亲和层析PPT课件
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第五节 亲和层析
早在 1910 年就有人用不溶性淀粉选择吸附、 提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行 分离纯化的实例。事实上几乎所有的生物活性 物质都存在类似于淀粉酶与淀粉间的亲和作用， 如酶与底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅助因 子）、抗原与抗体、激素与受体、核酸中的互 补链、多糖与蛋白复合体等。这种利用生物大 分子特异亲和力而设计的层析技术称为亲和层 析（密切关系套色版）。在亲和层析中起可逆 结合的特异性物质称为配基，与配基结合的层 析介质称为载体。
五、亲和色谱操作条件的选择
1．吸附条件的选择 (1）吸附反应条件 吸附条件最好是自然状态下 配体与目的分子之间反应的最佳条件，如缓冲液中 盐的种类、浓度及pH等条件。如果对配体和配基 之间的结合情况不太了解，就必须对盐种类、浓度 和缓冲液的pH进行条件摸索。如果对配体和蛋自 的结合情况比较了解，可以人为设定反应条件，促 进吸附。例如，金黄葡萄球菌蛋白A和免疫球蛋白 IgG之间的结合主要是疏水作用，可以通过增大盐 浓度、调节pH来增强吸附。 (2）流速的控制 流速也是影响吸附的一个因素 流速不能太快；否则，影响吸附程度。
2、常用载体
（1）纤维素 它是自然界中数量最大的大分子生物材料，取材 十分方便。但由于纤维素结构紧密，均一性差， 不利于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非特 异性吸附力较强，加上空间位阻等原因，其应用 不如凝胶载体广泛。目前主要用于分离与核酸有 关的物质，如用寡聚脱氧胸腺核苷酸纤维作固定 相分离细胞提取液中的 mRNA 。 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
在亲和层析中常用小分子化合物 (如小分子底物、辅 酶、抑制剂等) 作为配基亲和吸附大分子物质 (如酶 等) 。当配基小分子与载体相连接时，载体所形成的 空间位阻会影响到配基与亲和物的密切吻合，往往 不能形成有效的吸附。活化后的琼脂糖要求与带游 离氨基的配基相连接，如果配基不具有游离的氨基， 就无法与载体相连接。
《亲和层析》PPT课件
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5. 多孔玻璃珠(商品为Bio-Glass)
• 它的化学与物理稳定性较好，机械强度高，不但 能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和 较剧烈的反应条件。
• 缺点是亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质 有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团 也少。
• 为了克服上述缺点，作载体用的市售Bio-Glass 的商品都已事先连接了氨烷基(烷基胺)。
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OH
O
偶联
OH
活化
gel
+ CNBr
gel
C NH + RNH2
gel
OH
⑤ 载体应具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸
附的大分子自由通过精。选ppt
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（二）常用载体
• 纤维素 • 琼脂糖凝胶 √ • 聚丙烯酰胺凝胶 √ • 葡聚糖凝胶 • 多孔玻璃珠 √
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1. 纤维素
• 它是自然界中数量最大的大分子生物材料， 取材十分方便。
• 但由于纤维素结构紧密、均一性差，不利 于大分子的渗入。活化后因带有电荷，非 特异性吸附力较强，加上空间位阻等原因， 其应用不如凝胶载体广泛。
• 例如，Sepharose 4B的分子量排阻极限达上百 万，便于大分子通过；载体几乎没有带电基团， 非专一性吸附少。
• Sepharose CL是用1,3-二溴丙烷处理的交联琼脂 糖，它的稳定性明显增加，能在pH 3~14中应用。
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3. 聚丙烯酰胺凝胶
• 是由丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺经催化聚合形成 的人工合成载体，是具有网状三维空间结构的凝 胶型高聚物，商品名为Biogel P。
• 将制备的亲和吸附剂装柱平衡， • 当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生
亲和层析
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
亲和层析
Fig5 . Principle of preparing AC media来自 第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（
Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.
2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择 性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及 寻求稳定的层析条件。
( Fig1. Mechanism of AC)
( Fig2. Mechanism of AC)
具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)
1：抗原与抗体。 2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 2：颗粒均匀，具有良好的流速。 3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。
亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：
第一节： 亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点： 一、 基本概念：(basic concept)： 1： 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基
亲和色谱精讲PPT课件
一、要求
㈠. L与基质结合，对L-S结合无干扰； ㈡. L为小分子有的需“手臂”，使LS结
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
.
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二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
三、 由CNBr活化型Sep.4B制备
3. 需了解L-S的作用机制
如……
.
12
例：酶 有单底物反应、双底物反应
单A E
EA
P E
EP
底物A、产物P或它们的类似物都可以
.
13
双底物依次
AB E
EA EAB
PQ E
EPQ EQ
须选择A、若选B则吸附时须加A
.
14
双底物随机
A（B） B（A） P（Q） Q（P）
E
E
EA EA（B） EPQ
.
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其他方法
羰基二咪唑（CDI）法 高碘酸盐法 磺化氟甲基吡啶鎓法 N-羟基琥珀酰亚胺法
.
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其他亲和吸附剂
聚丙烯酰胺载体的亲和吸附剂可用戊二醛 法和肼解法活化,然后再将含氨基的配体固 定到其活化基团上;
硅胶和多孔玻璃载体的亲和吸附剂最常用 的修饰方法就是进行硅烷化处理,从而给载 体引入氨基或环氧基团.
连接臂的连接
连接臂先接配体后偶联至载体 连接臂先偶联至载体后接配体
.
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四、由氨基-Sep或羧基- Sep制备
Sep-(CH2)6-NH2 Sep
L-COOH AH-
Sep-(CH2)6-COOH L-NH2
CH-Sep
碳二亚胺法（配基偶联的一种方法）：
chapter8亲和层析
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
Often need spacer arm
but watch out for adsorption to the spacer!
8.2 亲和色谱原理
2、连接：通过化学反应与活化基团连接
3、手臂化合物：
乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2 • 已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 • 6-氨基已酸 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH • 环氧氯丙烷
• 1，4- 丁二醇缩水甘油醚
8.4 亲和吸附平衡
8.4.1 亲和吸附等温线 亲和吸附平衡基本上可以用Langmuir 或Freundlich等温式表 达。 在吸附浓度较低的范围内，吸附等温线近似为线形 Freundlich型吸附等温式
固体粒子称为配基的载体。
作为载体的物质应具有（6点）：
①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，
使用寿命长； ③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固
定化； ⑤抗微生物和酶的侵蚀； ⑥最好为粒径均一的球形粒子。
常用的载体有 葡聚糖、聚丙烯酰 胺等，近年来 多孔硅胶 和 合成高分 子化合物 载体正在被开发应用于亲和 层析。
其中cm的指数值越小，表示亲和结合力越强，当指数值小于 0.1时，吸附平衡可以用矩形等温式近似。
8.4 亲和吸附平衡
8.4 亲和吸附平衡
8.4.2 色素亲和吸附平衡
色素配基CB为一种生物模拟色素，具有特殊的化学 结构，可以和多种蛋白通过不同机理结合。
Often need spacer arm
but watch out for adsorption to the spacer!
8.2 亲和色谱原理
2、连接：通过化学反应与活化基团连接
3、手臂化合物：
乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2 • 已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 • 6-氨基已酸 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH • 环氧氯丙烷
• 1，4- 丁二醇缩水甘油醚
8.4 亲和吸附平衡
8.4.1 亲和吸附等温线 亲和吸附平衡基本上可以用Langmuir 或Freundlich等温式表 达。 在吸附浓度较低的范围内，吸附等温线近似为线形 Freundlich型吸附等温式
固体粒子称为配基的载体。
作为载体的物质应具有（6点）：
①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，
使用寿命长； ③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固
定化； ⑤抗微生物和酶的侵蚀； ⑥最好为粒径均一的球形粒子。
常用的载体有 葡聚糖、聚丙烯酰 胺等，近年来 多孔硅胶 和 合成高分 子化合物 载体正在被开发应用于亲和 层析。
其中cm的指数值越小，表示亲和结合力越强，当指数值小于 0.1时，吸附平衡可以用矩形等温式近似。
8.4 亲和吸附平衡
8.4 亲和吸附平衡
8.4.2 色素亲和吸附平衡
色素配基CB为一种生物模拟色素，具有特殊的化学 结构，可以和多种蛋白通过不同机理结合。
第五节 亲和层析
加入0.01%的叠氮化钠，4°C 下保存
五、亲和层析用于蛋白质分离的实例
免疫亲和层析 凝集素和糖蛋白亲和层析 含有辅酶的酶类的亲和层析 酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析 肝素为配体的亲和层析 染料配体亲和层析 金属螯合层析
1、免疫亲和层析
小鼠血清不同亚型IgG 的分离
与配体结合非常牢固时
使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性
剂，使蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性
3、吸附剂的再生和保存
再生
用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重
新平衡 严重的不可逆吸附时，使用高浓度的盐溶液、尿素等变性 剂或加入适当的非专一性蛋白酶
保存
糖蛋白亲和层析
不同的糖蛋白具有不同的单相组分和糖链结构，它们
和不同的凝集素呈现出不同的结合能力。
常用的凝集素 ：
Con A 、LCA
对甘露糖专一
WGA 对N-Biblioteka 酰氨基葡萄糖专一人血色素结合蛋白的分离
离子交换层析得到含有血 色素结合蛋白和转铁蛋白 的级分 用50m mol/L的磷酸缓冲液，pH 7.0(含0.2mol/LNaCl)平衡 固定化 的WGA（麦胚凝集素）柱
↙
上柱
↓
平衡液洗脱不结合在柱上的转 铁蛋白
↓
含有100 mg／m1 N-乙酰氨基葡萄糖 的平衡液洗脱血色素结合蛋白
回收率达91％
猪淋巴细胞质膜糖蛋白的分离
1％的脱氧胆酸钠增溶膜蛋白
↓
上固定化的LCA柱(1cm×8cm)
↓
用1％的脱氧胆酸钠洗涤亲和柱，除去杂蛋白
↓
用含2％α-甲基甘露糖苷的1％的脱氧胆酸钠洗脱膜糖蛋白
亲和层析
特点： • 亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。 • 用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧 失。 • 该法的缺点是： 要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固 相载体之后方可进行。
操作流程
一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求： 1．极低的非特异吸附性； 2．高度的亲水性。 亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。 3．较好的理化稳定性。 当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、温度和变 性剂等)变化时，基质很少甚至不受影响； 4 ．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合； 5．适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。
即可把物质 S 从固相载体上解离下来，并形成了第二 个层析峰
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时， 则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。 使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称： 特异性配体亲和层析法 • 配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似 底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力； 另有一种亲和层析法叫： 通用性配体亲和层析法 • 配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)， 它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和 脱附条件可提高层析的分辨率。
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。 • ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质 ( 如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。 • ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。 A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。 B．剧烈的洗脱条件(蛋白质变性剂) 如用盐酸胍、尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的蛋 白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可恢 复活性。
亲和层析优秀课件
亲和层析优秀课件
第一节 亲和层析概述
• 利用生物分子间专一的亲和力而进行分离 的一种层析技术
• 配体固定化的问题 • 在生物分离中有广泛的应用
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
• 目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚 脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液 中的mRNA。
• 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
2. 琼脂糖凝胶
• 是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链 状多糖，用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。
• 琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商品称 为Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和 Ultrogels A-2，A-4，A-6(LKB)。这类载体能使 吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能 基团，结构疏松孔径大，流速快。
• 用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免 疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品[4]， 免疫检测法利用被标记的抗体或模拟分析物来进 行间接的被分析物的分析。常用标记如酶标记、 荧光标记、化学荧光等。
固定化金属离子亲和层析
• 是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统。
• 目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组 氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚 基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合， 这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据[5,6]。
• 1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋 白质的方法，并成功地制备了固定化酶。此技术 的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层 析技术得到了快速的发展。
第一节 亲和层析概述
• 利用生物分子间专一的亲和力而进行分离 的一种层析技术
• 配体固定化的问题 • 在生物分离中有广泛的应用
历史
• 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉 酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的 实例。
• 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配 体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。
• 目前主要用于分离与核酸有关的物质，如用寡聚 脱氧胸腺核苷酸纤维素作固定相分离细胞提取液 中的mRNA。
• 市售纤维素商品为无定形微纤维、微晶纤维素以 及珠状纤维素。
2. 琼脂糖凝胶
• 是由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链 状多糖，用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。
• 琼脂糖浓度有2%、4%、6%几种，相应的商品称 为Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和 Ultrogels A-2，A-4，A-6(LKB)。这类载体能使 吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能 基团，结构疏松孔径大，流速快。
• 用免疫层析柱进行各种类型的免疫检测被称为免 疫检测法，特别适用于检测含量低微的样品[4]， 免疫检测法利用被标记的抗体或模拟分析物来进 行间接的被分析物的分析。常用标记如酶标记、 荧光标记、化学荧光等。
固定化金属离子亲和层析
• 是利用金属离子的络合物或形成螯合物的能力吸 附蛋白质的分离系统。
• 目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组 氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚 基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合， 这是IMAC用于蛋白质分离纯化的根据[5,6]。
• 1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋 白质的方法，并成功地制备了固定化酶。此技术 的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层 析技术得到了快速的发展。
《亲和层析的应用》课件
疾病诊断和治疗
亲和层析在疾病诊断中的应用：通过亲和层析技术，可以快速准确地 检测出疾病标志物，如肿瘤标志物、病毒抗原等。
亲和层析在疾病治疗中的应用：亲和层析技术可以用于分离和纯化 药物，提高药物的疗效和安全性。
亲和层析在药物研发中的应用：亲和层析技术可以用于筛选和优化药 物分子，提高药物研发的效率和成功率。
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亲和层析的应用
汇报人：
目录
01 02 03 04 05 06
添加目录项标题 亲和层析技术概述 亲和层析的实验流程 亲和层析在生物医药领域的应用 亲和层析在环境科学领域的应用 亲和层析在其他领域的应用
01
添加目录项标题
02
亲和层析技术概述
亲和层析技术的定义
亲和层析技术是一种生物化学分离技术 利用生物分子之间的特异性相互作用进行分离 包括亲和吸附、亲和萃取、亲和色谱等方法 广泛应用于蛋白质、核酸、多肽等生物大分子的分离纯化
农药残留检测： 亲和层析可用 于检测农产品 中的农药残留， 提高食品安全
性
土壤污染物检 测：亲和层析 可用于检测土 壤中的污染物， 如重金属、有
机污染物等
植物基因工程： 亲和层析可用 于植物基因工 程的研究，如 基因克隆、基
因表达等
食品科学领域的应用
蛋白质分离：用于分离不同蛋白质，如乳清蛋白、大豆蛋白等 食品添加剂分离：用于分离食品添加剂，如色素、防腐剂等 食品污染物去除：用于去除食品中的污染物，如重金属、农药残留等 食品品质控制：用于控制食品品质，如糖度、酸度等
ห้องสมุดไป่ตู้
工业生产领域的应用
生物制药：分离 纯化蛋白质、多 肽等生物大分子
食品工业：分离 纯化食品添加剂、 色素等
第七章 层析分离技术(4)亲和层析
7.4 亲和层析
三、亲和层析的操作过程
洗脱(elution)
按洗脱机理可分为：
（1）竞争性洗脱：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的 小分子化合物为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗 脱目标物。
例1：t-PA亲和层析，赖氨酸和精氨酸均为其抑制剂； 例2：带有His标签的蛋白质的金属鳌和亲和层析，用咪唑溶液为洗脱剂）
样品需进行预处理：通过离心或超滤除去微小颗粒； 缓冲液离子强度： 载体活化时引入一些带基团，低离子强度下，树脂对杂质的静电作用较 强，因此，提高盐浓度可减少杂质的非特异性吸附； 在离子强度太高的情况下，由于间隔臂上的碳氢链疏水性增强，也可能 产生非特异性吸附 因此，缓冲液的离子强度应适中（100~500mmol/L）
第七章 层析分离技术（4）
本章内容
7.1 层析技术导论 7.2 凝胶过滤层析 7.3 离子交换层析 7.4 亲和层析 7.5 固定金属离子亲和层析 7.6 疏水作用层析 7.7 反相层析
7.4 亲和层析
一、基本原理及特点 二、亲和层析的基本组成 三、亲和层析的操作过程 四、亲和层析存在的问题 五、举例：利用谷胱甘肽-亲和层析树脂 纯化GST-融合蛋白
(1)溴化氰法
溴化氰在碱性条件下与多糖上的羟基反应导入氰酯键或亚氨碳酸酯 到基质上,进而与配基偶联。
优点: （1）适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质 （2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联 （3）操作步骤简单,重现性好。 （4）偶联条件温和,特别适用于偶联敏感性生物大分子。 缺点： （1）形成的异脲键易产生非特异性吸附, （2）共价键不稳定,配基容易脱落, （3）活化操作危险性大（CNBr为剧毒药品，操作需在通风橱中进 行），反应后的残余液需经处理再排放。
亲和层析
质 有共价结合的基团
常用配体：效应物、类似底物、抗体、抑制剂、凝集素
• 亲和吸附剂的制备 1、活化 2、偶联 3、配体与基质之间引入“手臂”
流动相的选择
• 亲和力弱：大体积的缓冲液 • 亲和力一般：梯度缓冲液：pH梯度，离子 强度梯度（盐浓度梯度） • 亲和力较强：竞争性洗脱剂、变性剂
柱层析操作
⑴ 装柱 ⑵ 平衡 ⑶ 加样 ⑷ 洗脱 ⑸ 收集、鉴定及保存 ⑹ 基质（亲和剂）的再生
应用实例
• 甲基化白蛋白-硅藻土层析分离核酸 • 麦胚凝集素-琼脂糖层析分离胰岛素受体
亲和层析
亲和层析原理
以亲和剂为固定相，根据物质与配体的亲和力 不同而进行分离的一种层析技术。 常用的亲和力：酶-底物、抗原-抗体、激素-受 体
亲和剂的选择
• 亲和剂的结构 基质-配体 纤维素-凝集素-糖蛋白
• 基质的要求： 低吸附性、高亲水性、高稳定性、 适当多孔性、有活化基团
常用基质:纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰 胺凝胶、多孔玻璃珠
常用配体：效应物、类似底物、抗体、抑制剂、凝集素
• 亲和吸附剂的制备 1、活化 2、偶联 3、配体与基质之间引入“手臂”
流动相的选择
• 亲和力弱：大体积的缓冲液 • 亲和力一般：梯度缓冲液：pH梯度，离子 强度梯度（盐浓度梯度） • 亲和力较强：竞争性洗脱剂、变性剂
柱层析操作
⑴ 装柱 ⑵ 平衡 ⑶ 加样 ⑷ 洗脱 ⑸ 收集、鉴定及保存 ⑹ 基质（亲和剂）的再生
应用实例
• 甲基化白蛋白-硅藻土层析分离核酸 • 麦胚凝集素-琼脂糖层析分离胰岛素受体
亲和层析
亲和层析原理
以亲和剂为固定相，根据物质与配体的亲和力 不同而进行分离的一种层析技术。 常用的亲和力：酶-底物、抗原-抗体、激素-受 体
亲和剂的选择
• 亲和剂的结构 基质-配体 纤维素-凝集素-糖蛋白
• 基质的要求： 低吸附性、高亲水性、高稳定性、 适当多孔性、有活化基团
常用基质:纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰 胺凝胶、多孔玻璃珠
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亲和层析技术 Affinity Chromatography
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1
什么是亲和层析?
亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的 相互作用来分离物质的层析方法
-
2
基质/基架:可以耦联配基的惰性材料，如 Sepharose HP，Sepharose FF
间隔臂: 减少空间位阻效应， 大大增加配基对待分离的生物大分子的吸附效率。
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16
-
7
洗脱条件的选择
亲和层析过程中的洗脱属于特异性的解离方式， 洗脱剂的选择首先必须不会引起待分离物的变性失活。
样品上柱之后，用起始缓冲液把非专一吸附的蛋白质洗去， 然后选择合适的条件将目的酶洗脱下来。
如果酶和配基之间亲和力不高： 通常是改变洗脱液的pH、离子强度等因子， 用类似离子交换层析的方法将目的酶洗脱下来。
0.5 mol/L或者1mol/L的NaCl。
改变pH值洗脱—pH的变化可以改变结合位点上
带电基团的离子化程度，解吸附一般是降低pH值， 载体、配基和被吸附物质的化学稳定性决定了pH 使用的限度。
-
9
竞争性洗脱—特异的配基竞争性洗脱或底物竞争性洗脱， 在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基。
-
15
蛋白不挂NI柱的原因分析
1.结合缓冲液中的咪唑浓度过高
2.PH太低（检查样品及缓冲液PH）
3.组氨酸标签不突出（可构建在蛋白另一端）
4.组氨酸标签在发酵或纯化时被酶解（加蛋白酶抑制剂 或将标签构建在蛋白另一端）
5.样品中有EDTA等螯合剂使金属离子解离脱落 (可加大于3mmol的MgSO4，消除EDTA影响， 或过分子筛柱，将小分子复合物除去)
-
14
用目标物质的类似物竞争洗脱
用Ni Sepharose分离组氨酸标签蛋白
结合缓冲液: 20 mM phosphate, 0.5 M NaCl,20-40 mM 咪唑 洗脱缓冲液: 结合缓冲液中加入500 mM咪唑（终浓度）
注意: 若重组的组氨酸标签蛋白是包涵体，在纯化过程中可加入 8M尿素或6M盐酸胍.
选择与待分离物有高亲和力但其结构与载体上 固定化配基不同的配基洗脱，可以减少非特异性洗脱。
-
10
变性剂洗脱—有的蛋白在一定浓度的变性剂 中有较好的稳定性，但在亲和介质上结合得 比较牢固，在洗脱液中加入EDTA、盐酸胍、 尿素等有利于蛋白质解离。
-
11
低pH下洗脱
Protein G Sepharose分离IgG抗体
结合缓冲液:20 mM 磷酸钠, pH 7.0 洗脱缓冲液:0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 2.7
注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中
-
12
高盐洗脱
在Heparin Sepharose(肝素)上分离DNA结合蛋白
结合缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 0.5 M NaCl 洗脱缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 1-2 M NaCl
注意: 了维持活性常添加5% (v/v)的甘油和蛋白酶抑制剂
-
13
用游离的配基类似物竞争洗脱
用Glutathione Sepharose纯化GST标签蛋白
结合缓冲液: PBS + 1% Triton X-100 洗脱缓冲液: 10 mM 还原型谷光甘肽, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
-
5
族特异性配基-2
配基
特异性
精氨酸 苯甲脒 钙调蛋白 肝素
过渡金属离子
丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 钙调蛋白调控的蛋白 凝血因子, 脂蛋白, 脂酶, 激素, 类固醇受体, 蛋白合成因子, 核酸结合酶 含组氨酸的蛋白质和多肽
-
6
亲和层析的主要阶段
准备亲和层析的填料 平衡 上样和清洗 洗脱目标物 再平衡
-
4
族特异性配基-1
配基
Protein A Protein G Concanavalin A (伴刀豆球蛋白A) Cibacron Blue
特异性
IgG 的Fc 片段 IgG 的Fc 片段 Glucopyranosyl & Mannopyranosyl groups
(吡喃葡萄糖&吡喃甘露糖基团) 宽范围的酶，血清白蛋白
如果目的酶与配基的亲和力很强：
可向洗脱剂中加入与配基有更高亲和力的物质与目的酶竞争，
而将目的酶洗脱下来。
或使用极端的pH或其他蛋白质变性剂，如尿素和盐酸胍。
但洗脱后应将洗脱峰迅速中和、稀释或透析，以保持酶的自然构象。
-
8
离子强度洗脱—洗脱液离子强度增加有利于洗脱，
可以用一步法或梯度变化，在高离子强度作用下 使亲和力减弱，将被洗脱物洗脱下来。 NaCl是常用的盐，一般在平衡液中加入
配基:和目标物有特异性相互作用的物质
耦连:将配基与基架以共价键的方式连接
-
3
配基与目标蛋白的特异性
专一特异性配基：针对单一物质的特异性 如： 抗原 抗体 激素 受体
族特异性配基：针对一类结构或功能相似物 质的特异性
如：
凝集素
糖蛋白
Protein G IgG 抗体
Dye-stuffs（染料） 酶
它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这种专一的可逆结合力称为亲和力。
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什么是亲和层析?
亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的 相互作用来分离物质的层析方法
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2
基质/基架:可以耦联配基的惰性材料，如 Sepharose HP，Sepharose FF
间隔臂: 减少空间位阻效应， 大大增加配基对待分离的生物大分子的吸附效率。
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洗脱条件的选择
亲和层析过程中的洗脱属于特异性的解离方式， 洗脱剂的选择首先必须不会引起待分离物的变性失活。
样品上柱之后，用起始缓冲液把非专一吸附的蛋白质洗去， 然后选择合适的条件将目的酶洗脱下来。
如果酶和配基之间亲和力不高： 通常是改变洗脱液的pH、离子强度等因子， 用类似离子交换层析的方法将目的酶洗脱下来。
0.5 mol/L或者1mol/L的NaCl。
改变pH值洗脱—pH的变化可以改变结合位点上
带电基团的离子化程度，解吸附一般是降低pH值， 载体、配基和被吸附物质的化学稳定性决定了pH 使用的限度。
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竞争性洗脱—特异的配基竞争性洗脱或底物竞争性洗脱， 在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基。
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蛋白不挂NI柱的原因分析
1.结合缓冲液中的咪唑浓度过高
2.PH太低（检查样品及缓冲液PH）
3.组氨酸标签不突出（可构建在蛋白另一端）
4.组氨酸标签在发酵或纯化时被酶解（加蛋白酶抑制剂 或将标签构建在蛋白另一端）
5.样品中有EDTA等螯合剂使金属离子解离脱落 (可加大于3mmol的MgSO4，消除EDTA影响， 或过分子筛柱，将小分子复合物除去)
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用目标物质的类似物竞争洗脱
用Ni Sepharose分离组氨酸标签蛋白
结合缓冲液: 20 mM phosphate, 0.5 M NaCl,20-40 mM 咪唑 洗脱缓冲液: 结合缓冲液中加入500 mM咪唑（终浓度）
注意: 若重组的组氨酸标签蛋白是包涵体，在纯化过程中可加入 8M尿素或6M盐酸胍.
选择与待分离物有高亲和力但其结构与载体上 固定化配基不同的配基洗脱，可以减少非特异性洗脱。
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变性剂洗脱—有的蛋白在一定浓度的变性剂 中有较好的稳定性，但在亲和介质上结合得 比较牢固，在洗脱液中加入EDTA、盐酸胍、 尿素等有利于蛋白质解离。
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低pH下洗脱
Protein G Sepharose分离IgG抗体
结合缓冲液:20 mM 磷酸钠, pH 7.0 洗脱缓冲液:0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 2.7
注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中
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高盐洗脱
在Heparin Sepharose(肝素)上分离DNA结合蛋白
结合缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 0.5 M NaCl 洗脱缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 1-2 M NaCl
注意: 了维持活性常添加5% (v/v)的甘油和蛋白酶抑制剂
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用游离的配基类似物竞争洗脱
用Glutathione Sepharose纯化GST标签蛋白
结合缓冲液: PBS + 1% Triton X-100 洗脱缓冲液: 10 mM 还原型谷光甘肽, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
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族特异性配基-2
配基
特异性
精氨酸 苯甲脒 钙调蛋白 肝素
过渡金属离子
丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 钙调蛋白调控的蛋白 凝血因子, 脂蛋白, 脂酶, 激素, 类固醇受体, 蛋白合成因子, 核酸结合酶 含组氨酸的蛋白质和多肽
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亲和层析的主要阶段
准备亲和层析的填料 平衡 上样和清洗 洗脱目标物 再平衡
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族特异性配基-1
配基
Protein A Protein G Concanavalin A (伴刀豆球蛋白A) Cibacron Blue
特异性
IgG 的Fc 片段 IgG 的Fc 片段 Glucopyranosyl & Mannopyranosyl groups
(吡喃葡萄糖&吡喃甘露糖基团) 宽范围的酶，血清白蛋白
如果目的酶与配基的亲和力很强：
可向洗脱剂中加入与配基有更高亲和力的物质与目的酶竞争，
而将目的酶洗脱下来。
或使用极端的pH或其他蛋白质变性剂，如尿素和盐酸胍。
但洗脱后应将洗脱峰迅速中和、稀释或透析，以保持酶的自然构象。
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离子强度洗脱—洗脱液离子强度增加有利于洗脱，
可以用一步法或梯度变化，在高离子强度作用下 使亲和力减弱，将被洗脱物洗脱下来。 NaCl是常用的盐，一般在平衡液中加入
配基:和目标物有特异性相互作用的物质
耦连:将配基与基架以共价键的方式连接
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配基与目标蛋白的特异性
专一特异性配基：针对单一物质的特异性 如： 抗原 抗体 激素 受体
族特异性配基：针对一类结构或功能相似物 质的特异性
如：
凝集素
糖蛋白
Protein G IgG 抗体
Dye-stuffs（染料） 酶
它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这种专一的可逆结合力称为亲和力。