
参考文献（仅供参考）[1] Smith A, et al. Purification and characterization of immunoglobulin G (IgG). Journal of Immunological Methods.20XX;XXX(X):XX-XX.。
第五组血清IgG的分离纯化及鉴定
Байду номын сангаас样缓冲液
甘油：蛋白质沉到样品孔底部，不漂浮 β-巯基乙醇：切断二硫键，是蛋白质分 为两单条链 SDS:是蛋白质带负电荷并呈棒状
7
（四）SDS-PAGE测IgG分子量结果
猪血清、纯化的IgG样品经SDS-PAGE电泳结果如下：
1标准蛋白
2 血清
3 纯化的IgG样品
8
活性鉴定
琼脂扩散
开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的
设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节
上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展 提供了有力的基础。
11
12
Contents
材料与方法 结果与讨论
总结与感想
2
一、材料与方法
（一）试验材料 1、试剂和材料
血清、饱和硫酸铵、0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PH=7)、 吸管、高速冷冻离心机
3
方法及步骤
方法 通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中 的各个成分分步盐析出来，达到目的蛋白质。 不同饱和度硫酸铵浓度：V=V0（C2-C1)/(1-C2) V 应加入饱和硫酸铵溶液的体积 V0 蛋白质溶液的原始浓度 C1 原来溶液的硫酸铵饱和度 C2 所要达到硫酸铵饱和度
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步骤
1、取5mL血清和5mL0.01mol/L磷酸盐缓冲 液于小烧杯中，混匀，滴加饱和硫酸铵 溶液，使溶液浓度达到20%，4℃静置 15min 2、4℃ 3000r/min离心10min,弃沉淀（沉淀 为纤维蛋白原） 3、向上清中滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液 浓度达到50%，4℃静置15min
5
4、4℃ 3000r/min离心10min,弃上清液（上 清为清蛋白，沉淀为球蛋白） 5、向沉淀中加5mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲 液，重悬沉淀，滴加饱和硫酸铵溶液， 使溶液浓度达到35%，4℃静置20min 6、4℃ 3000r/min离心15min,弃上清液（上 清为α、β球蛋白）沉淀为IgG
血清IgG的分离
血清IgG的分离
引言
血清IgG的分离是一种常见的实验操作，用于从血清样品中纯化和分离出IgG抗体。
IgG作为一种免疫球蛋白，在研究和诊断中具有重要的应用价值。
本文将介绍一种简单的方法来实现血清IgG 的分离。
实验材料
- 血清样品
- 柱层析试剂盒（例如，Protein A/G柱）
- 洗涤缓冲液
- 结合缓冲液
- 洗脱缓冲液
- 分离缓冲液
操作步骤
1. 准备工作：
- 将柱层析试剂盒按照说明书准备好，确保所有的缓冲液和试剂适当配置。
- 样品处理前，将血清样品离心以去除杂质。
2. 结合IgG抗体：
- 将血清样品加入结合缓冲液中，根据比例稀释适量的样品。
- 在离心前，静置样品与结合缓冲液的混合物反应一段时间（例如，30分钟）。
3. 柱层析操作：
- 将混合物通过装有填充物的柱层析柱。
- 打开流量，并在结合完毕后关闭。
- 使用洗涤缓冲液进行洗脱，以去除非特异性结合物。
4. 洗脱和收集：
- 使用洗脱缓冲液进行洗脱，以从柱层析柱上洗脱结合的IgG 抗体。
- 收集洗脱液中的纯化的IgG抗体。
5. 质量检测：
- 通过测量IgG抗体的浓度或使用其他质量检测方法来确认分离的IgG抗体的纯度和活性。
结论
血清IgG的分离是一种简单且常用的实验方法，可以用于纯化和分离血清样品中的IgG抗体。
通过选择适当的柱层析试剂盒和正确操作步骤，可以高效地获得纯化的IgG抗体。
分离的IgG抗体可以用于各种研究和诊断应用中。
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四、实验步骤
1. Protein A纯化：
1）装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，夹上出入口止水夹，量取 20ml蒸馏水加入柱内，在柱外做一体积为20ml的标记，然后打开止 水夹赶去出口内气泡，最后在柱内保留0.5-1m的水。ProteinA填料 中加入适量平衡缓冲液，小心搅起凝胶，尽量一次加入柱内，待上 层有一水层后打开止水夹，再用20-40ml平衡缓冲液不断加入柱内 洗脱，最后待胶床表面仅有1-2厘米液层时，旋紧止水夹。装好的胶 柱应符合无气泡、无节痕、床面平正。
+ +/-
+ 相对结合强度 – 弱或不结合
蛋白 G 结合 ++++
++++ ++++ +++ +++ +++ +++
+ ++++ ++ ++ ++
三、实验材料——纯化
试剂：磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠、异地酸二 钠、枸橼酸、精氨酸、盐酸胍、氢氧化钠、95%乙 醇；均为分析纯。 容器：50ml烧杯/三角瓶/试管10个；15ml收集试管 5个；100ml三角瓶 5个；250ml烧杯5个 填料：Protein A 层析柱：XK10或预充柱 装柱体积：~2ml 血清：~2ml 滤器： 0.45μm针头式滤器5个； SDS-PAGE:
蛋白 G 结合
-
++++ ++++ ++++ ++++ -
++++ + ++
++ ++ ++ ++++ + +
种属
恒河猴 大鼠
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM* 猪 兔 小鼠
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 绵羊
蛋白 A 结合 ++++
+ ++++ +++ ++ 可变的 +++ ++++
二、实验原理蛋白 A 和 蛋白 G 的结合特异性
种属
人
IgA IgD IgE IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgM* 鸟类蛋黄 IgY† 牛 狗 山羊 豚鼠
IgG1 IgG2 仓鼠 马 考拉 骆驼
蛋白 A 结合
可变的 -
++++ ++++ ++++ 可变的
++ ++ -
++++ ++++ + ++ -
标记为S.
三、实验材料——SDS-PAGE
试剂：
1. 2x样品缓冲液
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺 0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml，过滤。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸 水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸 水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加 蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存 ，临用前稀释10倍（减半配制）。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于 200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到 250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
实验 亲和层析纯化IgG
实验（三）血清中抗体纯化（16学时）
二、实验原理
抗体纯化配基类型
配基
族特异性 专一特异性
Protein A Protein G Antigen Anti-IgG
特异性
许多IgGs 的Fc 片断 许多IgGs 的Fc 片断 特异的抗体 特异免疫球蛋白
二、实验原理
低 pH下洗脱
2）上样：血清让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面 中央~2ml稀释血清，待样液几乎全部进入胶床表面后，关止 水夹，室温下样品与填料结合15min。
实验ห้องสมุดไป่ตู้骤
1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出 速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲 液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。 4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
三、实验材料——纯化
缓冲液： 平衡液：20mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH7.2；(1L) 冲洗液：20mM磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，10mM EDTA二钠，
pH7.2；(1L) 洗脱液：0.1M Glycine-HCl，pH3.5；(1L) 清洗液：6mM氢氧化钠。(1L)
稀释血清： 取2ml血清，用平衡缓冲液稀释5倍，0.45um针头滤器过滤。
器材：
电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
三、实验试剂——浓度测定
考马斯亮蓝G-250蛋白染色液 (1)牛血清白蛋白标准液（100ug/ml） 精确称取0.010g牛血清白蛋白，溶于约50ml蒸馏 水，定容到100ml. (2) 考马斯亮蓝G-250试剂
取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙 醇中，加入85%正磷酸100ml，最后用蒸馏水定容 到1000ml，此试剂在常温下可放1个月。
四、实验步骤
2.SDS-PAGE 纯度测定
分离胶及浓缩胶的制备：
1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净， 用ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干； 2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照 说明书提示装好玻璃板；
用 rProtein A Sepharose™ 分离IgG Column: HiTrap™ Protein A FF 结合缓冲液: 20 mM 磷酸钠, pH 7.0 洗脱缓冲液: 0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 3 注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收 集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中