第六章 聚合酶链反应
聚合酶链反应
引物５′端 可被修饰：加酶切位点、标记生物素等 引物之间 不应互补，尤应避免３′端的互补 引物自身 不应存在互补序列
三、 PCR扩增产物分析
疑胶电泳分析法 通过凝胶电泳检测扩增产物片段大小，若特异扩 增出一条带，该法即可判断结果。
注意平行对照：
• DNA分子量标准物 阳性对照 阴性对照 内参照
变性、退火及延伸的温度与时
间、循环次数
模板 primers water
PCR反应体系---模板
DNA、RNA
影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度，样品尽量纯 净，不要有核酸酶、蛋白水解酶等的污染；一般反应中的 模板数量为102 ～105 个拷贝
PCR反应时模板应充分变性
模板量过多可能增加非特异性产物。
基因 片段长 位点 度（bp）
CCATACCGACCACACCGACGA 51～71 147
GGTAGTTGGTCGTTCGCGGAC 166～198
引物设计应注意的问题
以电脑软件指导引物设计。 引物长度 15～30个碱基 G+C含量 40%～50%为宜 4种碱基随机分布 尽量避免＞4个单一碱基连续排列 引物3′端 尽量不选用T碱基 ，不能进行修饰，不终止于
• 一般用量0.5～2.5U/50ul，酶量过多易导致非特
异性产物
Taq DNA聚合酶
• 分离:1969年，美国黄石国家公园 温泉
• 分子量:94KDa • 活性：在几种水生栖热菌中活性最
高，200 000U/mg
thermostable DNA polymerases
①Taq DNA polymerase ②Tth DNA polymerase—from T.thermophilus ③VENT DNA polymerase—from T.litoralis ④Sac polymerase ⑤pfu polymerase
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA 混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2)由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4)生成大量DNA以进行序列测定；(5)突变的分析；(6)染色体步移；(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μldNTP mix （2mM） 4 μl引物1（10pM） 2 μl引物2（10pM） 2 μlTaq酶（2U/μl） 1 μlDNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl加ddH2O至 50 μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
聚合酶链式反应
定义（英文全称：Polymerase Chain Reaction），性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。
到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。
编辑本段技术原理复制成同样的两分子挎贝。
在 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
编辑本段反应五要素 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)编辑本段PCR反应条件的选择 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
编辑本段酶及其浓度2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
聚合酶链反应的原理和过程
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的原理和过程1. 引言聚合酶链反应（PCR）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，能够在体外迅速扩增特定DNA片段。
PCR的原理基于DNA的复制过程，通过重复进行一系列的温度变化和酶催化反应，使得DNA模板序列得以扩增。
PCR技术的发展极大地促进了基因组学、遗传学、医学诊断和犯罪学等领域的研究。
2. PCR的基本原理PCR技术借助于DNA聚合酶这个酶来实现DNA片段的扩增。
其基本原理可以概括为三个步骤：变性、退火和延伸。
2.1 变性首先，在高温条件下（通常为94-98摄氏度），将待扩增样品中的双链DNA解链成两条单链模板。
这一步被称为变性（Denaturation），其目的是打破氢键连接，使双链DNA分离成两条单链。
2.2 退火接下来，在较低温度（通常为50-65摄氏度），通过引入一组特异性的引物（即寡核苷酸引物，通常为20-30个碱基），使其与目标DNA序列的两端互补结合。
这一步被称为退火（Annealing），其目的是将引物定位在待扩增的DNA序列上。
2.3 延伸最后，在适宜温度下（通常为72摄氏度），加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），使其沿着引物向3’端延伸，合成新的DNA链。
这一步被称为延伸（Extension）或扩增，其目的是合成与模板DNA相对应的新链。
通过重复进行上述三个步骤，PCR技术可以在相对短的时间内从少量起始DNA扩增出大量特定片段的DNA。
3. PCR反应体系PCR反应体系由以下几个关键组分组成：3.1 DNA模板PCR反应需要待扩增的DNA片段作为模板。
模板可以是从细胞提取得到的基因组DNA、cDNA、质粒等。
3.2 引物PCR反应需要两条引物，分别位于待扩增序列的两端。
引物是由碱基组成的短链RNA或DNA分子，具有与待扩增序列互补的碱基序列。
引物的设计十分重要，需要确保其与待扩增序列的特异性结合，避免与其他非目标DNA结合。
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应简介聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因分析、基因工程、医学诊断等领域。
PCR 能够快速、高效地扩增特定DNA片段，使得原本数量有限的DNA样本得以增加，从而便于进行后续实验。
PCR的核心原理是利用DNA聚合酶酶活性，通过不断重复三个步骤（变性、退火、延伸），在适宜的反应条件下，将目标DNA序列扩增至数百万份的数量。
依靠PCR技术，无需使用传统的细菌培养方法，仅需少量DNA样本和简单的实验设备，即可实现高效扩增目标DNA。
PCR反应步骤反应体系构建PCR反应所需的关键成分包括目标DNA模板、DNA聚合酶、引物（primer）、核苷酸和反应缓冲液。
引物是一对短的DNA片段，其序列与目标DNA序列上的起始和终止部分的互补序列匹配。
反应缓冲液是维持PCR反应过程中所需酶活性的化学平衡和适宜pH的缓冲物质。
变性PCR反应开始时，反应体系中的DNA样本被放置在高温环境中（通常为94-98摄氏度），使其双链DNA解离为两条单链DNA。
这个步骤可以通过加热反应体系来实现，高温会断裂氢键，使DNA的双链解开。
退火在反应体系降温至适宜的温度范围时（通常为50-65摄氏度），引物与目标DNA序列上的互补区域结合形成稳定的双链结构。
引物的选择非常重要，其应与目标DNA序列完全匹配，以确保选择性扩增。
延伸DNA聚合酶将新的核苷酸从反应缓冲液中获得，并在目标DNA的3’末端上依次加入。
这个过程被称为延伸，其速率与延伸温度和所用聚合酶的酶活性相关。
通常延伸温度为60-72摄氏度。
经过以上三个步骤的循环反复进行，每一轮都会使目标DNA序列数量翻倍。
因此，PCR可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。
PCR应用PCR技术在生物学研究、医学诊断、疾病预防和基因工程等领域有着广泛的应用。
基因分析PCR被广泛用于分析基因的结构和功能。
通过PCR，可以快速扩增出感兴趣的DNA片段，然后进行测序分析、限制性酶切或其他分子生物学实验，以研究目标基因的结构和功能。
聚合酶链式反应名词解释生物化学
聚合酶链式反应名词解释生物化学
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术。
它利用DNA聚合酶在适当温度下的体外酶促反应，在较短时间内大量复制目标DNA片段，并使其扩增至可检测水平。
PCR包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤使DNA双链解开成两股单链，退火步骤使引物与目标DNA特异性结合，延伸步骤利用DNA聚合酶在合适温度下合成新DNA链。
这三个步骤连续循环进行，每一轮都会产生双倍数量的目标DNA。
PCR具有高度特异性、高灵敏性和高速度的特点，可以从少量的起始DNA样品中扩增出目标DNA片段，常用于分子生物学研究中的DNA定量、基因检测、基因测序、基因工程等多个领域。
聚合酶链反应
核酸扩增聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)由美国Centus公司的Kary Mullis发明，于1985年由Saiki等在Science杂志上首次报道，是近年来开发的体外快速扩增DNA的技术。
通过PCR可以简便、快速地从微量生物材料中以体外扩增的方式获得大量特定的核酸，并且有很高的灵敏度和特异性，可在动物检疫中用于微量样品的检测。
1. PCR的基本原理和过程PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧单核苷酸存在的条件下依赖于耐高温的DNA聚合酶的酶促合成反应。
PCR以欲扩增的DNA做为模板，以和模板正链和负链末端互补的两种寡聚核苷酸做为引物，经过模板DNA变性、模板引物复性结合、并在DNA聚合酶作用下发生引物链延伸反应来合成新的模板DNA。
模板DNA变性、引物结合(退火)、引物延伸合成 DNA这三步构成一个PCR循环。
每一循环的DNA产物经变性又成为下一个循环的模板 DNA。
这样，目的的DNA的数量将以2n -2n的形式累积，在2小时内可扩增30(n)个循环， DNA量达原来的上百万倍。
PCR三步反应中，变性反应在高温中进行，目的是通过加热使DNA双链解离形成单链；第二步反应又称退火反应，在较低温度中进行，它使引物与模板上互补的序列形成杂交链而结合上模板；第三步为延伸反应，是在4种dNTP底物和Mg2+ 存在的条件下，由DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链的延伸反应。
通过高温变性、低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的片段不断得到扩增。
对扩增产物可通过凝胶电泳、Southern杂交或DNA序列分析进行检测。
2.PCR反应条件和反应系统的组成(1) 反应条件PCR反应通过三种温度的交替循环来进行，一般94℃变性30秒，55℃退火 30秒，70-72℃延伸30-60秒，依此条件进行30次左右的循环。
(2) PCR反应系统的组成标准的PCR反应体系一般选用50-100μl体积，其中含有：50mmol/L KCl，10mmol/L Tris.HCl(室温，pH8.3)，1.5mmol/L MgCl2明胶或牛血清白蛋白(BSA)，2种引物，各0.25(mol/L，4种脱氧核糖核苷酸底物(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)各200( mol/L，模板 DNA 0.1(g，TaqDNA聚合酶2.5iu。
第六章 聚合酶链式反应 PCR
（三）延伸时间和温度
延伸的时间长短取决于目的序列的长度、 浓度及延伸温度的高低。 一般引物延伸是在 72 ℃下进行。对 2 kb 长的产品扩增时间多采用 1 min（ 72 ℃ ）。
（四）平台效应
引起平台效应的因素： （1）dNTP 或引物等消耗殆尽 （2）酶活性逐渐降低 （3）最终产物的阻化作用（焦磷酸盐、双链 DNA）
二、引物3 '末位碱基
引物3 ‘末位碱基在很大程度上影响着TaqDNA 聚合酶的有效延伸。实验表明，引物3 ’末位碱基存在 错配时，不同碱基的引发效率存在很大的差异。
三、引物设计软件
第四节 聚合酶链式反应技术类型
一、已知DNA序列的聚合酶链式反应扩增 （一）巢式PCR
巢式 PCR 是为了增加扩增的灵敏度，对已知序列设 计出第一对引物，扩增 25 个循环。然后根据序列设计出第 二对引物，它和已扩增出序列内部两条链序列互补，继续再 扩增 25 个循环。如此，不受平台效应的限制，而且比单一 的一对引物 PCR 扩增灵敏度特异性高 1000 倍。
变性--退火--延伸三步骤的重复循环，就可获得更多 的“模板互补链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 多次循环后目的基因扩增放大几百万倍。 DNA 扩增量呈指数上升。 反应最终的 DNA 扩增量可用 Y＝(1＋X)n计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示每次扩增效率的平均值，n 代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效 率达不到理论值。 反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加， 而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种 效应称平台期 (Plateau)。
聚合酶链反应
• 引物的浓度:
PCR反应体系中引物浓度一般在0.1～0.2μmol/L 之间. • 引物浓度过高:易形成引物二聚体且产生非特 异性产物. • 引物浓度过低:不足以完成30个循环的扩增反 应,则会降低PCR的产率.
• 3.脱氧核苷三磷酸(dNTP) 即dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP四种脱氧 核苷三磷酸的混合物.
• (3)延伸温度: • 温度：建议选择在70~75℃之间，此时Taq DNA聚 合酶具有最高活性。温度过高不利于引物和 模板结合。
时间：根据待扩增片段的长度而定。72 ℃时核苷酸 掺入率为35～100个核苷酸/秒。
• 2.循环时间
• PCR循环中每个步骤所需的时间取决于所扩增 • 片断的长度. • 在模板(主要是基因组DNA)进行第一次变性时 • 应给予足够长的时间(5～7min,根据变性 温度高低 • 而异)以使模板彻底变性,然后进入循环. • 以长度为200～1000bp扩增片断为例,循环中变性、 • 退火和延伸3个步骤的持续时间均为30s～1min.若扩 • 增片断长度 ＞2kb,应适当延长每个步骤的持续时间, • 但延伸时间过长易导致非特异性扩增.
• 循环时: • 模板DNA 94℃变性1min,引物与模板40～ 60℃退火1min,72℃延伸2min.循环25～40圈 在首次循环前模板预变性3～5min;在末次循环后, 样品仍需继续延伸3～5min以上,确保扩增的DNA 为双链DNA. 经此循环扩增后使被测的单拷贝基因成为超拷贝 基因.
• 三.聚合酶链反应原理 • • PCR反应重复进行DNA复制的过程,使DNA得
• (3)两条引物之间的序列不能有互补. • • 特别是在引物3’端,以免形成引物二聚体. *两条引物之间避免有同源序列,尤为连续4个以 上相同碱基的寡核苷酸片段,否则两条引物会相 互竞争模板的同一位点;同样,引物与待扩增靶 DNA或样品DNA的其它序列也不能存在4个以上 碱基的同源序列.否则,引物就会与其它位点结合, 使特异扩增减少,非特异扩增增加.
聚合酶链式反应三个步骤
聚合酶链式反应三个步骤聚合酶链式反应（PCR）是一种常见的分子生物学技术，它可以扩增DNA片段。
PCR是通过在体外复制DNA片段的过程来进行的，它可以扩增非常小的DNA 片段，如几百个碱基对，到非常大的DNA片段，如几万个碱基对。
PCR通常由三个步骤组成：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR的第一步是变性，这个步骤的目的是将DNA双链分离成两条单链。
变性通常通过加热来实现，将反应混合物加热到94-98℃的温度，这样DNA双链就会分离成两条单链。
这个步骤中的变性温度和时间很重要，因为它们会影响PCR 的效率和特异性。
2. 退火退火是PCR的第二个步骤，它的目的是将引物（primers）与目标DNA序列的两端结合。
引物是一小段DNA序列，它们是PCR扩增的起始点。
在PCR反应中，引物会结合到目标DNA序列的两端，形成一个引物-目标DNA序列的复合物。
引物的选择很重要，因为它们会影响PCR的特异性和扩增效率。
退火的温度和时间也很重要，因为它们会影响引物与目标DNA序列的结合。
通常，PCR反应会在50-65℃的温度下进行退火，时间为20-30秒。
3. 延伸PCR的第三个步骤是延伸，它的目的是在引物的基础上合成新的DNA链。
在延伸过程中，DNA聚合酶会沿着目标DNA序列的单链模板合成新的DNA链。
延伸的温度和时间也很重要，因为它们会影响DNA聚合酶的活性和扩增效率。
通常，PCR反应会在72℃的温度下进行延伸，时间为20-30秒。
PCR通常需要多个循环来完成扩增过程。
每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在每个循环中，扩增的DNA片段数量会指数增加，最终达到所需的扩增水平。
PCR反应的最终产物是扩增的DNA片段，它们可以用于各种分子生物学实验，如序列分析、克隆和基因表达分析等。
聚合酶链反应技术原理及应用
聚合酶链反应技术原理及应用聚合酶链反应（PCR）是一种能够以复制DNA序列的方法，被广泛应用在分子生物学、医学诊断以及进化学研究领域。
PCR 技术的发明者是美国生物学家克利福德·莫拉利和凯瑟琳. 爱明，他们于1983年首次描述了PCR技术。
PCR技术的原理是通过酶、DNA聚合酶和DNA聚合酶的作用下使DNA的复制过程在体外进行。
PCR技术将目标DNA的双链解要（denaturing）、引物（primer）的引`DNA聚合酶的延伸反应三步进行循环反复放大。
这三个步骤是承接的，分别称为 1.变性、 2. 缴体和 3. 延迟反应。
首先是变性步骤，在这一步骤中，PCR反应体系中的DNA双链解要（denaturing）使DNA分子解离成两条单链的模板DNA。
然后是缴体步骤，在这一步骤中，引物（primer）与模板DNA结合，形成引物模板复合物。
最后是延伸反应步骤，这一步骤中DNA聚合酶在引物的引导下使DNA模板进行延伸。
经过这三个步骤的循环反复便可在短时间内放大DNA分子。
PCR技术被广泛应用在医学领域，尤其是在DNA诊断方面。
PCR技术能够对病毒、细菌和真菌等病原体进行迅速检测，对一些重要的传染病进行诊断。
通过PCR技术也可以对一些遗传病进行快速检测，为疾病的早期预防和治疗提供重要参考。
PCR技术还在肿瘤诊断、药物敏感性检测等领域发挥着重要作用。
PCR技术在生物学研究领域也被广泛应用。
通过PCR技术可以在实验中放大一些稀有的DNA序列，为生物进化和遗传研究提供重要的信息。
PCR技术也可以用于分子克隆和基因工程实验中，进行DNA片段的克隆和定向变异，为研究提供了有力的技术支持。
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AAAAAAAA
3’
m RNA A m RNA B m RNA C
各种不同类型的PCR
G e n e S p e c ific S e q u e n c e
5’
AAAAAAAA
AAAAAAAA
U n iv e r s a l T a g S e q u e n c e
P C R c y c le s t a r t s w ith f o r w a r d c h im e r ic p r im e r
16 14
RQ vs Sample
RQ of Total TmPMM-A2
1☞
RQ vs Sample
2.5
2
TA2024
TA2026
1
TA2722
TA2726
RQ of total TmPMM
1.5
1.4 1.2
RQ vs Sample
RQ of TmPMM-A1
第一节：聚合酶链反应
PCR反应体系必须提供的组分： 模板、dNTP、引物（一对） 、DNA聚合 酶及其工作缓冲液 Q1：模板来源？ Q2：引物如何获得？怎样设计引物？ Q3：如何选择各种DNA聚合酶？ Q4：如何优化PCR反应条件？
Q1：模板来源？ 所研究生物的基因组DNA，由RNA反转 录形成的cDNA、插入在载体中的克隆等 Q2：引物如何获得？怎样设计引物？ 分析目标基因的序列特点以及模板特点， 设计符合实验要求的引物。一般原则如下
第四节 PCR在实验室中的应用
一、用PCR亚克隆靶DNA 详见P143页图 TA载体上的克隆
第四节 PCR在实验室中的应用 一、PCR进行亚克隆
加限制性酶切位点
用相应的酶处理片 段 与目标载体连接转 化，筛选阳性克隆
第四节 PCR在实验室中的应用 二、PCR介导产生融合基因
类似于PCR 介导的体外 突变，不同 时将中间分 别与两个基 因有重叠
30 cycles 30 cycles 30 cycles 30 cycles 30 cycles 30 cycles 28 cycles 26 cycles
假设内参基因在各个组织器官中的表达量是一致的情况下，将起始 模板浓度调节一致，用基因特异的引物检测目标基因的表达
定量RT-PCR 绝对定量
起始模板量与Ct呈线性关系，与循环数呈反比关系，即模板 量越高所需要的循环数越少。如果将一致拷贝数的标准样品 做出循环数与LogC(t)标准曲线，即可测算未知样品中基因 的拷贝数了。
通用接头引物的Oligo(dT)30MN
1、利用mRNA的3‘末端的 、利用 末端的poly(A)尾巴作为一个 的 末端的 尾巴作为一个 引物结合位点，以连有SMART寡核核酸序列通 引物结合位点，以连有 寡核核酸序列通 用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转 用接头引物的 作为锁定引物反转 录合成标准第一链cDNA。 录合成标准第一链 。
定量RT-PCR☞相对定量 ☞
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏 差 在 5％以内 1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值： ∆CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) ∆CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校准样本的∆CT值归一试验样本的∆CT值： ∆∆CT= ∆CT（test) - ∆CT（calibrator) 3、计算表达水平比率： 2 –∆∆CT=表达量的比值
第六节 实例6：用RT-PCR克隆细胞特异转录
1 2 3
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第一节：聚合酶链反应
Q2：引物如何获得？怎样设计引物？ 1）根据目标基因和实验产物，确定正向和反向 引物的位置 2）引物长度一般18bp以上 3）退火温度一般50~65度之间 4）引物中碱基分布均匀，无重复碱基，GC含 量适中 5）两条引物间无连续超过三个以上核酸的配对 6）产物的长度根据实验目的确定，注意长片段 的扩增需要特殊处理
In t h e u n iv e r s a l p r im e r a m p lific a tio n r e a c t io n , a ll t h e p r o d u c t s a r e e ff e c t iv e l y t h e s a m e c h e m ic a l s p e c ie s a n d a r e e q u a ll y a m p lifie d . T h e r e la t iv e g e n e r a tio s in c D N A s a m p le s a r e m a in ta in e d th r o u g h o u t t h e P C R s t e p , m a k in g t h e a s s a y s y s t e m h ig h l y q u a n t it a t iv e .
2、利用逆转录酶具有末端转移酶的活性， 使末端加上寡聚C。
3、人工合成的接头 引物的3’末端具有寡 聚G，与寡聚C配对 合成第二链cDNA。
4、利用基因特异的引 物作为下游引物和用 一个含有部分接头序 列的通用引物 (universal primer,UPM) 作为上游引物扩增基 因的5‘末端。
第二节 反转录PCR
依赖能检测不同产物的分析技术
第二节 反转录PCR
反转录酶-聚合酶链反应 反转录酶以mRNA为模板，形成单链cDNA。 随后进行PCR反应的过程。 一、 cDNA 末端的快速扩增（RACE， rapid amplification of cDNA ends)， 3’RACE and 5’ RACE
SMARTTM 3‘-RACE的原理是:
2、用一个基因特异引物GSP1(gene 、用一个基因特异引物 specific primer,GSP)作为上游引物。 作为上游引物。 作为上游引物 3、用一个含有部分接头序列的通用引物 、 UPM(universal primer,UPM)作为下游引物。 作为下游引物。 作为下游引物
SMARTTM 3‘-RACE的原理是:
二、定量PCR 半定量RT-PCR 定量RT-PCR
TaPMM expression pattern analysis by semiquantitative RT-PCR
苗期 根 叶 茎 孕穗期 旗叶 幼穗
TaPMM-A1 TaPMM-B1 TaPMM-D1 TaPMM-A2 TaPMM-B2 TaPMM-D2 Tubulin
4、以cDNA第一链为模板，进行
PCR循环，把目的基因3‘末端的 DNA片段扩增出来。 5′-Oligo(dT)16~30MN-3′, M=A/G/C;N=A/G/C/T
产物的特点是？
SMARTTM 5‘-RACE的原理是 的原理是: 的原理是
1、利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有 SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录 合成标准第一链cDNA
1
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 TA2024 TA2026 1 TA2722 TA2726
0.5
0 TA2024 TA2026
1
TA2722
TA2726
第二节 反转录PCR
差异表达基因的扩增 差别显示反转录PCR 差别显示反转录 通过特定的引物组合，随 机将两个样品间的差异 表达基因展示的技术。
5’ 3’ 3’
反转录PCR(详见第二节） 反向PCR 多重PCR
5’ cDN A
S in g le p a ir o f u n iv e r s a l p r im e r s e q u a ll y a m p lif y a ll o f th e te m p la te s f r o m c y c le 3 t o 3 5
Q3：如何选择各种DNA聚合酶？ 各种体外用的PCR反应的DNA聚合酶均具有耐 高温的特性，所以酶一般来源于嗜热菌 根据实验目的不同选择保真程度不同的聚合酶 Q4：如何优化PCR反应条件？ 主要考虑引物退火温度、模板浓度、反应体系中 是否存在反应的抑制剂等
R e v e r s e T r a n s c r i p t io n o f m R N A t o c D N A u s in g R e v e r s e C h i m e r i c P r i m e r s
第六章 聚合酶链反应
第一节：聚合酶链反应
变性(94):打破双链结合的氢键 复性(50~60度): 原理，双链DNA分子会通 过碱基配对，重新结合。由于混合物中有 较高浓度的引物(寡聚核苷酸)，它们与长 链DNA分子在特殊位点发生退火。 延伸(72度):Taq DNA聚合酶工作的最适温 度,与引物的3端结合，以长链DNA为模板， 合成互补的新链 多次循环，获得目的DNA片段的体外扩增