水相酶促酯化法拆分dl_薄荷醇的连续操作

第10卷第3期 高　校　化　学　工　程　学　报 N o.3V o l.101996年9月 Jo urnal of Chemical Eng ineer ing o f Chinese U niv er sities Sept.　1996水相酶促酯化法拆分d l-薄荷醇的连续操作许建和1 俞俊棠1 川本卓男2 田中渥夫2(1华东理工大学生化工程研究所,上海200237)(2京都大学工学部应用生化研究室,日本,京都606)摘　要　对影响脂肪酶活性、稳定性和对映选择性的因素,如有机溶剂和反应温度等首先进行了优化。

其次,使用悬浮于环已烷的粉末状游离脂肪酶(Candida cy lindr acea lipase O F360)作生物催化剂,成功地构建了一个高效的非水相游离酶连续搅拌釜反应器。

当使用高度反应性的丙酸酐作为薄荷醇的酰基给体,进行连续的酶促对映选择性酯化反应时,醇的转化率在两周内可保持40%以上,所生成酯的光学纯度超过95%e.e。

但是,当使用相应的游离丙酸(而不是酸酐)作酰基给体时,薄荷醇的转化率在连续操作开始后迅速下降,表明使用酸酐时的生产力要比使用游离酸时高。

最后,对底物溶液的浓度和流速进行了进一步优化;同时对反应器系统的含水量进行了监测,并通过对酸酐料液的浓度或流速进行微调的方法,有效地将有机溶液相的水分浓度控制在一定的范围(2～4mmol/L)之内,结果,dl-薄荷醇对映选择性连续酯化反应非常稳定地运行了两个月之久(转化率47～35%,光学纯度95～98% e.e.),酶反应器的半衰期超过200天。

关键词　dl-薄荷醇　对映选择性酯化　脂肪酶　连续操作1　前 言在精细化学品工业,如医药品、农用化学品、食品添加剂、功能染料及特种高分子等领域,对光学纯异构体的需求量正在迅猛增长[1,2]。

有机溶剂中脂肪酶催化的对映选择性酯化反应,因对手性醇或酸的动力学拆分非常有用而得到广泛的研究[3～8]。

但是,这些研究均局限于小规模的分批反应,尽管连续操作对工业应用非常重要。

因此,作者所在的实验室研究并报导了以硅藻土吸附脂肪酶[9]和以游离的脂肪酶[10]填充的柱式反应器进行羧酸与醇的对映选择性连续酯化反应,并发现要维持生物催化剂的生产力、延长其使用寿命,必须设法除去由酯化反应生成的蓄积在生物反应器中的水。

所以,尝试使用反应性强且反应后无水生成的酸酐取代游离的羧酸作酰化剂,构建能够长期连续运行的高性能生物反应器,对于薄荷醇等具有重要工业价值的外消旋醇的光学拆分,具有十分重要的意义。

最近,我们在补料批式反应器中使用丙酸酐作酰化剂,成功地实现了薄荷醇的高效酶促拆分,其生产力比用相应的丙酸要高出一倍之多,且重复反应中酶的稳定性大幅度提高[11]。

此外还发现,即使在有机溶剂系统那样的微水环境中,酸酐也会发生与酯化反应相竞争的酶促水解,并且消耗酶的催化功能所必需的水(图1)。

因此,对于有机溶剂中醇与酸酐的连续酯化反应,如果采用填充床反应器(PBR),那么势必会导致在反应器入口处附近酶中的水被酸1995-09-01收到初稿,1996-02-12收到修改稿酐的快速水解所消耗,而从酸酐水解产生的游离酸发生酯化反应后所生成的水则蓄积在反应器的其它部分。

所以,在酸酐作酰化剂的薄荷醇对映选择性连续酯化反应中,我们选择了连续搅拌釜式反应器(CSTR),而非填充床式反应器(PBR)。

此外,由于蛋白质在有机溶剂中不溶,常规的酶固定化手续不但没有必要,而且还会产生显著的活力损失和扩散阻碍[10],因此,我们尝试使用了直接悬浮于有机溶剂中的固态游离酶而不是固定化酶,来充当连续搅拌釜反应器中的高效生物催化剂。

图1　有机溶剂中脂肪酶催化d l -薄荷醇与酸酐的对映选择性酯化反应Fig.1　En antios elective esterification of d l -m enthol w ith acid anhyd ride catalyzed by lipase in organic solvent 2　材料与方法图2　用悬浮于有机溶剂中的游离脂肪酶构建的连续搅拌釜反应器Fig .2　A continuous stirred -tan k r eactor (CST R )w ith free lipas e sus pend ed in or ganic s olven t2.1　材料脂肪酶,日本名糖产业株式会社产品,商品名为Lipase OF360,来源于圆柱形假丝酵母Candida cylindracea,使用前不再提纯。

dl -薄荷醇和d -薄荷醇为东京化成(日本东京)产品,而l -薄荷醇为和光纯药(日本大阪)产品。

环已烷为和光纯药保证试剂,在制备薄荷醇溶液时直接使用,而在制备酸酐溶液前先经过分子筛干燥。

其余溶剂或试剂也均购自商业渠道。

2.2　批式反应脂肪酶催化的薄荷醇与酸酐批式酯化反应在每分钟摇荡120次的长颈烧瓶中进行,除非另有说明,反应混和物的一般组成如下:薄荷醇(d -,l -或dl -),100mm ol/L,丙酸酐,50m mol/L;有机溶剂,10m l;游离脂肪酶(粉末),100mg ;去离子水,10 l 。

2.3　连续反应环已烷中的游离脂肪酶催化的薄荷醇对映选择性连续酯化反应,在保温于30℃,用磁力292 高　校　化　学　工　程　学　报 搅拌的釜式反应器(其工作体积为120ml)中进行,如图2所示。

反应以半批式操作方式开始,即用一微量蠕动泵(瑞典Br omm a 公司LKB 2232型)将丙酸酐(或者游离丙酸)的环已烷溶液(约60ml)以适当的流速连续地送入盛有60ml dl -薄荷醇的环已烷溶液和2400m g 游离脂肪酶(OF 360)的反应釜中。

当薄荷醇的转化率达到45%左右时,即以一定的等体积流速同时但分别地向反应器输送dl -薄荷醇和丙酸酐(或丙酸)溶液,以开始连续反应。

在进行长期的连续操作时,对丙酸酐溶液的浓度或流速要作偶尔的微调,具体方法见下节“结果与讨论”部分中的有关描述。

由反应生成的薄荷醇酯、游离羧酸和未反应的薄荷醇组成的混合液,通过一层装填在反应器出口处的脱脂棉,逐渐地溢流到产物收集器中,以便将反应液中悬浮的酶粒子过滤并截留在反应器中。

2.4　定量分析反应生成的酯和残留的薄荷醇用气相色谱进行分析定量。

色谱柱采用1.0m 长的玻璃柱,固定相为吸附于担体Chr omosorb W AW DM CS (80/100目)的硅酮SE-30。

载气:N 2,60m l /min ;进样温度:300℃检测器:FID ,280℃;内标:正十七烷;升温程序:60～240℃,20℃/min 。

实验所观察到的各峰保留时间如下:薄荷醇,3.3min ;薄荷醇丙酸酯,4.8min ;正十七烷6.8m in 。

由dl -薄荷醇生成的酯,以正已烷/乙酸乙酯(10:1,V /V )作淋洗剂进行硅胶柱色谱分离之后,配制成约1.0%(W /V )的乙醇溶液,用DIF-140型旋光仪(日本光谱公司生产)测定其比旋光度,以便计算其光学纯度(%e .e .)。

计算中采用从纯l -薄荷醇合成的纯l -薄荷醇丙酸酯的比旋光度(实测值:-81.3°)作为标准。

反应过程中有机溶液相的水分含量使用卡尔-费歇微量水分滴定仪(日本京都电子株式会社生产,M KC-210型)进行测定。

3　结果与讨论3.1　有机溶剂和反应温度的影响表1　有机溶剂对酶性能的影响a )T able 1　Effect of organic solvents on enzyme performance 溶剂相对活力b)对映选择性c)稳定性d)正已烷1006699环已烷997396异辛烷936096四氯化碳776890异丙醚286286苯263069a )反应条件:100mm ol /L d -或l -薄荷醇,50mm ol /L 丙酸酐,100mg 脂肪酶,10 l 去离子水,10m l 有机溶剂;30℃,24h 。

b)相对活力测定采用纯l -薄荷醇作底物,根据其转化率计算。

c)分别以l -薄荷醇和d -薄荷醇作底物,计算二者的转化率之比。

d )以l -薄荷醇为底物,计算其第二批反应的转化率与第一批之比。

图3　反应温度对酶活性和选择性的影响Fig.3　Effects of reaction temper ature on activityan d s electivity of the en zyme批式反应:l -或d -薄荷醇,100m mo l/L;丙酸酐,50m mo l/L ;去离子水,10 l;环已烷,10m l;脂肪酶(OF 360),100m g;a)对映选择性指纯l -薄荷醇与纯d -薄荷醇的转化率之比。

在进行CSTR 连续反应之前,首先在小规模(10ml)批式酶促酯化反应中,分别以纯l -薄荷醇和纯d -薄荷醇作底物,考察了各种有机溶剂对所用脂肪酶(OF 360)的活性、对映选择性和稳定性的影响,结果如表1所示。

在反应中之所以选用丙酸酐作酰化剂,是因为它所给293 非水相酶促酯化法拆分dl -薄荷醇的连续操作出的反应性和选择性在几种酸酐中均较高之故。

游离脂肪酶在某一有机溶剂中的相对活性用纯l -薄荷醇反应的转化率来衡量,而酶的对映选择性则从纯l -薄荷醇的转化率与纯d -薄荷醇的转化率之比来估算。

在l -薄荷醇的第一次批式反应之后,立即将脂肪酶回收,并在同一溶剂中进行第二次反应,以评价酶在其中的稳定性。

从表1中的结果可以看出,正已烷给出的活性和稳定性最高,而环已烷给出的对映选择性最高,同时活性与稳定性也很好。

因此,我们最终选择了环已烷作为薄荷醇连续拆分的反应介质,以期取得满意的选择性。

对反应温度的影响也进行了类似的考察,结果如图3所示。

可见,不论是酶的活性还是酶的对映选择性都显著依赖于反应的温度,在30℃左右为最佳。

因此,在以后的薄荷醇连续酶促拆分中,反应温度被一直保持在30℃。

图4　作为酰基给体的酸酐与游离酸在连续酯化反应中的比较Fig .4　Comparis on of acid anhydride with free acid as acyl donors in continuous esterification reactions dl -薄荷醇,400m mo l/L ,脂肪酶,2400m g;工作体积120ml (○,□, )丙酸酐　180m mo l/L ,空速0.10d -1(●,□, )丙酸360mm ol/L,空速0.10d -1(↓↓)连续反应的开始3.2　CSTR 中非水相游离酶催化的对映选择性连续酯化 首先,在连续搅拌釜式反应器(CST R)中使用悬浮于环已烷的游离脂肪酶,进行了薄荷醇与丙酸酐的对映选择性连续酯化反应。