TERE1基因在小鼠胚胎腭发育和腭裂形成中的表达即相关性研究

中图分类号：Q132.7；Q593.4；R114文献标识码：A文章编号：1002－3127（2010）04－0271－04·论著·TERE1基因在小鼠胚胎腭发育和腭裂形成中的表达朱勇飞1，3，朱江波2，王飞2，红凌1，张天宝2（1.华中科技大学生命科学与技术学院，湖北武汉430074； 2.第二军医大学卫生毒理学教研室；3.杭州师范大学医药卫生管理学院）【摘要】目的观察TERE1基因在正常小鼠腭发育和全反式视黄酸诱导的小鼠腭裂形成过程中的表达变化，探讨TERE1基因在腭裂发生中的作用。

方法ICR小鼠受孕后，将其随机分为实验组和对照组，各64只小鼠。

于孕10d （gestational day10，GD10），经口灌胃一次给予实验组孕鼠80mg/kg的全反式视黄酸、对照组孕鼠给予等体积的大豆油，并分别于GD11 GD18取两组胎鼠的腭板。

于GD12取下小鼠胚胎腭移植体，以10－9 10－5mol/L全反式视黄酸（all-trans retinoic acid，atRA）诱导，培养72h后收获腭板。

利用实时荧光定量PCR方法（quantitative real-time polymerase chain reaction，QRT-PCR）检测TERE1基因在正常腭组织和全反式视黄酸诱导的腭裂组织中的表达情况。

结果TERE1在正常、异常腭及培养腭板中均有表达。

在GD11，异常腭中该基因的表达丰度高于正常腭，而在GD12 GD17，其表达丰度则低于正常腭（P<0.05）。

10－9mol/L atRA组和对照组的TERE1基因表达丰度差异无统计学意义（P>0.05），其他各atRA组该基因的表达丰度均低于对照组。

结论在该试验条件下，atRA会抑制TERE1在腭中的表达，提示TERE1在腭的发生过程中可能起作用。

【关键词】TERE1基因；全反式视黄酸；腭裂；孕小鼠Expression of TERE1in normal palates and all-trans retinoic acid-inducedcleft palates during mouse embryogenesisZHU Yong-fei，ZHU Jiang-bo，WANG Fei，HONG Ling，ZHANG Tian-bao（College of Life Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan Hubei430074，China）【Abstract】Objective To observe the expression of TERE1gene in normal palates and all-trans retinoic acid-induced cleft palates during mouse embryogenesis，and explore the relation between TERE1and the cleft palates.Methods At gestational day10（GD10），the gestational mice of the treatment group were administered with80mg/kg atRA，and those of the control group were administered with the same volume soybean oil.The palates of all embryos were harvested during GD11-GD18.At GD12Mouse embryonic palates were explanted and induced by atRA in different concentrations from10－9mol/L to 10－5mol/L and cultured for72h.The mRNA expression of TERE1in all samples was measured by quantitative real-time polymerase chain reaction（QRT-PCR）.Results TERE1was expressed in all samples.At GD11the mRNA expression of TERE1in the cleft palate were higher than those in the normal palate，and at GD12-GD17，the expression of this gene in the cleft palates were lower than those in the normal palates.The mRNA expression of TERE1in the10－9mol/L atRA group had no difference incomparison with those of the negative control group，and the expressions of this gene in the other atRA groups were lower than those of the negative control group.Conclusion TERE1maybe play a role during the development of palate and atRA probably affects the expression of TERE1in palate.【Key words】TERE1gene；atRA；cleft palate；gestational mouse基金项目：浙江医药卫生项目（2008A126）；上海市公共卫生重点学科建设项目（08GZX0301）作者简介：朱勇飞，博士，研究方向：发育生物学与发育毒理学。

通讯作者：红凌，教授，博士研究生导师，研究方向：发育生物学。

张天宝，教授，博士研究生导师，研究方向：发育毒理学与分子毒理学。

TERE1（transitional epithelial response gene，移行上皮反应基因）/UBIAD1（UbiA prenyltransferase domain containing1）基因是一个广泛表达于人体各组织的强有力肿瘤抑制因子，有研究显示TERE1在大多数侵袭性肌肉移行细胞癌中表达水平显著下降甚至缺失；而通过基因转染在膀胱癌和前列腺癌细胞中强制表达TERE1，发现TERE1对泌尿系统肿瘤具有抑制作用［1-2］。

该基因在果蝇中的同源基因是heix基因，在果蝇胚胎和幼虫的发育过程中，heix突变可导致果蝇幼虫出现黑色素瘤，从而引起其死亡［1］。

另外，胚胎发育与肿瘤发生的关系甚密，如肿瘤的发生过程中的Wnt、FGF、Notch、Hedgehog、TGF-β和Ras-MAPK等几条重要的信号通路，在胚胎发育过程中对调控胚胎发育也起重要作用。

因此，推测TERE1/UBIAD1可能在哺乳动物胚胎发育中起调控作用。

腭是哺乳动物胚胎发育过程中最容易发生畸形的器官之一。

TERE1基因在腭的正常发育或者腭裂发生中有何功能？要回答这个问题，首先必须要了解这个基因在正常腭和腭裂组织中的动态表达情况，进而初步推测这些基因在正常腭发育和腭裂发生中的作用。

本研究利用Real-time PCR方法，以atRA为致畸物，从体内和体外两方面着手，观察TERE1基因在小鼠胚胎正常腭和全反式视黄酸诱导的腭裂组织中的表达情况，为进一步研究它在正常腭发育和腭裂发生机制中的作用奠定基础。

1材料与方法1.1主要仪器和试剂解剖显微镜（XTL-3型，重庆光学仪器厂），高速冷冻离心机（HERMLE ZK400，德国EPPENDORF公司），BioSpecmini型核酸/蛋白分析仪（日本岛津公司）；7300型荧光定量PCR仪（美国ABI公司），旋转培养器，恒温培养箱，混合供气系统。

BGJb培养基（美国Gibco），临用前加入0.15mg/ ml谷氨酰胺（美国Sigma）、6mg/ml BSA（美国Sigma）、50μg/ml链霉素和50U/ml青霉素，Hanks 液，全反式视黄酸（美国Sigma），Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen），逆转录试剂盒（美国Promega），SYBR kit（美国ABI），基因TERE1和内参照β-actin的荧光定量PCR引物均由上海英骏公司合成（引物序列见表1），其余试剂均为国产分析纯。

表1TERE1及β-actin的QRT-PCR引物序列Genes Forward primer sequences Reverse primer sequences TERE15ᶄGGCCATTCTCCATTCCAACA3ᶄ5ᶄGCCAGCCTCTCGGTCAGA3ᶄβ-actin5ᶄGTCCCTGTATGCCTCTGGTC3ᶄ5ᶄGGTCTTTACGGATGTCAACG3ᶄ1.2实验动物及样品收集ICR小鼠（上海必凯实验动物有限公司提供），8 10周龄，雌鼠体重25 30g，雄鼠体重30 35g，动物合格证号为SCXK（沪）2003-0002。

适应性饲养1周后，雌、雄按2ʒ1的比例合笼交配，查到阴栓之日为孕期第0天（GD0），并将孕鼠随机分为实验组与对照组各64只小鼠。

将RA用大豆油为溶剂配制成混悬液，浓度为8mg/ml，于GD10经口灌胃给予实验组孕鼠RA混悬液，给药体积为0.1ml/ 10g体重，对照组给予同样体积的大豆油。

分别于GD11 GD18将实验、对照组孕鼠分批颈椎脱臼处死，剖取子宫，肉眼检查确定妊娠情况，从子宫内取出胎鼠，由于RA诱导的腭裂发生率接近100%，故每窝随机选取一只胎鼠用于实验，解剖显微镜下分离其腭板，迅速用液氮冷冻保存。

1.3腭板培养及结果评价参照文献［3-4］的方法，进行腭板培养及结果评价。

将atRA溶于DMSO随BGJb培养基加入培养瓶中。

实验共7组，分别为对照（生理盐水）组，溶剂对照组（0.1%DMSO），终浓度为1.5ˑ10－9、1.5ˑ10－8、1.5ˑ10－7、1.5ˑ10－6和1.5ˑ10－5mol/L的atRA组。

于GD12脱颈处死孕鼠，无菌取出胚胎，切下腭移植体，将腭移植体放入含9ml BGJb培养液和atRA的50ml培养瓶中，每瓶3 4个，旋转培养［（37.5ʃ0.5）ħ，20 25r/min］。