丹皮酚协同顺铂抗人宫颈鳞癌SiHa细胞及其机制_李秉枢

丹 皮 酚 （paeonol，Pae）为 中 药 牡 丹 皮 的 主 要 活 性 成分，药理研究表明，牡丹皮的有效成分具有与非甾 体类消炎药相似的药理作用，如解热镇痛、抗炎、免 疫调节、抑制血小板聚集、抗血栓形成和中枢抑制作 用等[1~5]。 近年来研究发现丹皮酚具有较好的抑制肿 瘤活性[6~10]及抗血管生成作用[11]。 宫颈癌是女性最常 见的生殖道恶性肿瘤， 其病死率居女性肿瘤病死率 的 第 二 位 ，是 严 重 威 胁 妇 女 健 康 的 主 要 疾 病 之 一 [12]。 以顺铂（CDDP）为基础的化疗是目前宫颈癌的基 本 治疗方案， 但 CDDP 严重的毒性作用及长期应用易 产生耐受性限制了其临床应用及疗效的进一步提 高 ，因 此 临 床 上 主 张 联 合 用 药[13]。 本 研 究 旨 在 探 讨 Pae 联 合 CDDP 对 人 宫 颈 癌 SiHa 细 胞 的 生 长 抑 制 作用及其作用机制。
应用 SPSS13.0 统计软件进行统计学处理,计量 资料采用 x±s 表示，采用 t 检验或单因素方差分析， 两两比较采用 SNK 法和 Dunnett 法。 P<0.05 为差异 有统计学意义。
2结果
2.1 Pae 与 CDDP 单 独 应 用 对 SiHa 细 胞 的 增 殖 抑 制作用
Pae 在 18.75 ～300mg/L 浓 度 范 围 内 ，CDDP 在 0.625～10mg/L 浓度范 围内对 SiHa 细胞 的增殖均 有 抑制作用，且药物浓度越高，作用时间越长，其抑制 作用越强， 呈现明显的剂量和时间依赖效应关系。 18.75mg/L 的 Pae 作用 24h 后对 SiHa 细胞的抑制率 仅 4.94% ±0.63％ ，0.625mg/L 的 CDDP 作 用 24h 后 对 SiHa 细胞的抑制率仅 4.01%±0.54%，与对照组比 较 均 无 统 计 学 差 异 （P>0.05）；而 300mg/L 的 Pae 作 用 72h 后对 SiHa 细 胞的抑制率 达 89.54%±1.52％， 10mg/L 的 CDDP 作用 72h 后对 SiHa 细胞的抑制率 达 90.14%±1.19％， 与对照组比较均有统计学差异 （P<0.01）。 见表 1、2。 2.2 Pae 与 CDDP 联合应用对 SiHa 细胞增殖的影响
取对数期生长细胞，常规消化后，以 1×106/瓶接 种于培养瓶中，待全部细胞贴壁后，换成无血清 RPMI 1640 培养液继续培养 24h，使细胞同步于静止期
846
(G0 期)，75mg/L Pae、5mg/L CDDP、75mg/L Pae+5mg/L CDDP 为实验组，不加药、加等体积的培养液为对照 组，继续培养 24h，收集细胞。 按 Annexin-Ⅴ-FITC 试 剂盒说明操作： 用冷的连接缓冲液调整细胞数目为 105~106/ml, 取此细胞悬液 195μl，加入 5μl AnnexinⅤ-FITC(一种磷脂结合蛋白)溶液和 10μl PI(20μg/ml 碘化丙啶)溶液，缓缓混匀，于冰上避光孵育 10min， 在样本中加入 150μl 冷的结合缓冲液。 1h 内用流式 细胞仪 Cell Quest（FCS Express V3）软件检测细胞凋 亡和死亡情况， 并进行分析。 结果判断： 活细胞， FITC-/PI- ； 坏 死 细 胞 ，FITC-/PI+ ； 凋 亡 细 胞 ，FITC+/ PI-；凋亡后继发死亡的细胞，FITC+/PI+。 细胞凋亡 率 （%）=（凋亡细胞+继发死亡 细胞）/全部 细胞数× 100%。 1.3 统计学处理
1 材料与方法
1.1 材料及试剂 人宫颈鳞癌细胞株 SiHa 购于 武汉大学典 型培
通讯作者：洪 莉 收 稿 日 期 ：2010-08-05 ；修 回 日 期 ：2010-09-16
肿瘤学杂志 2010 年第 16 卷第 11 期
养物保藏中心。 Pae 注射液：宁波天真制药有限公司 （规 格 5mg/ml，批 号 20090404)；CDDP 注 射 液 ：齐 鲁 制药有限公司 （批号 9120311DB）；RPMI 1640 培养 液购于 HyClone 公司（批 号 NUL0212）；胰蛋白 酶购 于美国 Gibco 公司；胎牛血清购于 HyClone 公司（批 号 NUCO153）；MTT 购于美国 Sigma 公司：用 pH 7.4 的 PBS 溶解(5mg/L)，过滤除菌，置棕色小瓶中 4℃冰 箱保存，两周内有效。 DMSO 购于美国 Sigma 公司； 凋亡检测试剂盒（Annexin-Ⅴ-FITC）购于上海炎彬化 工科技有限公司 （产品号：401002-50assays， 批号： 9211218）。
MTT 结果显示不同浓度的 Pae 与 CDDP 联合应 用时，Pae 能明显提高 CDDP 对 SiHa 细胞的增殖抑 制作用， 联合用药组与同等剂量 CDDP 各单药组比 较，具 有显著性差 异（P＜0.05）。 当 18.75、37.5、75mg/ LPae 分 别 与 2.5、5、10mg/L CDDP 联 用 时 两 药 具 有
SiHa 细 胞 培 养 于 含 10% 胎 牛 血 清 的 RPMI 1640 培 养 基(内 含 青 霉 素 100IU/ml、链 霉 素 100μg/ ml)中，5% CO2 条件下 37℃恒温培养箱中培养。 生长
8ogy,2010,Vol.16,No.11
肿瘤学杂志 2010 年第 16 卷第 11 期
协同作用(CDI<1)或显著协同作用(CDI<0.7)。见表 3。 2.3 细胞凋亡的检测
Annexin-Ⅴ/PI 双 染 及 流 式 细 胞 仪 检 测 结 果 显 示： 各实验组细胞凋亡率与对照组比较均有显著性 差异（P<0.01）；75mg/L Pae 组细胞凋亡率为 8.26%± 1.12% ，5mg/L CDDP 组 细 胞 凋 亡 率 为 29.62% ±
丹皮酚协同顺铂抗人宫颈鳞癌 SiHa 细胞
及其机制
专
题
The Synergistic Effect of Paeonol Combined with Cisplatin in Human Cervical Squamous Cell
报
Carcinoma Cell Line SiHa and its Mechanism∥LI Bing-shu, FU Qiong, CHENG Yan-xiang, et al.
表 1 Pae 对宫颈鳞癌 SiHa 细胞增殖的影响
Pae 浓度（mg/L） 24h
抑 制 率 （%）
48h
72h
0 18.75 37.5
75 150 300
-
4.94±0.63 9.98±0.64a 24.47±1.00a 42.78±2.65a 57.89±2.00a
CO2 培养箱:德国 BINDER；净化工作台:苏净集 团；倒置式显微镜：日本 OLYMPUS EL301 型；EL301 Strip reader(酶 标 仪)：美 国 BW-Tek 公 司 产 品 ；流 式 细胞仪： 美国贝克曼库尔特公司； 低温高速离心机 (Heraeus)。 1.2 方 法 1.2.1 细胞培养
采用两药相互作用指数 (coefficient of drug interaction，CDI ) 评 价 Pae 与 CDDP 相 互 作 用 性 质 ， CDI 按下列公式计算：CDI=AB/(A×B)。根据活细胞数 (吸光度值)进行计算，AB 为两药联合组与对照组吸 光度值的比值；A 或 B 是各药物单独使用组与对照 组吸光度值的比值。 当 CDI<1， 两药作用性质为协 同，CDI<0.7 时协同作用非常显著；CDI=1，两药作用 性质为相加；CDI>1，两药作用性质为拮抗。 1.2.5 流式细胞仪 检测细胞凋 亡(Annexin-Ⅴ-FITC/ PI 双染色法)
2～3d，0.25%胰蛋白酶消化传代。 取对数生长期细胞 用于实验。 1.2.2 MTT 比色法分析 Pae、CDDP 单药对 SiHa 细胞 增殖的影响
取对数生长 期的细 胞 ， 以 5×104 个/ml 接 种 于 96 孔平底培养板中，每孔 100μl，24h 更换培养液后 加入不同浓度的药物 200μl。 实验分为空白组(只加 10%小牛血清 RPMI 1640 培养液不加细胞， 用于调 零)、 实验组 (加入 Pae 浓度分别为 18.75、37.5、75、 150、300mg/L，CDDP 浓 度 分 别 为 0.625、1.25、2.5、5、 10mg/L)和 对 照 组(不 加 药 物 的 细 胞 ，加 入 等 体 积 的 10%小 牛 血 清 RPMI 1640 培 养 液)， 每 组 设 6 个 复 孔 ； 分 别 培 养 24h、48h、72h 后 加 入 MTT 液 20μl (5mg/ml)，置于 37℃、5% CO2 的培养箱内孵育 4h。 吸 弃孔中的培养上清，每孔加入 150μl DMSO，震荡混 匀 10min，溶解形成 结晶，待结晶 完 全 溶 解 后 比 色 。 在酶 联免疫 检 测 仪 上 选 择 波 长 570nm 处 测 定 各 孔 吸光度 值(A)，实验重复 3 次。 计算抑 制 率 ：抑 制 率 (%)=(1-实验组平均 A 值/对照组平均 A 值)×100%。 1.2.3 MTT 比色法分析 Pae 联合 CDDP 对 SiHa 细胞 增殖的影响
实 验 分 为 空 白 组 ( 只 加 10% 小 牛 血 清 RPMI 1640 培养液不加细胞，用于调零)，实验组(CDDP 单 独 或与不同浓 度丹 皮 酚 联 合 用 药 ，CDDP 浓 度 分 别 为 2.5、5、10mg/L， 加 入 Pae 浓 度 分 别 为 0、18.75、 37.5、75mg/L)和对照组(不 加 药 物 的 细 胞 ，加 入 等 体 积的 10%小牛血清 RPMI 1640 培养液)，每组设 6 个 复孔；分别培养 48h 后，测定各孔吸光度值，实验重 复 3 次。 方法同上。 1.2.4 药物联合作用评价