亲和层析PPT课件
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选择与待分离物有高亲和力但其结构与载体上 固定化配基不同的配基洗脱，可以减少非特异性洗脱。
-
10
变性剂洗脱—有的蛋白在一定浓度的变性剂 中有较好的稳定性，但在亲和介质上结合得 比较牢固，在洗脱液中加入EDTA、盐酸胍、 尿素等有利于蛋白质解离。
-
11
低pH下洗脱
Protein G Sepharose分离IgG抗体
-
4
族特异性配基-1
配基
Protein A Protein G Concanavalin A (伴刀豆球蛋白A) Cibacron Blue
特异性
IgG 的Fc 片段 IgG 的Fc 片段 Glucopyranosyl & Mannopyranosyl groups
(吡喃葡萄糖&吡喃甘露糖基团) 宽范围的酶，血清白蛋白
配基:和目标物有特异性相互作用的物质
耦连:将配基与基架以共价键的方式连接
-
3
配基与目标蛋白的特异性
专一特异性配基：针对单一物质的特异性 如： 抗原 抗体 激素 受体
族特异性配基：针对一类结构或功能相似物 质的特异性
如：
凝集素
糖蛋白
Protein G IgG 抗体
Dye-stuffs（染料） 酶
它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这种专一的可逆结合力称为亲和力。
-
15
蛋白不挂NI柱的原因分析
1.结合缓冲液中的咪唑浓度过高
2.PH太低（检查样品及缓冲液PH）
3.组氨酸标签不突出（可构建在蛋白另一端）
4.组氨酸标签在发酵或纯化时被酶解（加蛋白酶抑制剂 或将标签构建在蛋白另一端）
5.样品中有EDTA等螯合剂使金属离子解离脱落 (可加大于3mmol的MgSO4，消除EDTA影响， 或过分子筛柱，将小分子复合物除去)
-
16
-
14
用目标物质的类似物竞争洗脱
用Ni Sepharose分离组氨酸标签蛋白
结合缓冲液: 20 mM phosphate, 0.5 M NaCl,20-40 mM 咪唑 洗脱缓冲液: 结合缓冲液中加入500 mM咪唑（终浓度）
注意: 若重组的组氨酸标签蛋白是包涵体，在纯化过程中可加入 8M尿素或6M盐酸胍.
注意: 为了维持活性常添加5% (v/v)的甘油和蛋白酶抑制剂
-
13
用游离的配基类似物竞争洗脱
用Glutathione Sepharose纯化GST标签蛋白
结合缓冲液: PBS + 1% Triton X-100 洗脱缓冲液: 10 mM 还原型谷光甘肽, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
如果目的酶与配基的亲和力很强：
可向洗脱剂中加入与配基有更高亲和力的物质与目的酶竞争，
而将目的酶洗脱下来。
或使用极端的pH或其他蛋白质变性剂，如尿素和盐酸胍。
但洗脱后应将洗脱峰迅速中和、稀释或透析，以保持酶的自然构象。
-
8
离子强度洗脱—洗脱液离子强度增加有利于洗脱，
可以用一步法或梯度变化，在高离子强度作用下 使亲和力减弱，将被洗脱物洗脱下来。 NaCl是常用的盐，一般在平衡液中加入
结合缓冲液:20 mM 磷酸钠, pH 7.0 洗脱缓冲液:0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 2.7
注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中
-
12
高盐洗脱
在Heparin Sepharose(肝素)上分离DNA结合蛋白
结合缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 0.5 M NaCl 洗脱缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 1-2 M NaCl
-
7
洗脱条件的选择
亲和层析过程中的洗脱属于特异性的解离方式， 洗脱剂的选择首先必须不会引起待分离物的变性失活。
样品上柱之后，用起始缓冲液把非专一吸附的蛋白质洗去， 然后选择合适的条件将目的酶洗脱下来。
如果酶和配基之间亲和力不高： 通常是改变洗脱液的pH、离子强度等因子， 用类似离子交换层析的方法将目的酶洗脱下来。
0.5 mol/L或者1mol/L的NaCl。
改变pH值洗脱—pH的变化可以改变结合位点上
带电基团的离子化程度，解吸附一般是降低pH值， 载体、配基和被吸附物质的化学稳定性决定了pH 使用的限度。
-
9
竞争性洗脱—特异的配基竞争性洗脱或底物竞争性洗脱， 在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基。
-
5
族特异性配基-2
配基
特பைடு நூலகம்性
精氨酸 苯甲脒 钙调蛋白 肝素
过渡金属离子
丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 钙调蛋白调控的蛋白 凝血因子, 脂蛋白, 脂酶, 激素, 类固醇受体, 蛋白合成因子, 核酸结合酶 含组氨酸的蛋白质和多肽
-
6
亲和层析的主要阶段
准备亲和层析的填料 平衡 上样和清洗 洗脱目标物 再平衡
亲和层析技术 Affinity Chromatography
-
1
什么是亲和层析?
亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的 相互作用来分离物质的层析方法
-
2
基质/基架:可以耦联配基的惰性材料，如 Sepharose HP，Sepharose FF
间隔臂: 减少空间位阻效应， 大大增加配基对待分离的生物大分子的吸附效率。
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10
变性剂洗脱—有的蛋白在一定浓度的变性剂 中有较好的稳定性，但在亲和介质上结合得 比较牢固，在洗脱液中加入EDTA、盐酸胍、 尿素等有利于蛋白质解离。
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11
低pH下洗脱
Protein G Sepharose分离IgG抗体
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族特异性配基-1
配基
Protein A Protein G Concanavalin A (伴刀豆球蛋白A) Cibacron Blue
特异性
IgG 的Fc 片段 IgG 的Fc 片段 Glucopyranosyl & Mannopyranosyl groups
(吡喃葡萄糖&吡喃甘露糖基团) 宽范围的酶，血清白蛋白
配基:和目标物有特异性相互作用的物质
耦连:将配基与基架以共价键的方式连接
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配基与目标蛋白的特异性
专一特异性配基：针对单一物质的特异性 如： 抗原 抗体 激素 受体
族特异性配基：针对一类结构或功能相似物 质的特异性
如：
凝集素
糖蛋白
Protein G IgG 抗体
Dye-stuffs（染料） 酶
它们依靠分子间的氢键、范德华力进行结合，这种专一的可逆结合力称为亲和力。
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蛋白不挂NI柱的原因分析
1.结合缓冲液中的咪唑浓度过高
2.PH太低（检查样品及缓冲液PH）
3.组氨酸标签不突出（可构建在蛋白另一端）
4.组氨酸标签在发酵或纯化时被酶解（加蛋白酶抑制剂 或将标签构建在蛋白另一端）
5.样品中有EDTA等螯合剂使金属离子解离脱落 (可加大于3mmol的MgSO4，消除EDTA影响， 或过分子筛柱，将小分子复合物除去)
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用目标物质的类似物竞争洗脱
用Ni Sepharose分离组氨酸标签蛋白
结合缓冲液: 20 mM phosphate, 0.5 M NaCl,20-40 mM 咪唑 洗脱缓冲液: 结合缓冲液中加入500 mM咪唑（终浓度）
注意: 若重组的组氨酸标签蛋白是包涵体，在纯化过程中可加入 8M尿素或6M盐酸胍.
注意: 为了维持活性常添加5% (v/v)的甘油和蛋白酶抑制剂
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用游离的配基类似物竞争洗脱
用Glutathione Sepharose纯化GST标签蛋白
结合缓冲液: PBS + 1% Triton X-100 洗脱缓冲液: 10 mM 还原型谷光甘肽, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
如果目的酶与配基的亲和力很强：
可向洗脱剂中加入与配基有更高亲和力的物质与目的酶竞争，
而将目的酶洗脱下来。
或使用极端的pH或其他蛋白质变性剂，如尿素和盐酸胍。
但洗脱后应将洗脱峰迅速中和、稀释或透析，以保持酶的自然构象。
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离子强度洗脱—洗脱液离子强度增加有利于洗脱，
可以用一步法或梯度变化，在高离子强度作用下 使亲和力减弱，将被洗脱物洗脱下来。 NaCl是常用的盐，一般在平衡液中加入
结合缓冲液:20 mM 磷酸钠, pH 7.0 洗脱缓冲液:0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 2.7
注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中
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高盐洗脱
在Heparin Sepharose(肝素)上分离DNA结合蛋白
结合缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 0.5 M NaCl 洗脱缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 1-2 M NaCl
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7
洗脱条件的选择
亲和层析过程中的洗脱属于特异性的解离方式， 洗脱剂的选择首先必须不会引起待分离物的变性失活。
样品上柱之后，用起始缓冲液把非专一吸附的蛋白质洗去， 然后选择合适的条件将目的酶洗脱下来。
如果酶和配基之间亲和力不高： 通常是改变洗脱液的pH、离子强度等因子， 用类似离子交换层析的方法将目的酶洗脱下来。
0.5 mol/L或者1mol/L的NaCl。
改变pH值洗脱—pH的变化可以改变结合位点上
带电基团的离子化程度，解吸附一般是降低pH值， 载体、配基和被吸附物质的化学稳定性决定了pH 使用的限度。
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竞争性洗脱—特异的配基竞争性洗脱或底物竞争性洗脱， 在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基。
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族特异性配基-2
配基
特பைடு நூலகம்性
精氨酸 苯甲脒 钙调蛋白 肝素
过渡金属离子
丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 钙调蛋白调控的蛋白 凝血因子, 脂蛋白, 脂酶, 激素, 类固醇受体, 蛋白合成因子, 核酸结合酶 含组氨酸的蛋白质和多肽
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6
亲和层析的主要阶段
准备亲和层析的填料 平衡 上样和清洗 洗脱目标物 再平衡
亲和层析技术 Affinity Chromatography
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什么是亲和层析?
亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的 相互作用来分离物质的层析方法
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基质/基架:可以耦联配基的惰性材料，如 Sepharose HP，Sepharose FF
间隔臂: 减少空间位阻效应， 大大增加配基对待分离的生物大分子的吸附效率。