农产品质量安全快速检测技术_微波辅助水解比色法快速测定动物水解蛋白中羟脯氨酸的研

Ding Yi1, Wang Xinghua1, Guo Qiangwei1, Song Dan1, Gao Dejiang2, Yu Yong3* (1College of Chemistry, Jilin University, Changchun, 130012 2Changchun Jilin University - Little Swan Instruments Co., Ltd. Changc-
可能违法添加的非食用物质名单（第二批）》也明确 将皮革水解蛋白列入其中。
羟脯氨酸 (4-hydroxyproline) 作为氨基酸的主 要组成部分而存在胶原蛋白中，约占胶原蛋白总量 的 10% 左右 [2]，但并不存在于一般的蛋白质中。因此， 定量测定样品水解后的羟脯氨酸可以判断奶粉中是 否添加了动物水解蛋白。目前羟脯氨酸的测定方法 主要有比色法 , [3,4,5] 胶束电动色谱 [6]，氨基酸自动分
hun, 130012 3College of Instrumentation & Electrical Engineering, Jilin University, 130012 )
Abstract A rapid determination method for 4-Hydroxyproline of hydrolyzed collagen was developed, based on microwave-assisted hydrolysis and colorimetric method. In this paper the influence effects were investigated, such as microwave-assisted hydrolysis conditions (the concentration of H2SO4, volume of H2SO4, hydrolysis time and microwave power) and color development conditions (oxidation time, oxidation temperature, color developing time). The results showed that microwave-assisted hydrolysis had the same precision and accuracy compared to traditional hydrolysis method. However, the hydrolysis time by microwave-assisted hydrolysis was reduced from 16 h to 4~8 min. The novel rapid analyzer and reagent kit for 4-Hydroxyproline designed by Jilin University - Little Swan Instruments Co., Ltd. was used to detect 4-Hydroxyproline. It was found that at the concentration range of 0.10×10-3 g/L~2.50×10-3 g/L, the absorbance and concentration of 4-Hydroxyproline has a good linear relationship, and the recovery rate between 90% and 105%.
羟 脯 氨 酸 快 速 检 测 仪（长 春 吉 大·小 天 鹅 仪 器 有 限 公 司），GDYQ － 708S 快 速 恒 温 水 浴 锅（长 春 吉 大·小 天 鹅 仪 器 有 限 公 司），微 波 炉 ( 格 兰 仕 P7021TP-6)，JB/T5374-1991 电子天平 ( 梅特勒－ 托利多仪器上海有限公司 )，UV － 1700 紫外可见 分光光度计（日本岛津公司）, 干燥箱。
收稿日期：2010-11-01 基金资助：质检公益性行业科研专项（200810474）；国家科技支撑计划项目（2006BAJ02A07-3） 通讯作者：于永（1980-），男，博士，讲师，主要从事分析检测技术及仪器的研究
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Modern Scientific Instruments
No.1 Feb. 2010
第1期2011年2月
现代科学仪器
No.1 Feb. 2011
Modern Scientific Instruments
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农产品质量安全快速检测技术
——微波辅助水解比色法快速测定动物水解蛋白中羟脯氨酸的研究
丁毅 1 王兴华 1 郭蔷薇 1 宋丹 1 高德江 2 于永 3* (1 吉林大学化学学院 长春 130012;2 长春吉大·小天鹅仪器有限公司 长春 130012;
本文将微波辅助水解技术及所研制的羟脯氨酸 专用检测仪用于动物水解蛋白及合成样品中羟脯氨 酸的测定，将传统样品前处理需要 16 h 的工作缩减 至 4 ～ 8 min，大大提高了检测速度，检测结果令人 满意，为奶粉中掺假动物水解蛋白的检测提供了一 种全新的样品前处理方法和检测设备。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
3 吉林大学仪器科学与电气工程学院 长春 130012）
摘 要 本文研究了一种微波辅助水解比色法测定动物水解蛋白中羟脯氨酸的快速检测方法及仪器。考察了微波辅助水 解（硫酸浓度、体积、微波时间、功率）及比色条件（氧化温度、时间、显色时间）对样品水解和羟脯氨酸测定的影响。结 果表明：通过微波辅助水解法对动物水解蛋白水解 4 ～ 8 min 与传统加热水解 16 h 所得的羟脯氨酸含量基本相同，将样品前处 理时间从 16 h 缩短到 4 ～ 8 min。采用吉大·小天鹅所研制的新型羟脯氨酸快速检测仪及其配套试剂盒进行测定，羟脯氨酸在 0.10×10-3 g/L ～ 2.50×10-3 g/L 浓度范围内，其吸光度与浓度具有良好的线性关系，加标回收率 90% ～ 105%。该方法可 判断掺假奶制品中是否添加了动物水解蛋白。
第1期2011年2月
丁 毅 等 ：农产品质量安全快速检测技术
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方便。检测器采用 TSL 系列集成光频转换器，将接 收到的光信号直接变为频率输出传送给微控制器， 具有响应快、重复性好、不易疲劳和老化等优点。
1.2.2.1 仪器的原理
通过被测物质与显色剂的反应产物在可见光区 吸收光谱的特性来定性鉴别被测物质，通过朗白比 尔定律来测定被测物质含量。 1.2.2.2 仪器的结构
仪器由超高亮 LED 光源、集成光电传感器、圆 柱形比色瓶、微控制器、LCD 显示模块、微型打印机 和按键等构成（仪器的硬件结构和光路图如图 1、2 所示）。光源采用中心波长为 560nm 超高亮发光二 极管，既做光源又做单色器，其使用寿命 10 万小时， 功耗为毫瓦级，解决了传统分光光度计中钨灯光源 使用寿命短、功耗大、抗干扰等缺点。比色瓶采用圆 柱形结构，既可作反应容器又可用作比色容器，操作
采用改装家用微波炉，微波炉的大火功率约为 700 W。准确称取 0.1 g 左右动物水解蛋白或 0.5 g 左 右 奶 粉 样 品 ( 相 当 于 50 ～ 150 mg 蛋 白 质 ) 于 250 mL 锥形瓶中，加入一定体积、一定浓度的硫酸， 放入微波炉中选择适当火力微波 4 ～ 8 min。趁热 将水解产物转移至 250 mL 容量瓶中，用 10 mL 水 解 酸 分 三 次 洗 涤 锥 形 瓶，用 水 定 容，摇 匀。 准 确 移 取 2 ～ 8 mL 上述溶液于 100 mL 容量瓶中，用水定 容 ( 羟 脯 氨 酸 含 量 为 0.10×10-3 g/L ～ 2.50×10-3 g/L)，为待测液。 1.2.2 羟脯氨酸快速检测仪
析仪法 [7], 结缔组织胶原的自体荧光法 [8], 高效液相 色谱法 [9,10] 等。其中，比色法最为普遍，其原理是在 盐酸或硫酸中水解样品，用氯胺 - Ｔ氧化羟脯氨酸 生成吡咯环物质，然后以高氯酸溶液除去剩余的氯 胺 -T，加入对 - 二甲氨基苯甲醛显色剂，生成红色 复合物，在 558 nm 处测定其吸光度。此方法已作为 标准方法用于肉及肉制品中羟脯氨酸含量的测定 [3]。 虽然这种方法可以准确的测定羟脯氨酸的含量，但 样品水解过程非常耗时（16 ～ 24 h），难以实现快速 测定。
Key words Hydrolyzed collagen;Microwave-assisted hydrolysis;Rapid detection analyzer
动物水解蛋白是将胶原蛋白水解制成的，工业 上将牛皮及其制品的下脚料等成分粗加工后即可制 成动物水解蛋白。它不仅是一种廉价的工业原料而 且营养价值低，由于胶原蛋白质氨基酸中缺少赖氨 酸、色氨酸和硫氨基酸，人们在食用这类蛋白时，会 导致消化不良，影响健康状况 [1]。近几年，一些不法 商人在奶粉中加入动物水解蛋白以次充好。自 2008 年“三聚氰胺”事件爆发后，卫生部发布的《食品中
关键词 动物水解蛋白 ; 微波辅助水解 ; 快速检测仪 中图分类号 Q816
Rapid Detection Technology of Agricultural Products for Quality and Safety
——Rapid Determination 4-Hydroxyproline of Hydrolyzed Collagen by Microwave-assisted Hydrolysis and Colorimetric Method
溶解 ( 临用前配制 )。 羟脯氨酸试剂 ( 二 )：称取 10.0 g 对二甲氨基
苯甲醛，用 35 mL 高氯酸溶液［6( 临用前配制 )。
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理
1.2.1.1 传统湿法水解
传统湿法水解样品是已应用于食品中羟脯氨 酸测定的样品前处理过程 。 [5,10] 准确称取 0.1 g 左 右 动 物 水 解 蛋 白 或 0.5 g 左 右 奶 粉 样 品 ( 相 当 于 50 ～ 150 mg 蛋白质 ) 于 250 mL 锥形瓶中，加入 30 mL 3 mol/L 硫酸 , 用表面皿盖住，于 105℃干 燥箱内恒温 16h。趁热将水解产物转移至 250 mL 容量瓶中，用 10mL 3mol/L 硫酸分三次洗涤锥形 瓶，用水定容，摇匀。准确移取 2 ～ 8 mL 上述溶液 于 100 mL 容量瓶中，用水定容 ( 羟脯氨酸含量为 0.10×10-3 g/L ～ 2.50×10-3 g/L) ，做为待测液。 1.2.1.2 微波辅助水解法