多重快速鉴别病原微生物的新技术_xMAP液态芯片

文章编号:100028020(2007)0620759204・综述・多重快速鉴别病原微生物的新技术:xM AP 液态芯片胡瑞　综述　王景林1　审校西北农林科技大学动物科技学院,杨凌　712100摘要:多指标同步分析(Flexible Multi 2Analyte Profiling ,xM AP )液态芯片技术是美国Luminex 公司近年来开发的一种新型生物芯片技术。

这种基于微球的芯片技术能够对单孔内多达100种不同的反应同时进行检测,与固相芯片或片膜芯片相比,具有多重、快速、灵敏度高(可达0101pg )、重复性好(C V <5%)以及检测动态范围宽(可达012～32000pg Πml )等优点。

目前,该技术已被广泛应用于各研究领域,尤其在核酸、蛋白质和其他生物分子的大规模分析中。

关键词:多指标同步分析　液态芯片　微球　病原微生物　检测中图分类号:R15114 文献标识码:AA rapid ,multiplexed ne w technology xMAP liquid chip fordetection and identification of pathogensHU Rui ,WANG JinglinC ollege of Animal Science and T echnology ,N orthwest A &F University ,Y angling 712100,ChinaAbstract :xM AP liquid chip is a new biochip technology developed by the Luminex corporation in recent years.This chip technology based on microsphere is capable of simultaneously detecting up to 100different analytes in a single reaction vessel.In com parition with the s olid chip or membrane chip ,it possesses the features of multi 2analytes ,high sensitivity(0101pg ),g ood reproducibility (C V <5%),wide channel (012-32000pg Πml ),and s o on.F or these advantages ,the xM AP liquid chip technology has been used in many fields ,especially in the analysis and identification of nucleic acid ,protein or other biological m olecules.K ey w ords :xM AP liquid chip ,microsphere ,pathogens ,detection基金项目:国家863计划资助项目(N o.2006AA06Z 414);国家自然科学基金资助项目(N o.30671824)作者简介:胡瑞,男,硕士研究生,研究方向:分子病原学与免疫学,E 2mail :hurui 2a @1通讯作者:王景林,军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室,E 2mail :wangjlin @bm ,wangjl6481@ 目前,基于微生物学、免疫学、生物化学和分子生物学发展起来的病原微生物检测方法大致有以下几种:培养法、最大可能数法(Maximum Probable Number ,MPN )、免疫学方法、聚合酶链反应(PCR )和多重PCR (multiplex PCR )、实时定量PCR (real 2time PCR )、寡核苷酸芯片检测法等。

这些常规方法在病原检测中发挥作用,但上述方法也存在一定缺陷,如分离培养方法操作过程繁琐,灵敏度低;PCR 只可对单一病原进行检测,且存在非特异性结合,以及假阴性和假阳性等问题;多重PCR 虽可对几种病原进行检测,但因引物的不兼容性和高背景扩增等因素,影响了多重PCR 的可重复性;目前采用的寡核苷酸芯片技术均是以固相载体为支持物的片膜芯片,虽然检测信息量大,但检测时会受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响,重复性不好,且无法实现定量检测。

病原微生物的传统检测方法由于上述缺陷往往会延误疾病的诊断、治疗及感染的控制,已经越来越不能满足现代检测的要求。

因此,对于病原微生物急需开发一种快速、准确、灵敏度高、特异性强、高通量的检测技术,这不但可以有效预防和控制感染性疾病的发生,对于疾病的监测、临床诊断及治疗也有着很重要的指导意义。

1　xMAP 液态芯片技术20世纪90年代中期,美国Luminex 公司将流式细胞仪、数字信号处理器和一种激光检测装置相结合,开发了一种具有多指标同步分析(xM AP )功能的芯片技术[1],也称为液态芯片(liquid chip )或悬浮芯片(suspension array )。

xM AP 液态芯片技术是对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模分析的一种新型检测技术,利用这种技术可实现对一份微量样品同时进行多达100种不同分析指标的检测,具有快速、操作简单、灵敏度高、重复性好、高通量等特点。

该项技术不仅是病原、细胞因子、抗体等检测分析的重要工具,在基因表达和基因型分析研究中也有着不可估量的应用潜力。

作为一种大规模的生物检测平台,它的优越性是其他现有的检测技术无法取代的,具有非常广阔的发展前景。

目前,xM AP 液态芯片技术在国内的发展还刚刚起步,未得到足够的重视。

国外利用此项技术已经开发了肿瘤标志第36卷　第6期2007年　11月卫　生　研　究JOURNA L OF HYGIE NE RESE ARCH V ol.36　N o.6N ov.　2007759物、过敏原筛查、自身免疫病、细胞因子等诊断微球,并且,2001年被美国食品及药物管理局(FDA )批准用于临床进行自身免疫病、人类白细胞抗原分型的诊断,这也是唯一被美国FDA 批准用于临床诊断的生物芯片[2]。

它的开发及应用被认为是生物芯片领域发展的一个重要进展,对开展病原微生物的快速鉴别、定量检测、临床诊断、食品安全控制等具有十分重要的意义。

2　xMAP 液态芯片基本原理xM AP 液态芯片技术与传统意义上的固相生物芯片技术有所不同,该技术以流式细胞仪作为检测平台,创新性地将微球体作为反应的载体,并将反应置于液相环境中进行。

首先,通过红色和橙色两种不同的荧光染料(每种荧光有10种不同的浓度)按照不同比例混合将直径为516μm 的聚苯乙烯乳胶微球(microspheres )染成100种颜色,即得到100种不同地址标记的微球。

每一种微球表面都带有活性羧基化基团,氨基标记的寡核酸探针就可通过化学反应共价结合到微球表面,蛋白也可以通过氨基与微球进行耦联。

每种编码的微球可共价结合并携带一种可以捕获相应目标分子的生物探针,如抗原、抗体、核苷酸片段、受体、酶等。

应用时,把针对不同检测物的寡核苷酸探针或蛋白质探针与羧基化的微球进行共价耦联,然后,使载有多种不同探针的微球混合物与待测标本在悬液中相互作用,特异性地结合待测样本中的目标分子(附图),并加上荧光标记。

由于不同编码的乳胶微球可以放在同一个反应体系内,所以一小份样本可以被用来检测上百个指标[3]。

(左:双抗体夹心法检测抗原;右:杂交法检测核酸)附图　xMAP 液态芯片技术原理示意图Figure Schem atic m ap of xMAP liquid chip 流式细胞仪和数字信号处理器是主要的检测和分析设备,可对多种微球进行实时检测。

检测时,多种不同的微球排成单列通过两束激光对待测物进行检测,一束激光通过识别微球产生的特异性荧光从而区分是何种微球,并进而确定检测的是何种分子,即定性;另一束激光测定微球表面发生生物学反应后所产生的荧光信号强度从而决定待测物的量,即定量。

所得到的数据经电脑处理后,结合软件分析即可直接用来判断结果。

3　xMAP 液态芯片的技术优势311　灵敏度高在反应体系中,由于每个乳胶微球表面都包被上许多核酸分子或抗原、抗体,通过反应产生较强的信号,再加上激光检测技术的使用使检测更加精确、可靠,用极少量的样本就可进行检测。

该技术的敏感性要优于常规检测方法,也高于常用的一些固相芯片检测方法,其灵敏度可达到0101pg 。

312　重复性好,线性范围宽xM AP 液态芯片技术由于利用微球在溶液中反应,克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响,检测结果可靠稳定,大大提高了样品检测的重复性。

检测的重复性可以达到90%以上,并且线性范围也很宽,可以达到012～32000pg Πml [4]。

313　快速省时由于核酸杂交或免疫反应在均相的液体环境中进行,既有利于保持蛋白分子的天然构像,又有利于微球探针和待检测物的杂交反应,且反应后常不用洗涤就可以直接进行检测并得出结果,操作也比较简单,在一定程度上减少了反应所需时间,在35～60min 内便可完成检测,所以检测效率大大高于固相杂交。

目前,利用此项技术检测分析荧光微球的速度最高可达5000个Π秒。

314　高通量这种“多功能多指标同步分析”的技术与传统的单一检测760 卫 生 研 究第36卷方式有着很大的差别。

通过在同一反应体系中放入许多不同编码的微球,100种微球就可以标记上100种不同的探针分子,而每种编码微球对应一种待测指标,所以一次反应就可对一小份样品同时进行多达100种分析指标的检测,标本利用率大大提高,从而实现生物样品的高通量分析。

4　xMAP液态芯片技术的应用由于xM AP液态芯片技术具有高通量、特异性强、快速、灵敏等一系列优点,国外已经将该技术用于高通量核酸检测[5]、单核苷酸多态性(single nucleotide polym orphism,S NP)分析、过敏原筛查、自身免疫病、基因突变和基因表达的检测、抗癌药物筛选、激素水平的测定[6]、核受体与配体相互作用的分析[7]、单克隆抗体的筛选[8]、肿瘤标志物以及关键生物分子如抗原、抗体、细胞因子[9]等的表达或活动水平的变化等研究,并逐步用于临床诊断。

411　细菌及毒素的检测自1977年美国科学家报道了液态芯片技术在免疫检测上应用以来,该技术应用范围越来越广泛。

SPIRO等采用xM AP液态芯片技术检测了土壤、地下水等环境中微生物特异核酸序列[10]。