马铃薯浸提液对其SAGs积累、酚类代谢及自毒效应研究
马铃薯根系分泌物及其方法研究进展综述
高级植物营养学课程论文论文题目：马铃薯根系分泌物及其研究方法进展学院：资源与环境学院专业：植物营养学姓名：谢永春学号： 107331202399马铃薯根系分泌物及其研究方法进展植物营养学谢永春摘要:参考近年国内外关于根系分泌物研究的文献，对马铃薯根系分泌物的成分及其在土壤物理、化学和生物性状的改变、化感和连作障碍等方面的研究和方法进展作综述。
关键词:马铃薯；根系分泌物；连作障碍；化感作用；自毒作用1.引言马铃薯是世界第四大粮食作物，可利用价值高达71%，比其他粮食作物高21%[1]。
但由于我国土地可利用面积的限制，马铃薯连作及其障碍已经成为一个急需解决的问题[2]。
国内外对大豆、小麦、玉米、水稻、大蒜、烤烟和人参等的连作障碍和根系分泌物[3-6]研究较多，但对其马铃薯的报道很少。
本文在近几年国内兴起的连作障碍和根系分泌物的研究基础上，总结归纳了马铃薯根系分泌物以及在连作条件下根系分泌物的变化特征，叙述了根系分泌物的研究方法。
2.马铃薯根分泌物2.1.根系分泌物的成分根系分泌物是指植物在生长过程中，通过根系向生长基质中释放的各类物质，包括低相对分子质量的有机物质、根细胞脱落物及其分解产物、高相对分子质量的孰胶物质、气体、质子和养分离子等[7]。
它是保持根际微生态系统活力的关键因素，也是根际物质循环的重要组分。
研究证明，根系分泌物中自毒性化感物质的积累与连作障碍有着密切的关系[8-10]。
马铃薯根系分泌物的成分大体有以下3部分:1.渗出物由根细胞中扩散或泄漏出的物质,如糖类、氨基酸、维生素等;2.主动分泌物由根细胞主动分泌的代谢产物，如黏胶物质、酶类、激素、酚类、有机酸、质子等;3.分解物植物残体脱落物在细菌的作用下分解产生的物质[11]。
表1列出了马铃薯主要根系分泌物的种类和成分。
表1：马铃薯主要根系分泌物的种类和成分。
2.2. 根系分泌物的作用根系分泌的碳水化合物和氨基酸为根际土壤微生物提供有效的碳源与氮源，根系环境中碳水化合物和氨基酸的数量和种类通过影响土壤微生物种群的分布，进而影响着作物根系的生长发育。
马铃薯脱毒方法进展论文
马铃薯脱毒方法研究进展【摘要】本文综述了马铃薯材料脱毒技术，即结合茎尖剥离技术的物理方法和化学方法，并提出了马铃薯脱毒技术的展望。
【关键词】马铃薯；茎尖脱毒马铃薯是世界上第四大粮食作物。
其特点是产量高、营养丰富、适应性强、分布广、经济价值较高，又是重要的工业原料。
随着农业产业结构的调整和国内外马铃薯加工业的不断发展扩大，市场对马铃薯的需求也逐渐增多。
近年来，我国马铃薯的栽培面积不断扩大。
但是长期以来有“植物癌症”之称的病毒病一直困扰着马铃薯生产的发展。
马铃薯整个生育期均易感染多种病毒病，在我国马铃薯产区危害马铃薯的主要病毒和类病毒有：马铃薯x病毒（pvx）、马铃薯y 病毒（pvy）、马铃薯卷叶病毒（plrv）、马铃薯a病毒（pva）、马铃薯s病毒（pvs），还有一种类病毒–马铃薯纺锤块茎类病毒（pstvd）。
其中pvy、plrv、pvx是危害马铃薯最严重的病毒。
田间表现使植株矮小，叶片翻卷、花叶、皱缩，马铃薯品种种性退化，品质变劣，甚至失去种用价值。
目前主要通过茎尖脱毒获得脱毒试管苗的方法防治该病的发生，有些病毒脱毒率很低，直接对材料进行脱毒，脱毒率只能达到1%。
脱毒前对材料采取合适的方法处理对提高脱毒率有很大的作用，所以脱毒前采取适当的方法处理待脱毒材料，对脱毒率提高非常重要，也直接影响脱毒苗的质量。
本文综述了待脱毒材料脱毒前处理方法的研究进展及展望。
1.物理方法物理学方法高温、低温处理待脱毒材料，控制马铃薯退化。
其中热处理是最古老、最有效的方法，利用病毒和寄主植物对高温忍耐性的差异，可以使寄主体内的病毒失活，而寄主继续存活。
1.1热处理马铃薯卷叶病毒和马铃薯a病毒、马铃薯y病毒不进行热处理，直接取0.1－0.2㎜的茎尖进行培养，操作适当可得到无此病毒植株。
但pvx和pvs的脱毒率却小于1%，当从热处理的植株上剥取茎尖培养时，pvs的脱毒率提高至11.4%，要得到完全无病毒的马铃薯植株必须进行热处理。
马铃薯糖苷生物碱粗提品对小鼠体重及免疫功能的影响
马铃薯糖苷生物碱粗提品对小鼠体重及免疫功能的影响何玉华;秦贵信;白明昧【摘要】为了更好的了解马铃薯糖苷生物碱的毒性作用,对马铃薯的皮和芽进行提取,利用其提取的α-茄碱、α-卡茄碱的混合物对小鼠进行灌胃.观测提取物对小鼠体重、死亡率、免疫器官指数、血清免疫球蛋白的影响.试验结果表明,马铃薯糖苷生物碱中的α-茄碱(α-solanine)和α--卡茄碱(α-chaconine)对小鼠有一定的毒性作用,能够抑制小鼠体重的增长,不同浓度的马铃薯糖苷生物碱使小鼠免疫器官指数降低,IgA,IgM含量升高,300 mg/kg体重马铃薯糖苷生物碱呈现的对生长的抑制和对免疫功能的毒性最大,与对照组相比差异显著(P＜0.05),并对小鼠有致死作用.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2017(053)010【总页数】4页(P94-97)【关键词】糖苷生物碱;小鼠;体重;免疫功能【作者】何玉华;秦贵信;白明昧【作者单位】吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林农业科技学院动物科技学院,吉林左家132109;吉林农业大学动物科学技术学院,吉林长春130118;吉林省长春市双阳区奢岭街道办事处畜牧兽医站,吉林长春130607【正文语种】中文【中图分类】S858.91我国将启动马铃薯主粮化战略，预计2020年50%以上的马铃薯将作为主粮消费，马铃薯或成第四主粮[1]，马铃薯淀粉渣、马铃薯茎、叶等副产品作为饲料的开发也将会成为非常规饲料开发的一项重要研究内容。
然而，这些马铃薯副产品可能含一些有毒物质。
Banp[1]等在19世纪初首次发现了马铃薯中含有生物碱。
主要是以茄啶为糖苷配基构成的茄碱和卡茄碱，共计6种：β-茄碱和γ-茄碱是α-茄碱三糖的部分水解产物；β-卡茄碱和γ-卡茄碱是α-卡茄碱三糖的部分水解产物[2]。
马铃薯在生产、储运和加工过程中以及受到机械或化学损伤、光照及物理损伤后，会导致糖苷生物碱的迅速合成、累积。
【精品】：马铃薯组织培养技术
马铃薯茎尖组织脱毒培养及植物激素在培养中的作用摘要：马铃薯茎尖组织脱毒培养,愈伤组织解除分化形成新个体时,体细胞有丝分裂的异染色质延迟复制行为较正常活体植株更严重,后代变异较自然群体变异高出500倍,若在培养过程添加辐射和化学诱变试剂变异率会更高。
因此,组织培养环境不只是现代生物技术辅助育种的一个重要条件,更是诱变育种的一个有效途径,对于以营养体繁殖的马铃薯作物效果更好。
本文介绍了马铃薯茎尖培养的意义和方法，综述了植物激素在马铃薯生长中的作用。
关键词：茎尖体细胞组织培养变异植物激素Abstract: Potato virus-free cultivation of the tip meristem, callus formation of new individual remove differentiation, somatic cell mitosis heterochromatin delay of normal living plant copy behavior more serious than natural group, variation and variation of 500 times higher in the training process, if add radiation and chemical mutagenesis reagent mutation rate is higher. Therefore, tissue culture of modern biological technology environment is not only an important supplementary conditions, is an efficient way of mutation breeding for excessive n-redistribution breeding, potato crop effect is better. The paper introduces the significance of potato meristem-tip culture were reviewed, and the method of plant hormone role in growth of potatoes.Key words: Stem cells; Tissue culture; variation; Plant hormones1马铃薯生态习性和种类对土壤的适应性很强，但对气候要求凉、冷、燥，在湿热地区虽然也能生长，不过一代以后品种就会演化，需要经常从寒冷地区引进新的种。
干旱胁迫下马铃薯代谢研究
干旱胁迫下马铃薯代谢研究马铃薯是世界上最重要的经济作物之一，然而全球气候变化正在给马铃薯生产带来挑战。
干旱是马铃薯生产中最常见的限制因素之一，会导致株高、地上部生物量和块茎产量的显著降低。
干旱对马铃薯的代谢过程也产生了显著影响，因此了解马铃薯在干旱条件下的代谢变化是缓解马铃薯干旱胁迫的关键。
在干旱胁迫下，马铃薯代谢途径会发生巨大变化。
研究表明，酚类物质、蛋白酶抑制剂和游离脯氨酸等物质在马铃薯干旱条件下含量增加，这些物质是马铃薯抗干旱的适应机制的一部分。
此外，在干旱胁迫下，马铃薯也会调整碳水化合物代谢途径，以保证对生物合成的需求进行调整。
马铃薯在干旱条件下会减少光合作用，以抑制碳水化合物的消耗。
它们还会通过削减浸出液中的淀粉含量来节省碳水化合物。
近年来，代谢组学已成为研究干旱胁迫下马铃薯代谢的重要方法。
代谢组学可定量测定代谢物和其在不同代谢途径中的组分，从而识别变化。
通过代谢组学研究，研究人员可以识别出在干旱胁迫下，马铃薯中代谢物浓度变化的关键过程、代谢途径和受影响的酶。
这种方法有助于阐明马铃薯在干旱条件下如何适应，并为培育抗干旱品种提供信息。
目前的研究表明，钙、脯氨酸代谢、多酚、硝酸还原酶和抗氧化途径等途径在马铃薯中发挥了关键作用。
研究表明，干旱胁迫将导致马铃薯根部中的钙含量下降，并抑制植物的根系生长和发育。
钙也是调节植物中脯氨酸合成和代谢的重要元素。
在干旱胁迫下，根系中脯氨酸含量升高，而酪氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸等物质的含量降低。
此外，在干旱胁迫下，马铃薯中多酚的含量增加，这是马铃薯对环境压力的自卫机制。
与此同时，马铃薯中硝酸还原酶的活性也会增加，以促进植物代谢在低氧条件下的运作。
在抗氧化途径中，马铃薯中抗氧化酶的含量也会增加，这是为了减少干旱引起的氧化损伤。
总之，干旱胁迫下马铃薯代谢途径会发生复杂的变化，包括代谢物浓度的变化和重要酶的调节。
通过代谢组学的研究可以深入了解马铃薯在干旱条件下的适应机制，并为培育抗干旱品种提供有力支持。
成熟期马铃薯茎叶挥发性成分及其清除DPPH自由基能力的研究
作 物 杂志
Ｃｏｓ ｒｐ
成 熟 期 马 铃 薯 茎 叶挥 发 性 成 分 及 其 清除 Ｄ Ｐ 自由基 能 力 的研 究 ＰＨ
陆 占国 韩玉洁 扬 威 张怀涛
（ 哈尔滨商业大学食品工程学 院，５０ ６， １０ ７ 黑龙江 哈尔滨 ）
摘
要 以水蒸 汽蒸馏一 溶 剂萃取 法提 取成 熟
物 ２ ．８ ％ ； ４ ７ ９ 烃类 １． ５ ％ ， ８ ５ ４ 酮类 ｌ． ３ ％ ； 半 萜 １４ ３ 倍 类 ３ ４ ９ 。对精 油 的消 除 Ｄ Ｐ 自由基 的能 力试 ．７ ％ ＰＨ
验 结果 显示 ， 当加入 量 为 ０５ ｍ ．０ Ｌ时 ， 除 率 最 高为 清
６ ． ％ 。 由此 可知 ， 熟期 马铃 薯 茎叶 挥 发 性 成分 ２５ 成 具 有一 定的 消除 Ｄ Ｐ 自由基 能力 。 ＰＨ 关键 词 马铃 薯 ； 油 ； 精 气相 色谱一 质 谱 ； ，一 １ ２
但是 ， 在大量种植和收获马铃薯的同时 ， 有大量茎叶 产 生 。由于 马铃 薯 茎 叶 中含 有 龙葵 苷 等 有 毒成 分 ，
容 易使 家畜 中毒 ， 能 用 于 家 畜 饲 料 等 ， 部 分 不 大
茎 叶挥发性成分 ， 解析鉴定其化学组成 ； 研究了该精 油是 否具有 清 除 Ｄ Ｐ 自由基 能力 。 ＰＨ
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材料 与主要 仪器 ．
只能堆放在田边地头任其腐烂弃之或付之一炬 ， 浪
费 了农 业 资源 。 所 有植 物 为 了 自身 生 长 和繁 衍 ， 内都会 产 生 体 多样 的化 学成 分 ， 化学 成分 传播 信息 ， 用 引诱 昆虫 或
者抵御细菌和外来动植物的侵食。因此 ， 所有 的植 物都 散 发着各 种独 特香 气 ， 马铃薯 也不 例外 ， 当破 坏
马铃薯茎尖脱毒培养技术的研究进展
生 组织 旺 盛 的新 陈 代谢 活 动 。病 毒 的 复制 须利 用 寄 理后 再 进 行茎 尖 剥 离 ，发 现 可 以完 全脱 除 马 铃薯 卷 主 的 代谢 过 程 ，无 法 与分 生 组织 旺盛 的代 谢 活 动竞 叶病 毒 （ Ｌ Ｖ） Ｐ Ｒ ，用 变 温 培 养 处 理 ，Ｖ 脱 毒 率 为 ＰＸ 争 ； ２ 分生 组 织 缺乏 真 正 的维 管组 织 。大 多 数 病 毒 ９ 。 ， （） ６２ 比恒 温热 处 理 Ｐ Ｘ 的脱 毒 率高 。王 秀英 ｌ研 ％ Ｖ １ ｌ 】 在 植 株 内通 过 韧 皮部 进行 迁 移 ，或 在 细胞 间通 过胞 究 表 明 ： 高温 预 处 理对 提 高茎 尖 脱 毒率 效 果 明显 ， 可 问连 丝传 输 ， 为细 胞 与细 胞 间 的移 动速 度 较慢 ， 因 在 以把 不易脱 去 的 Ｐ Ｘ、Ｖ 、Ａ ｖ Ｐ Ｓ Ｐ ＭＶ脱 去 。 Ｓ Ｖ Ｐ Ｔ ｄ是 最 快 速 分 裂 的组 织 中病 毒浓 度 高 峰被 推 迟 ；３ 高 浓 度 难 以除去 的 ， 一 般 的方 法很 难 获得 无 病 毒植 株 ， （） 用 但 的生 长素 。分 生组 织 的生长 素 浓度通 常 很高 ， 可能 影 经过 热处 理则 可 以除去 。 罗玉等 ＿采 取选 健康 整薯 室 ｌ ７ Ｊ
因素 做 出综 述 ．以期 为 马铃 薯茎 尖 脱 毒技 术 的 深入 而 很少 伤 害 寄 主组 织 ， 而抑 制病 毒 的增殖 、 缓病 从 减 研 究 提供参 考 。
毒 在植 株体 内的扩增 速度㈣。 因此 热处 理 可 以提 高 培 养 中去 除病 毒 的能 力 ，但 不 同病 毒 对 高温 预 处 理 的
病 毒是 来 自其 它寄 主植 物 的病毒 。
由于 不 同病 毒在 茎尖分 布 不 同 ， 脱毒 的效 果也 与
浅谈马铃薯茎尖脱毒培养技术的研究进展
２０Ｉ３（２）
西 昌 农 业 科 技
·１５·
的发 育 ，但 可 以提高 脱 毒率 ． 制 剂对 马 铃薯 茎 尖 培养脱 毒是 否有 相 同 的效果 ，值 得研 究和探 讨 。刘 华 、冯高 采用 不 同浓 度 高 锰 酸钾 、过 氧 化氢 、新 洁 尔灭 、尿素稀 释 液对 马铃 薯进 行浸 种处 理 ，发 现 病毒 钝 化 明显 。用处 理 过 的薯 块 做种 薯 ，产 量 明显 提 高 。 而Ｃａｓｓｅｌｌｓ，Ａ．Ｃ等 （ｍ 将 病 毒 唑加 入 培养 基 中 ，培 养 马 铃薯 的分 生组 织 和外 植 体 ，可脱 除 马铃 薯 的Ｘ、Ｙ、Ｓ 和Ｍ病 毒 。 ２．３ 热 处理 的使 用
219401825_UHPLC-Q-TOF-MS
马博稷，肖岩，陈祖德，等. UHPLC-Q-TOF-MS/MS 分析青钱柳嫩叶渗漉提取液化学成分[J]. 食品工业科技，2023，44（13）：281−291. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022070294MA Boji, XIAO Yan, CHEN Zude, et al. Analysis of Chemical Constituents in Percolate the Extract of Cyclocarya paliurus Tender Leaves by UHPLC-Q-TOF-MS/MS[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(13): 281−291. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022070294· 分析检测 ·UHPLC-Q-TOF-MS/MS 分析青钱柳嫩叶渗漉提取液化学成分马博稷1，肖 岩1，陈祖德1，舒任庚2，李冰涛1,3，姜 丽1,3,4，徐国良1,3,4, *，张启云1,3,*（1.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心，江西南昌 330004；2.江西中医药大学药学院，江西南昌 330004；3.江西省中医病因生物学重点实验室，江西南昌 330004；4.江西省中药药理学重点实验室，江西南昌 330004）摘 要：为分析青钱柳嫩叶的化学成分，本研究采取高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱法（UHPLC-Q-TOF-MS/MS ）对青钱柳嫩叶渗漉提取液的化学成分进行快速定性分析。
在正、负离子模式下全扫描和对母离子电子轰击，根据各化合物的精确分子量及元素组成、主要碎片信息、保留时间以及结合青钱柳相关文献和数据库检索，从青钱柳中共鉴定出94种化合物，包括29种黄酮类、16种三萜类、25种有机酸类、24种其他类化合物。
酚酸类自毒物质微生物降解转化研究进展
生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第14卷第3期2019年6月V ol.14,No.3Jun.2019㊀㊀基金项目:宁夏自然科学基金项目(NZ17091);北方民族大学中央高校基本科研业务费专项资金资助(2017SKKY01,2016SKKY01)㊀㊀作者简介:李敏(1987-),女,博士,研究方向为有机化合物的生物降解转化,E -mail :bkdlimin@ ㊀㊀*通讯作者(Corresponding author ),E -mail:mahaijun04ren@DOI :10.7524/AJE.1673-5897.20180808002李敏,张丽叶,张艳江,等.酚酸类自毒物质微生物降解转化研究进展[J].生态毒理学报,2019,14(3):72-78Li M,Zhang L Y ,Zhang Y J,et al.Review on the microbial biodegradation and metabolism of autotoxic phenolic acids [J].Asian Journal of Ecotoxicolo -gy,2019,14(3):72-78(in Chinese)酚酸类自毒物质微生物降解转化研究进展李敏1,2,张丽叶1,张艳江1,朱娟娟1,2,马海军1,2,*1.北方民族大学生物科学与工程学院,银川7500212.宁夏葡萄与葡萄酒技术创新中心,银川750021收稿日期:2018-08-08㊀㊀录用日期:2018-11-05摘要:自毒作用是一种发生在种内的生长抑制作用,尤其是植物残体与病原微生物的代谢产物对植物有致毒作用,并连同植物根系分泌的自毒物质一起影响植株代谢,最后导致自毒作用的发生㊂酚酸类化合物是多种农作物根系土壤中常见的自毒物质,由其导致的自毒作用日益制约现代农业增产增收㊂利用微生物降解自毒物质成为防治自毒作用的研究热点之一㊂然而,要达到实践应用的目标,阐明微生物降解转化酚酸类物质的规律与机制是重要前提㊂本文总结了近年来微生物降解酚酸类化合物的已有研究成果,发现目前已积累了多种具有降解效能的微生物资源;在微生物的作用下,酚酸类化合物常发生脱羧㊁氧化和羟基化等生化反应,进而转变成小分子含苯环有机化合物或者彻底矿化,不同微生物对酚酸类物质的代谢转化程度差异较大㊂在此基础上,本文分析提出该领域研究还需进一步挖掘新型具有高效降解性能的微生物资源㊁阐明微生物降解转化酚酸类化合物的选择性和环境安全性等基础科学问题㊂关键词:酚酸;微生物;降解;机理文章编号:1673-5897(2019)3-072-07㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AReview on the Microbial Biodegradation and Metabolism of Autotoxic Phenolic AcidsLi Min 1,2,Zhang Liye 1,Zhang Yanjiang 1,Zhu Juanjuan 1,2,Ma Haijun 1,2,*1.College of Biological Science and Engineering,Beifang University of Nationalities,Yinchuan 750021,China2.Ningxia Grape &Wine Innovation Center,Yinchuan 750021,ChinaReceived 8August 2018㊀㊀accepted 5November 2018Abstract :Autotoxicity refers to the phenomenon of plant growth inhibition caused by the chemicals from plant residues,metabolites of pathogenic microorganisms,and root exudates.The most common autotoxic compounds are phenolic acids.The autotoxicity is one of the major factors restricting the development of modern agriculture.Therefore,bio -degradation of autotoxins through the action of microorganisms is a hot topic in recent years.How -ever,in order to achieve the goal of practical application ,it is necessary to clarify the mechanism and regularity of microbial transformation of phenolic acids.This paper summarized many previous studies and found that there have been lots of microorganisms that possessed the ability of degading the phenolic acids,in which case,biochemical第3期李敏等:酚酸类自毒物质微生物降解转化研究进展73㊀reactions such as decarboxylation,oxidation and hydroxylation occurred during the process of degradation.As a re-sult of degradation,phenolic acids were converted into small molecules containing benzene ring or completely min-eralized.The degree of metabolic transformation of phenolic acids could be totally different caused by different mi-croorganisms.On this basis,new microbial strains capable of degadation of phenolic acids should be further exploi-ted,and the issues such as degradation selectivity and environmental risks should also be expounded in the future. Keywords:phenolic acid;microorganisms;degradation;mechanism㊀㊀在有限土地资源上专一化和规模化的耕种,导致农田土壤连作障碍问题日趋严重,成为制约现代农业可持续发展的主要障碍之一㊂连作障碍是作物与土壤综合作用的结果,其中植物自毒作用被认为是导致连作障碍的重要诱因之一[1-3]㊂对多种植物根系土壤进行分析发现,阿魏酸㊁对香豆酸和苯甲酸等酚酸类物质是其根系分泌的主要化感自毒物质[4-5]㊂相比增施有机肥㊁嫁接等措施,向土壤中添加有益微生物降解作物根系自毒物质,能更加彻底有效地防治由该类物质导致的连作障碍和土壤污染㊂然而,有机化合物微生物降解过程的环境健康效应具有一定的不确定性,例如三氯乙烯经微生物降解后生成毒性更强的一氯乙烯㊂因此,阐明微生物降解转化酚酸类化合物的规律与机制,是应用微生物防治酚酸类自毒物质导致的连作障碍的重要前提㊂根据近年来的文献报道,笔者重点介绍了已有微生物降解转化酚酸类物质的科研成果,并综合分析了本领域需进一步揭示的基础科学问题㊂1㊀酚酸类物质的化感自毒作用(Allelopathic auto-toxicity of phenolic acids)化感作用(allelopathy)由德国科学家Molish于1937年首次提出,1984年Rice将其定义为植物(或微生物)向周围环境释放化学物质,进而影响邻近植物(或微生物)生长发育的化学生态学现象[5-6],是植物㊁微生物和土壤三者极其复杂的相互作用结果㊂自毒作用(autotoxicity)是植物化感作用的一种主要类型,指植株向环境中释放化学物质,连同植物残体与病原微生物的代谢产物一起对同种植物产生直接或间接的毒害作用㊂酚酸类化合物以带有活性羧基的苯环为分子骨架,苯环上多种取代基类型和取代位点构成了分子结构和性质的多样性㊂酚酸类物质的自然来源主要是在植物体内通过莽草酸途径合成[7],因此普遍存在于高等植物组织中㊂近年的研究表明,酚酸类物质具有较强的化感活性,是引起植物化感自毒作用的主要因素之一[8-11]㊂自然条件下,根系分泌㊁花粉传播和残体的腐败降解是植物体内酚酸类物质进入周围环境的主要途径[5,12-13]㊂当环境中酚酸类物质的浓度积累到一定量时,即产生显著的化感作用,主要表现在以下几个方面:(1)对植物种子萌发及生长发育产生毒害作用㊂酚酸类物质主要通过改变蛋白质和核酸的合成[14]㊁细胞膜的通透性能[14-15]㊁酶的含量与活性[7]㊁光合作用[16-17]等,对植物的生理代谢产生负面影响㊂在植物整个生命周期中,种子萌发及幼苗生长阶段对化感物质最为敏感㊂例如,对羟基苯甲酸㊁香草酸㊁香豆酸㊁苯甲酸和香豆素是花生连作土壤中的主要酚酸类物质,在根系土壤中累积达到一定浓度后均可对花生种子的发芽和幼苗的生长产生抑制作用[18];2mmol㊃L-1肉桂酸能显著抑制黄瓜种子的萌发率,降低幼苗生长的鲜重㊁根尖数㊁根表面积㊁胚根和胚轴长等指标[19]㊂(2)对土壤理化性质和微生物群落结构产生影响㊂随着酚酸类物质在植物根际的不断累积,土壤中氮㊁磷和钾等有效养分逐渐失衡,微生物的种群分布㊁多样性和生物量等发生劣变[20-22]㊂以人工杨树林为例,伴随土壤中苯甲酸㊁对羟基苯甲酸㊁肉桂酸和香草酸的累积,根际细菌数量明显减少,而真菌数量增多[23]㊂对我国南方红壤花生种植区土壤进行分析研究发现,酚酸类物质的累积可导致土壤偏酸,土壤从细菌型逐渐向真菌型过渡的同时,病原真菌富集,而蔗糖酶㊁脲酶和磷酸酶等土壤酶活性则随着连作年限的增加而降低,进而造成土壤微生物区系失衡㊁地力衰竭,病虫害加剧[24]㊂从上述研究可以看出,随着连作年限的增加,酚酸类自毒物质在土壤中蓄积,导致作物品质下降㊁产量降低㊁病虫害频发等现象,对农业生产实践产生严重负面影响,亟待研究解决㊂2㊀微生物对酚酸类物质的降解研究现状(Research status of biodegradation of phenolic acids by micro-organisms)在自毒作用导致的作物连作障碍治理领域,接种有益微生物分解连作土壤中累积的化感自毒物74㊀生态毒理学报第14卷质,有利于农田生态系统的保护和农业的可持续发展,有望成为一项经济有效的措施[20]㊂近年来,研究者们已从自然环境㊁作物内生菌和肠道微生物中分离㊁筛选获得多种酚酸类物质降解菌,并对其降解特性㊁转化机理等做了一定程度的研究㊂2.1㊀微生物菌种的分离筛选以及对酚酸类物质的降解效能研究众多研究采用以酚酸类物质作为唯一碳源的培养基,筛选得到了多种可降解酚酸类化合物的菌株,此方面的成果尤以国内学者研究报道居多㊂目前,已分离鉴定的微生物包括假单胞菌(Pseudomonas sp.)[25]㊁粘红酵母菌(Rhodotorula gluti-nis)[25]㊁葡萄球菌(Staphylococcus sp.)[26]㊁不动杆菌(Acinetobacter sp.)[27]㊁曲霉菌(Aspergillus sp.)[28]㊁黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)[29]㊁拟茎点霉菌(Phomopsis liquidambari)[30]㊁微小杆菌(Exig-uobacterium sp.)[31]㊁固氮菌(Azotobacter sp.)[20]㊁青蓝链霉菌(Streptomyces caeruleus)[32]等㊂它们对酚酸类物质的最大降解浓度多在250mg㊃L-1以下[33-34],少数微生物可耐受1000mg㊃L-1的酚酸[25]㊂就降解转化效率而言,已筛选获得的菌株在实验室摇瓶降解条件下,对酚酸类化合物均表现出较高的降解效能㊂例如,培养48h后,拟茎点霉菌对250mg㊃L-1肉桂酸的降解率达100%,同时菌体的生物量显著增大[33]㊂葡萄球菌属细菌在液体培养基内经72h培养后,对100mg㊃L-1阿魏酸的降解率可达99.97%[26],微小杆菌培养96h后对肉桂酸的降解率可达99%以上[31]㊂然而,考虑到土壤中蓄积的酚酸类物质是连作障碍的潜在诱因,因此,土壤介质中微生物对酚酸类物质的转化行为更值得关注和研究㊂Zhang等[25]从竹林㊁稻田等土壤中分离获得假单胞菌和粘红酵母菌,分别研究了在实验室摇瓶条件和实际土壤介质中的降解效率,发现在实验室液体培养基内经48h培养后上述菌株对1000mg㊃L-1对香豆酸的降解率可达70%以上,而在土壤介质中达到70%~80%降解率所需的降解周期则延长到30d,且土壤介质的pH㊁温度和共存金属离子等条件对微生物的生长和降解性能影响显著,例如粘红酵母菌无法在高于30ħ的环境中生长,假单胞菌无法在Co2+污染的土壤中生存㊂总体而言,目前微生物降解转化酚酸的研究,多在实验室模拟体系中进行,而相关实际土壤介质中的降解转化研究成果十分匮乏,需要进一步填补㊂就降解底物多样性而言,目前所筛选分离的菌株往往可同时降解数种酚酸类物质㊂以对香豆酸为唯一碳源的培养基筛选得到的菌株,可同时有效降解阿魏酸㊁对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醛[25]㊂微小杆菌可对香草酸㊁阿魏酸和苯甲酸等近10种酚酸类物质进行有效降解[31]㊂从化学分子结构角度分析,酚酸类物质苯环母核上的取代基多为羧基㊁羟基和甲氧基,结构上表现出的共性为微生物降解酚酸的底物多样性奠定了基础㊂自然界一种作物的根系土壤中,往往是几种乃至十几种酚酸类物质共存[9-10],因此具有较高降解底物多样性的菌株,其潜在应用价值也相应提高㊂目前,微生物对单个酚酸的生物降解行为研究比较透彻,但对混合酚酸的生物降解行为的研究还未见报道㊂对比微小杆菌对单个酚酸的降解效能,发现对香豆酸㊁阿魏酸经6h降解即可达到100%去除率,而同样条件下肉桂酸经96h降解才可达到相同降解效果[31],即同一种微生物对酚酸类化合物的降解效能差异显著㊂微生物对酚酸类化合物降解的选择性还有待揭示㊂2.2㊀微生物对酚酸类物质的降解转化机理研究酚酸类化合物在微生物的降解作用下,分子结构中苯环上的取代基较易发生降解转化,这类反应往往导致大分子的酚酸降解转化为小分子酚酸或其他含苯环类小分子有机化合物㊂以肉桂酸及其衍生物为例,降解主要发生在苯环1号位丙烯酸基团,而苯环母核则在降解过程中未被破坏㊂丙烯酸基团在细菌作用下的代谢路径如图1所示㊂采用少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)降解阿魏酸,发现其分子结构中丙烯酸基团在多种酶的综合作用下,有2种代谢路径,一种是在阿魏酰基辅酶A合成酶(feruloyl CoA synthetase enzyme,FerA)作用下羧酸基团被活化,后经双键加成㊁脱乙酰辅酶A等多个生化反应历程,最终转化为醛基(图1反应①~③);另一种直接在脱羧酶的作用下丙烯酸基团发生脱羧反应(图1反应④)[35-36]㊂拟茎点霉菌降解肉桂酸的过程中,检测到苯乙烯㊁苯乙酮㊁苯甲酸㊁对羟基苯甲酸和原儿茶酸等重要中间降解产物,揭示了丙烯酸基团的另一种降解转化路径(图1反应④㊁⑥~⑦)[30];利用固氮菌降解转化对香豆酸时,检测到对羟基苯甲酸和3,4-二羟基苯甲酸2个中间产物[20],利用青蓝链霉菌降解转化对香豆酸时,检测到对羟基苯甲酸为主要中间产物[32],这均支持了这一降解转化路径㊂第3期李敏等:酚酸类自毒物质微生物降解转化研究进展75㊀对于酚酸类化合物结构中的苯环,在微生物降解转化过程中能否开环裂解十分关键㊂微生物代谢降解苯酚已有大量文献报道,且表现出相似的代谢途径:微生物在其生理代谢过程中,首先将苯酚羟基化形成邻苯二酚,再经过邻位裂解或间位裂解将苯环开环[37-38],降解为低碳化合物或者二氧化碳和水㊂此外,Jones 等[39]报道烟曲霉菌(Aspergillus fumiga -tus )在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基中生长时,除检测到邻苯二酚外,还发现中间产物对苯二酚;在进一步代谢过程中,前者发生环内裂解生成β-酮己二酸,而后者羟基化生成1,2,4-三羟基苯后,发生邻位裂解生成己烯二酸㊂目前,少数研究报道显示,以苯甲酸及其衍生物为底物时,微生物也能将其分子结构中的苯环裂解[30,40]㊂苯甲酸及其类似酚酸的主要降解路径如图2所示㊂例如,固氮菌A.chroococ -cum ㊁A.vinelandii 和A.beijerinckii 可利用苯甲酸及对羟基苯甲酸类化合物作为碳源和能源生长,前者转化为邻苯二酚后发生间位裂解,而后者转化为3,4-二羟基苯甲酸后,经β-酮己二酸途径代谢[40]㊂广泛存在于草本植物和木本植物中的内生真菌拟茎点霉菌在液体培养条件下可对600mg ㊃L -1的4-羟基苯甲酸进行有效降解,48h 内降解率可达94%以上;对其降解过程进行跟踪发现,经羟基化㊁脱羧等步骤,4-羟基苯甲酸转为邻苯二酚,再进一步发生邻位裂解生成己二烯二酸,从而汇入三羧酸循环[30]㊂考虑到多种苯酚类衍生物具有潜在的生物及环境健康风险,因此跟踪酚酸类物质微生物降解过程中苯环的归趋,对于研究整个降解过程机制及环境安全风险都至关重要㊂微生物特性是影响其对外源物质降解能力的重要因素之一[41-42]㊂已有研究结果显示,酚酸类化合物微生物代谢转化常涉及到脱羧㊁氧化和羟基化等过程,但不同微生物对酚酸类物质的代谢转化程度存在较大差异㊂图1㊀肉桂酸类化合物苯烯酸基团的代谢路径Fig.1㊀Metabolic pathways of acrylic acid groups in cinnamic acids and itsanalogues图2㊀苯甲酸类酚酸苯环代谢路径注:TCA 表示三羧酸㊂Fig.2㊀Metabolic pathways of benzene ring in benzoic acid and its analoguesNote:TCA stands for tricarboxylic acid.76㊀生态毒理学报第14卷3㊀本领域需进一步阐明的基础科学问题(Science issues that need to be further clarified in the field)通过微生物手段解决土壤中累积的酚酸类自毒物质,对防治由其导致的连作障碍㊁保护农业生态环境具有重要意义㊂然而要达到这一目标,还需开展大量研究工作㊂在基础理论研究领域,以下问题需重点关注㊂(1)已有研究显示,部分微生物对酚酸类化合物具有一定的降解效能,而降解速率和转化程度存在显著差别㊂筛选高效降解酚酸类化合物的新型菌株,阐明其中的降解转化效能和规律,仍是今后本领域需继续加强开展的工作内容㊂(2)目前已有的报道多集中在某种微生物对单一或少数几个酚酸类化合物的降解转化研究,而在实际环境中,一种作物根系往往共存几种乃至十余种酚酸类物质,特别是对于结构中包含苯环的有机化合物,其生物降解由于苯环上取代基数量㊁位置和种类多样而变得更加复杂,例如,氨基㊁甲氧基㊁硝基和砜基等的存在可显著抑制其生物降解,而羟基㊁羧基则起到促进作用[43]㊂对于以苯环为母核结构㊁取代基类型和取代位点多样的酚酸类物质,微生物对其代谢转化的选择性㊁代谢转化难易程度与其分子结构之间的关系目前尚未见报道㊂微生物对该类化合物降解转化效能与化合物分子结构特征之间的内在关联有待揭示㊂(3)在理想情况下,微生物降解转化有机物的最终产物是无机离子㊁二氧化碳和水等,但实际降解过程往往是分多个步骤完成的,生成众多中间产物的同时,很难达到彻底矿化去除的效果㊂因此追踪识别中间降解产物并了解其归趋,对于揭示降解转化机理和评价降解过程的生物安全性十分必要㊂酚酸类化合物结构中均包含苯环,部分微生物可将苯环裂解开环彻底矿化,而部分微生物只能对大分子酚酸类化合物进行简单转化,苯环结构仍旧存在于多种中间降解产物或最终降解产物中㊂由于众多苯环衍生物不论对植物自身还是周围环境均存在潜在的安全威胁,因此在微生物降解转化酚酸类化合物的过程中,苯环的归趋是评估整个降解过程是否安全㊁是否彻底的一个重要因素㊂现有研究报道,多采用LC-MS等分析手段,定性识别部分主要降解转化产物,一定程度上揭示出苯环的归趋㊂然而,仅定性定量筛查出具有潜在环境风险的降解产物,尚不能够完整反映降解体系整体的安全性,降解产物混合物中各组分叠加㊁协同或抑制等综合生物效应尚未明确㊂目前对降解转化过程中的环境生物安全性研究较少,亟待填补㊂通讯作者简介:马海军(1972-),男,植物生理学博士,副教授,主要研究方向为植物衰老和采后生理无损伤检测,发表学术论文20余篇㊂参考文献(References):[1]㊀Utkhede 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一种快速分离纯化土豆中羧肽酶抑制剂的方法
一种快速分离纯化土豆中羧肽酶抑制剂的方法202技术2006,13(3):202~206一种快速分离纯化土豆中羧肽酶抑制剂的方法陈永发,孙钧铭,张莲芬,唐瑜菁,金坚(1.江南大学生物工程学院,教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡214036;2.无锡第三人民医院中心实验室,江苏无锡214041)摘要土豆中含有一种羧肽酶抑制剂(car|)oxypeptidaseinhibitor,CPI),它极有可能成为一种辅助溶栓药物,因此建立一条土豆中CPI的快速分离纯化路线是很有必要的.土豆去皮匀浆后,所得CPI粗提液经离子交换和分子筛层析得到纯品.产品通过放射免疫分析和I.owry法定蛋白,其相对纯度达到89.38,320g土豆收获19.92mgCPI,回收率达到5O左右,提取周期小于3d,整个工艺路线为CPI的产业化奠定了基础.关键词土豆;羧肽酶抑制剂;分离纯化中图分类号:Q51文献标识码:A文章编号:1005—8915(2006)03—0202—05土豆中含有一种相对分子质量Mr4200的蛋白酶抑制剂一羧肽酶抑制剂(carhoxypeptidaseinhibitor,CPI),能专一抑制人血浆羧肽酶B(carhoxypeptidaseB,CPB),后者也称凝血酶活化的纤溶抑制剂(thrombin—activatablefibrinolysisinhibitor,TAFI)_1].TAF!能抑制纤溶酶原生成纤溶酶,从而抑制纤溶系统的启动.动物实验已证实,TAF!缺陷小鼠纤溶能力增强,而且未引起出血ll].CPI作为TAF!的特异性抑制物,极有可能成为理想的溶栓药物前体,克服目前临床溶栓药物使用过程中临床安全剂量过窄,容易引起出血的缺陷.本研究室已经建立了CPI的放射免疫分析方法对其定量检测,该法方便不易受介质干扰.在此基础上,对土豆中CPI的分离纯化工艺进行了研究,建立了简单快速的分离纯化工艺.1材料与方法1.1仪器与材料655A一12液相色谱仪(H1TACH1公司);Pow—er-PAC3000电泳仪(Bio—Rad公司);SP—UV21O0 紫外一可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司); spectramax@plus384光谱仪(MolecularDevices公司);SPSepharose15ml预装柱(Pharmacia公司);7放射免疫测量仪(上海原子核研究所日环仪器一J).新鲜土豆(市售);苯甲酰甘氨酸一L一苯丙氨酸(N—Benzoyl—Gly-Phe),羧肽酶A(carboxypeptid—aseA,CPA)和CPI标准品(Sigma公司);胸腺肽(Mr3100,白求恩医科大学制药厂);抑肽酶(Mr 6500,兰州大得利生物化学制药有限公司);羊抗兔IgG血清,正常兔血清(江苏省原子医学研究所);其它试剂均为国产分析纯或化学纯.1.2方法1.2.1CPI的分离纯化320克新鲜土豆室温下去皮切片,按照1:2加去离子水,采用家用搅拌机匀浆3min,粗布过滤.滤液先用30饱和硫酸铵盐析,8000r/min离心弃沉淀,上清再70饱和硫酸铵pH值5.8(CPI等电点)盐析.8000r/min离心,沉淀经去离子水复溶后对去离子水透析2次,最后对0.O1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液(pH值4.1)透析过夜.样品上经预先用上述缓冲液平衡的SP-sepharos穗阳离子交换层析(3.5crn×15cm),流速4ml/min,收集经CPI生物活性检测有活性的洗脱峰后再次对其采用70硫酸铵等电点盐析.沉淀用0.1mol/lPBS(pH7.4)复溶后经预先用0.1mol/LPBS(pH7.4)平衡的SephadexG-25柱(1.6cmX6Ocm)凝胶过滤,流速1ml/min,收集活性部位,对去离子水透析后冻干,收稿日期:2005—05—23修回}1期:2005—07—01作者简介:陈永发,1976年出生,男,硕士研究生,专业方向:微生物与生化药学.E-mail:****************,Tel:135****0349*通讯作者:金坚,1960年生,男,教授,博士生导师,从事细胞与分子药理学研究.Tel:0510—5860236'陈永发等:一种快速分离纯化土豆中羧肽酶抑制剂的方法203得到纯品.1.2.2CP1的纯度鉴定1.2.2.1CPI的电泳图谱采用含8mol/L尿素的不连续SDPAGE变性电泳.浓缩胶和分离胶浓度分别为4和16.5,交联度6,恒流25mA,采用银染法染色.1.2.2.2CP1的HPLC图谱室温下采用色谱柱Zorbax300SB-C8(4.6ITlrn×25cm);检测波长220nl-i1;进样体积10l;流动相A为含0.1TFA的乙腈,流动相B为含0.1TFA的去离子水,流速1min/ml,洗脱程序为流动相A先洗5min,然后5～30min流动相B线性增加至100.1.2.3CPI的分子质量鉴定分子质量采用HPLC外标法鉴定.抑肽酶和胸腺肽作为分子质量参考标准.色谱条件为室温色谱柱Shodex OHpakSb-802.5HQ(8mm×300ram),流动相含0.3mol/INaC1的0.05mol/IPBS溶液(pH值7.5),检测波长280nm.1.2.4CPI生物活性鉴定通过CPI抑制CPA的酶活评价其活性,测定方法借鉴文献[3].1.2.5CPI放射免疫活性鉴定利用j1标记CPI得标记物I-CPI,样品与.I-CPI混合后,与制备的CPI特异性抗体发生竞争性结合反应,通过测定抗体结合物的放射活性来定出样品中所含CPI的量,测定方法参考文献1-4].1.2.6蛋白质的测定方法蛋白定量采用lowry法[引.2结果2.1离子交换透析液先经SP—Sepharose15ml预装柱层析,用0～0.3mol/INaC1线性梯度洗脱,得一洗脱峰(图1),收集该洗脱峰,采用CPI生物学活性检测方法进行分析,发现有活性.通过计算,在洗脱液NaC1浓度约0.1mol/L时,该峰被洗脱下来.在线性梯度洗脱试验的基础上,我们采用了阶段梯度洗脱.上述离子交换树脂装柱(3.5cm×15cm),经缓冲液平衡后,透析液样品上柱,分别在0.1,0.2,0.3mol/INaC1各洗脱一个峰(图2).收集各洗脱峰,分别检测其生物学活性,测得第一个洗脱峰(经0.1mmol/INaC1洗脱)有活性,而其它2个峰没有活性.I10.907;050.301—0101020——●一R,304050一一一-INaC1】U.3503025020.15暑01rJZ0.05——0.05Fig1ChromatographyofcrudeCPIonSP—sepharoseby linegradientelution-.◆_一A一一一?INaC1】TubeFig2ChromatographyofcrudeCPIonSP—sepharoseby stepwisegradientelution离子交换洗脱曲线提示CPI在低离子强度时即能被洗脱下来,说明CPI与离子交换树脂结合并不是很牢,因此CPI对上样缓冲液的离子强度要求很苛刻,必须在低离子强度时CPI才能被柱子充分的吸附.另外,在线性梯度洗脱时只洗下来1个峰,可能是洗脱液离子强度增加太快,而导致柱子分辨率降低.2.2分子筛层析离子交换后所得产品经HPLC分析发现纯度不高,因此再上SephadexG-25分子筛(1.6cm×60cm)层析,采用0.1mol/LPBS(pH值7.4)为洗脱缓冲液,每管2ml收集,洗脱曲线见图3.对所收集各管检测活性,测得第2个峰有活性.从图3可以看出蛋白在280nm处的吸收值与其生物活性基本一致.428642O2●OOOOO【I__.1l_l204药物生物技术第13卷第3期0.080?070?060.05窖0.040.030.020.0lI1090一一70皇三至50三三30星10一l0050l00一▲一?Relativeactivity—__I_一2.川TubeFig3ChromatographyofcrudeCPIonsephadexG-25 2.3CPI的纯度鉴定分子筛层析后产品经脱盐冻干,电泳结果见图4.从图4可以看出,在该电泳条件下,产品呈单一条带,达到了电泳纯.蟊0:Fig4SDS-PAGEelectrophores;sofCPI2.4CP1的分子质量鉴定分子筛层析后的CPI产品经HPIC鉴定其分子量,结果见图5.从图5可以看出,CPI参考标准和产品在保留时间9.7min左右都有一个洗脱峰,通过外标法计算通过该分子排阻色谱柱所分离蛋白分子的分子质量与其排阻时间的关系,再经线性回归,计算其分子质量在4200左右,和文献报道基本相符I.,(min)a0l5,(mlf1)b0l505l0l520f(min)C05l0l520,(min)da.Thymosimb.Aprotinin;c.CPIstandard(sigma);d.Product Fig5EstimationofthemolecularweightofpureCPI2.5CPI的定量分析在提取纯化土豆CPI的过程中,通过建立放射免疫分析法跟踪和分析各步骤CPI得失,结果见表1.表1中相对纯度是CPI相对总蛋白质的质量百分数,从表中可以看出,离子交换去掉了大部分杂质,纯化倍数很高,但是活性损失很大,这说∞∞∞∞如∞加m一>LL一一0.II1∽∽0.IQu一.I—u0一∞∞∞加m一>1.LI一0.II1∽∽0.IQu一.I—u0一蠢番蕊∞∞∞∞加m一>g一0.II1∽∽0JauIJl.0五"¨m一>g一0.II1∽∽0JduIJl.0五陈永发等:一种快速分离纯化土豆中羧肽酶抑制剂的方法205 明离子交换树脂的选择是可行的,但是操作条件还有待于进一步优化;分子筛层析后产品的纯度是满意的,相对来说损失也比较小,该纯化步骤的选择是较适当的.Tab1TheresultofquantitiveanlysisofCPI3讨论CPI是一种小分子多肽,具有一定的热稳定性和醇溶性,因此传统方法采用80乙醇提取[6].采用醇提可以避免土豆匀浆时产生大量的泡沫,而且沉淀和上清易分离,给操作带来很大方便.但我们曾经以CPI放射免疫定量检测分析了乙醇提取法,发现醇提得率明显低于水提(至少低40),而且醇提后需要减压蒸馏,在蒸馏过程中容易形成色素,并经定量分析发现减压蒸馏后CPI有较大损失,得率降低(至少降低50);其次由于土豆中CPI含量很低,在大批量制备CPI时采用醇提消耗乙醇相当多,也造成了料液体积过大,这给后面的处理带来了相当大的难度和工作强度.而采用水提不仅可以降低料液体积,方便进一步分离纯化, 而且又不必减压蒸馏,因此既避免了色素的形成, 又可以提高CPI的得率.土豆匀浆过滤后得到的滤液体积相当大,必须对滤液进行浓缩.为了尽量缩短分离纯化周期,曾经选择了截流分子量1ku超滤膜浓缩料液.但实验结果表明CPI仍然能穿透膜,经检查膜并无损坏,这很有可能是因为,CP1分子是一种小分子多肽折叠并不完全,CP1分子并不是球形而是呈线性,因此该膜并不能有效地截流CPI.鉴于CPI兼具亲,疏水性的性状,难以选择合适的有机沉淀方法.本实验结果表明选择等电点硫酸铵盐析法能达到较为满意的CPI浓缩目的.本实验曾选择过多种交换材料纯化CPI,包括721工业阳离子交换树脂,大孔吸附树脂,聚酰胺柱等,效果均欠满意.采用了SP-sepharose强阳离子交换树脂,试验结果是可行的.SP-sepharose 强阳离子交换树脂对CPI的吸附能力也不是很强,要求流动相缓冲液pH和离子强度尽可能低, 因此在离子交换前必须对样品进行透析以便除去样品中盐分.但是限于SP—sepharose强阳离子交换树脂pH工作范围(4～11),因此选择pH值4.1.在低pH值缓冲能力较大的缓冲液不多,因此选择0.01mol/L的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液较为合适.CPI的Mr只有4200左右,且有一定疏水性.我们选择了分级范围在1000～5000u左右的Sephadex@25分子筛进行分级分离.由于分子筛葡聚糖介质含有很多羟基,在以低离子强度缓冲液为流动相时,层析介质对CPI可能有较高的非特异性吸附.我们在建立CPI放射免疫分析方法的过程中,发现采用SephadexG-10层析分离标记CPI和游离碘时,标记CPI的得率随着流动相缓冲液离子强度增加而增加,提示通过提高流动相的离子强度可有效地避免层析介质对CPI的非特异吸附.本试验采取了0.1mol/IPBS(pH7.4)作为流动相,CPI得率较为满意.由于CP1分子质量较小,很难采用常规电泳鉴定CP1分子量,以HPLC分析其分子量是合理的.本方法的分离纯化周期可以控制在3天内完成,这为该纯化路线的工业放大以实现CPI的产业化奠定了基础.采用CPI生物活性方法进行定量时,发现该方法不稳定,重复性差,这可能是由于土豆中色素等杂质的干扰影响了CPI的定量,这提示了用该方法对土豆中的CPI含量准确定量是不可信的.因此采用了我们已经建立的CPI放射免疫分析方法来对CPI进行定量.但是用CPI生物活性检测方法快速检测CPI的活性,以指导提取纯化土豆中CPI的实验顺利进行还是必不可少的.参考文献[1]BoumaBN,MarxPF,MosnierL0,eta1.Thrombinact[vat—ablefibrinolysisinhibitor(TAFI,Plasmaprocarboxypeptid—aseB,procarb0xypeptidaseR,procarboxypeptidaseu)[J]. ThyO77ff9Res,2001,101(5):329.[2]SwaisgoodCM,SehmittD,EatonD,eta1.Invivoregula—tionofplasminogenfunctionbyplasmacarboxypeptidaseB [J].JClinInvest,2002,110(9):1275.206药物生物技术第13卷第3期[3]HassGM,RyanCA.MethodsinEnzymology(LorandL,ed.)[c].NewY ork:A(_ademicP1982,778.[4]陈永发.孙钧铭,唐瑜菁,等.土豆中羧肽酶抑制剂的放射免疫分析EJ].中国医药工业杂志,2005,36(7):402.[5]张龙翔,张庭芳,李令媛.生化试验方法和技术[M].第二版,北京:高等教育出版社,1997,137.[6]PearceGandRyanC八Arapid,large-scalemethodforpurl—ficationofthemetallo-carboxypeptidaseinhibitorfrompotatotubers[J].AnalBiochem,1983,130(1):223. ARapidMethodforIsolationandPurification0fCPIfromPotatoTu—bersCHENY ong—fa,SUNJun—ming,ZHANGLian—fen,TANGYu-Jing,JINJian(1.SchoolofB0￡c^"00g,TheKeyLab.oJ'IndustrialB0￡Pc^"00g,MinistryofEducation, SouthernY angtzeUniversity,214036,China;2.CentralLab.ofWuxiThirdPeople'SHospi —tal,Wuxi214041,China) AbstractPotatotubercontainsakindOfcarboxypeptidaseinhibitor(CPI),whichwouldbeco meapotentialdrugforassistantthrombolytics,SOitisessentialtodeveloparapidmethodforisolat ionandpurificationofCPIfrompotatotubers.CrudeCP1wasextractedfrompotatojuiceafterpeelin gandho—mogeneratingofpotatotubers,thenpureCP1waspreparedfromcrudeCPIbygelfiltrationusi ngsepha—dex(,r25followedbyion—exchangechromatographyonsulfopropylsepharose.ByCPI—RIAandLowry,pureCPI'Spuritywas89.38,and320gfreshpotaotubersyielded19.92mgCPI,representingo ver50recovery,andthepurificationofCP1wasaccomplishedwithin3days.Ithaslaidabasisforthepacile,largescarepreparationofCPI.KeywordsPotato,Carboxypeptidaseinhibitor,Purification信息?2O06—5l胚胎干细胞自我更新和品系特化的控制及其培养基2oo6—52一种重组人血小板衍生生长因子及其编码基因与表达方法2O06—53一种在大肠杆菌中生产重组内皮抑素的方法及其应用2006154一种单克隆抗体,包含该单克隆抗体的检测试剂盒及应用本试剂盒包含盒体,设在盒体内的96孔酶标板条,试纸条和样品稀释液.其中的试纸条是由样品垫,吸收垫,涂覆有金标记抗鸡IgGFC单克隆抗体的金标垫,包被有NP重组蛋白的检测线和包被有抗鼠IgG的质控线的硝酸纤维素膜依次按吸收垫,硝酸纤维素膜,金标垫,样品垫的顺序粘贴在不吸水的支撑薄片上构成.其中还涉及一种能产生特异单克隆抗体的杂交瘤细胞系BDRPDP和能够专门识别鸡IgGFc的单克隆抗体的制备.该试剂盒检测禽流感病毒抗体具有特异性强,灵敏度高,操作简便和诊断快速的显着优点.2O06—55一种重组鸡a干扰素的生产方法及其重组载体本发明将鸡a干扰素的基因序列通过电转化方式整合到酵母上的特定位置.采用毕赤酵母表达系统表达外源基因,表达外源蛋白的纯度高于7O,经过65636倍稀释发现能完全抑制100—1000TCIDso的水疱性口炎病毒的攻击.鸡a干扰素对VsV和禽流感病毒的转录,翻译阶段抑制能力尤其明显,对新城疫病毒,传染性法氏囊病毒等也都有较强的抑制作用,而且还有强大抗肿瘤,抗增殖作用,对鸡的马立克氏病毒也具有较强的抑制作用.2ll06—56肝细胞生长因子基因修饰骨髓间质干细胞在心肌缺血治疗中的应用用携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒转染骨髓间质干细胞,获得高表达肝细胞生长因子的干细胞,局部注射治疗心肌缺血,既可以改善局部缺血症状,降低胶原沉积,又可以修复部分坏死的心肌细胞,具有明显的治疗效果.,。
马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究
马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究作者：洪丽萍汪文华何恩铭张文惠来源：《福建农业科技》2023年第12期洪丽萍，汪文华，何恩铭，等.马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究［J］.福建农业科技，2023，54（12）：54-61.收稿日期：2023-11-02作者简介：洪丽萍，女，1969年生，助理研究员，主要从事植物生理及农产品保鲜研究。
*通信作者：汪文华，男，1985年生，副研究员，主要从事植物逆境生理研究（E-mail：**********************）。
基金项目：厦门市重大科技计划项目（3502Z20211004）；厦门市科技扶贫项目（3502Z20194509、3502Z20204504-2、3502Z20204501-3）。
摘要：为控制马铃薯在贮藏和加工过程发生的酶促褐变，对马铃薯多酚氧化酶进行分离纯化，并研究其酶学特性。
采用缓冲液提取、低温离心得到马铃薯多酚氧化酶（PPO）粗酶液，粗酶液经硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25分子凝胶柱层析脱盐处理、DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离纯化得到马铃薯PPO，进一步对其部分酶学特性进行研究。
结果显示：纯化后的马铃薯PPO其比活力为 283.0 U·mg-1，回收率为16.8% ，纯化倍数为18.6倍；该酶最适反应温度为30℃，最适反应pH为6.5；以邻苯二酚为底物时，最适底物浓度为50 mmol·L-1。
该酶对焦性没食子酸、间苯二酚的底物亲和性较强，对4-甲基儿茶酚、咖啡酸、没食子酸、对苯二酚、邻苯二酚、绿原酸的底物亲和性较低，对N-BOC-酪胺、愈创木酚亲和性很低。
关键词：马铃薯；多酚氧化酶；纯化；酶学特性中图分类号：S 532 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2023）12-0054-08DOI： 10.13651/ki.fjnykj.2023.12.008Study on the Separation and Purification of Polyphenol Oxidase from Potatoand Its Enzymatic PropertiesHONG Li-ping， WANG Wen-hua*， HE En-ming， ZHANG Wen-hui（Fujian Key Laboratory of Subtropical Plant Physiology and Biochemistry， Fujian Institute ofSubtropical Botany， Xiamen， Fujian 361006， China）Abstract： In order to control the enzymatic browning of potato during the storage and processing， the potato polyphenol oxidase was isolated and purified， and its enzymatic properties were studied. The crude enzyme fluid of potato polyphenol oxidase （PPO） was obtained by the extraction of buffer solution and centrifugation at low temperature. Then， the crude enzyme fluid was separated and purified through the ammonium sulfate salt fractionation， Sephadex G-25 molecular gel column chromatography desalination treatment， DEAE Sepharose Fast Flow anion exchange column chromatography and Sephadex G-75 molecular sieve gel filtration chromatography to obtain the potato polyphenol oxidase， and some of its enzymatic properties were further studied. The results showed that： the specific activity of purified PPO was 283.0 U·mg-1， the recovery rate was 16.8%， and the purification fold was 18.6 times. The optimum reaction temperature and pH of the enzyme were 30℃ and 6.5， respectively. When catechol was used as the substrate， the optimal concentration of substrate was 50 mmol·L-1. The enzyme had strong substrate affinity for pyrogallic acid and resorcinol， and had low substrate affinity for 4-methylcatechol， caffeic acid， gallic acid， hydroquinone， catechol and chlorogenic acid， while having low affinity for N-BOC-tyramine and guaiacol.Key words： Potato； Polyphenol oxidase； Purification； Enzymatic properties马铃薯Solanum tuberosum L.是除小麦、大米和玉米之外，世界上消费量最大的食物之一，含有丰富的碳水化合物、膳食纤维、类胡萝卜素、花青素和微量营养素（如维生素C、维生素B6、钾、叶酸、铁、硫胺、核黄素和烟酸），生产周期相对较短且产量很高，可以用各种方式烹饪用于不同的菜肴，如土豆泥、土豆面包、薯条、土豆片和土豆沙拉等，深受消费者喜爱。
不同光质对马铃薯块茎糖苷生物碱积累的诱导效应
不同光质对马铃薯块茎糖苷生物碱积累的诱导效应季彦林;王旺田;王蒂;张金文;王威;李瑛;张菲菲【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2010(026)001【摘要】以2个光敏型马铃薯品种(庄薯3号和渭薯1号)和2个光不敏型马铃薯品种(大西洋和夏波蒂)为材料,研究了不同光质对马铃薯块茎糖苷生物碱(SGAs)积累的影响.结果表明:不同光质对马铃薯块茎SGA_s积累的影响不同,其中红光(630 nm)的诱导效果最为明显,蓝光次之,橙光、黄光和绿光的作用不明显,紫光基本上无效;红光、白光诱导光敏型马铃薯块茎SGA_s的积累量高于光不敏型马铃薯品种,而在橙光、黄光、绿光、蓝光和紫光诱导下2类马铃薯品种的块茎SGA_s积累没有规律性.此外,同一光质对不同品种马铃薯块茎SGA_s积累的影响不同,说明光诱导块茎SGAs的积累还与马铃薯品种的遗传组成有关.推测,红光是诱导马铃薯块茎SGAs积累的重要信号分子.【总页数】6页(P40-45)【作者】季彦林;王旺田;王蒂;张金文;王威;李瑛;张菲菲【作者单位】甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070;甘肃作物遗传改良与种质创新重点实验室,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学农学院,甘肃,兰州,730070【正文语种】中文【中图分类】S532.01【相关文献】1.不同光质对小球藻光自养培养积累油脂的影响 [J], 尹继龙;唐小红;郑洪立;尹丰伟;高振;黄和2.光质与马铃薯块茎细胞信号分子和糖苷生物碱积累的关系 [J], 王旺田;张金文;王蒂;陶士珩;季彦林;吴兵3.不同LED光质对陕产重楼生理特性和成分积累的影响 [J], 李铂; 唐志书; 王楠; 孙晓春; 黄文静; 宋忠兴; 杨新杰; 程虎印; 黄柯朝4.光质对不同家系青钱柳生物量和叶三萜类化合物积累的影响 [J], 刘洋;陈培;周明明;李娜;方升佐5.光质对不同家系青钱柳生物量和叶三萜类化合物积累的影响 [J], 刘洋;陈培;周明明;李娜;方升佐因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
马铃薯中酚酸物质的干燥特性曲线
单因素实验：
干燥温度、干燥时间以及切片厚度对于马铃薯中提 取酚酸均有影响。当干燥温度为60℃、干燥时间为 8h、切片厚度为4mm时提取的总酚含量最高。
实验部分
2.实验结果
2.2.2 热风干燥实验
正交实验：
对马铃薯中提取酚酸的含量影响的主次顺序为A （厚度）＞B（温度）＞C（时间），可得马铃薯中 提取酚酸的最佳提取条件组合为马铃薯在切片2mm 后在60℃条件下干燥8h时，提取总酚含量最高。根 据最佳条件验证实验，平行三次，得到马铃薯中提 取酚酸的含量为239.372mg/100g。
实验部分
2.2实验结果
2.2.1提取优化实验
乙醇浓度、液料比、超声时间、微波时间以及微波功 率对于马铃薯中提取酚酸均有影响。我们通过实验得 知实验条件为乙醇浓度为75%，液料比为1：20，超声 时间为40min，微波时间为180s，微波功率为80%.是 酚酸提取的最佳工艺条件。
实验部分
2.2实验结果
实验部分
2.2实验结果
2.2.3 酚酸抗氧化检测实验 酚酸对DPPH自由基清除能力
干燥时间、干燥温度和切片厚度均对酚酸清除 DPPH自由基能力有显著影响，三个因素影响的主 次顺序为A（时间）＞B（温度）＞C（切片厚 度），可得马铃薯中提取酚酸的最佳提取条件组 合为马铃薯在切片6mm后在50℃条件下干燥8h时， 酚酸对DPPH自由基清除能力最高。
Байду номын сангаас
讨论与展望
实验过程中，微波提取工艺时容易产生沸腾， 使提取溶剂挥发，导致实验结果出现误差；此 外，热风干燥实验中切片厚度较难精确控制， 也可能会对实验结果有些许影响，导致实验结 果不理想。 结合本次实验，进一步研究热风干燥对单体酚 酸含量的影响及其变化机制。应当研究采用不 同加工工艺抑制多酚氧化酶活性，控制褐变度， 达到保护酚酸单体及其生物活性的目的，提高 产品品质。
马铃薯糖苷生物碱减轻化疗性静脉炎作用机制的实验研究
马铃薯糖苷生物碱减轻化疗性静脉炎作用机制的实验研究付晓燕;苏韫;颜春鲁;刘永琦;张广智【摘要】目的探讨马铃薯治疗化疗性静脉炎的作用机制.方法将60只普通级日本大耳白兔随机分为空白对照组、模型组、硫酸镁组、糖苷生物碱组、马铃薯汁组、马铃薯泥组各10只.后5组通过耳缘静脉推注长春瑞滨建立静脉炎模型,除空白对照组与模型组外,其余4组分别在穿刺部位涂抹50％硫酸镁、糖苷生物碱、马铃薯汁、马铃薯泥,检测兔血清细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和E-选择素(E-selectin)含量,同时观察各组动物注射部位病理形态学变化.结果模型组ICAM-1、E-selectin 显著高于空白对照组(均P＜0.05);与模型组比较,马铃薯泥组、糖苷生物碱组ICAM 1显著下降(均P＜0.05),硫酸镁组、糖苷生物碱组E-selectin显著下降(均P＜0.05).模型组兔耳穿刺部位血管损伤较为明显,糖苷生物碱组血管损伤最轻,未见血栓形成,其余各药物组病理学改变程度均较模型组减轻.结论糖苷生物碱可通过下调ICAM-1、E-selectin水平,改善化疗性静脉炎的病理损伤;糖苷生物碱是马铃薯防治化疗性静脉炎的有效成分.%Objective To explore the mechanism of potato glycoalkaloids in relieving phlebitis induced by intravenous infusion of antineoplastic agents in rabbits.Methods Sixty white Japanese rabbits were categorized into the following 6 groups (10 in each) with a phlebitis model being built in 5 groups through injection of vinorelbine via the auricular veins:control group,without phlebitis;model group,phlebitis was induced by intravenous infusion of vinorelbine;magnesium sulfate group,phlebitis treated with 50％ magnesium sulfate;glycoalkaloid group,phlebitis treated with potato glycoalkaloids;potato juice group,phlebitis treated with potato juice;and potato mash group,phlebitis treated with mashed potato.Theserum levels of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and E-selectin were detected,and histopathology of the injected auricular veins were observed.Results The serum levels of ICAM 1 and E selectin in the model group were significantly higher than the control group (P＜0.05 for both).Comparing to the model group,ICAM-1 concentration was significantly lower in the potato mash group and glycoalkaloid group,and E-selectin plasma concentration was significantly lower in the magnesium sulfate group and glycoalkaloid group (P＜0.05 for all).Vascular damage in the injected site was severe and obvious in the model group,milder in the magnesium sulfate group,potato juice group and potato mash group,but that in the glycoalkaloid group was the mildest withoutthrombosis.Conclusion Glycoalkaloids can relieve chemotherapy-induced phlebitis through down-regulation of ICAM 1 and E-selectin,therefore glycoalkaloids might be the effective components of potato to prevent and treat phlebitis.【期刊名称】《护理学杂志》【年(卷),期】2018(033)001【总页数】3页(P31-33)【关键词】化疗性静脉炎;马铃薯;糖苷生物碱;硫酸镁;细胞间粘附分子-1(ICAM-1);E-选择素(E-selectin);病理切片【作者】付晓燕;苏韫;颜春鲁;刘永琦;张广智【作者单位】兰州大学第一医院护理部甘肃兰州,730000;甘肃中医药大学基础医学院;甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室;甘肃中医药大学基础医学院;甘肃中医药大学基础医学院【正文语种】中文【中图分类】R472;Q95-3静脉化疗是恶性肿瘤治疗的主要手段之一，但绝大多数化疗药物刺激性大、毒性强，对外周静脉的损害严重，易引起组织坏死和静脉炎，既给患者带来痛苦，又增加护士静脉穿刺的难度，而且影响化疗的顺利进行[1-2]。
马铃薯中消炎成分的提取及其消炎作用的比较研究
21摘要目前马铃薯用于消炎止痛时一般采取现切现用、以马铃薯片敷于患处的方法，但是片状马铃薯久放或贴敷后变色，需频繁更换，使用不便。
本实验拟提取马铃薯中的主要消炎成分、进行定性、定量分析，并将主要消炎成分制成软膏，以小鼠皮肤炎症模型比较马铃薯软膏、马铃薯片与消炎药物的疗效。
关键词马铃薯消炎生物碱水溶性维生素马铃薯提取物软膏1 前言马铃薯又名土豆、洋芋、山药蛋、薯仔、茨仔等，富含淀粉、蛋白质、多种维生素及矿物质等，一直深受百姓喜爱。
同时作为中草药的一种，马铃薯也常被中医用作和胃健中、解毒消肿的天然药物。
马铃薯性平味甘，具有抗感染、解毒、消肿镇痛、缓解痉挛、促进细胞再生和伤口愈合等作用，对人体无刺激，副作用小。
以片状马铃薯贴敷患处的方法来消除红肿及疼痛已经广为人知，并有显著效果。
临床常用马铃薯片来缓解肿瘤病人因化疗而导致的外周静脉输液外渗性损伤，而且效果比50%硫酸镁更有效，即使长期使用也不会产生消炎止痛膏的毒副作用及依赖性。
但是片状马铃薯在使用上存在一定弊端，如必须现切现用、贴敷时需经常更换、水份容易蒸发等，给病人的使用带来了很大的不便。
因此需要寻找一种更好的利用马铃薯消炎的替代方法。
本实验拟提取马铃薯中消炎的有效成分，并将主要消炎成分以不同配比制成软膏，以动物模型比较马铃薯软膏、马铃薯片与消炎药膏的消炎效果。
2 实验目的提取马铃薯中消炎的主要有效成分并制成软膏，鉴定马铃薯软膏的消炎效果，为临床探索一种利用马铃薯消炎的最佳方案。
3 实验原理3.1 马铃薯中消炎成分分析马铃薯中的龙葵碱（茄碱）具有兴奋平滑肌和加强血液流通作用。
维生素B2 参与糖、蛋白质及脂肪的代谢，可保护皮肤免受炎症的侵害；维生素B1 能激活胆碱乙酰化酶，有维持神经系统的功能及抗神经炎的作用，从而防止病人皮肤受损，减少医源性损害。
3.2 龙葵碱和水溶性维生素的提取3.2.1 龙葵碱22马铃薯中所含的生物碱主要为龙葵碱，其化学结构见图1。
马铃薯植株的提取物对块茎形成和生长的影响
马铃薯植株的提取物对块茎形成和生长的影响
宋占午
【期刊名称】《西北师范大学学报：自然科学版》
【年(卷),期】1990(026)004
【摘要】以80％的热乙醇浸提马铃薯(Solanum tuberosum)植株茎叶,提取液浓缩后溶于10％醋酸,以三氯甲烷萃取后醋酸液调pH等于10,加热得到沉淀,用95％乙醇重结晶后得到白色粉状物质,离体培养马铃薯的黄化萌条节段(MS培养基),100ppm的上述物质可使块茎形成率提高1倍,并促进块茎的生长。
【总页数】3页(P64-66)
【作者】宋占午
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】S532.035
【相关文献】
1.无土栽培营养液浓度对马铃薯植株生长和微型薯形成的影响 [J], 张雁;高航;金美玉;李葵花
2.多效唑对马铃薯试管苗生长和块茎形成的影响 [J], 张志军;李会珍;姚宏亮;周伟军
3.马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证 [J], 平海涛;王玉萍;王东霞;周晓洁
4.离体培养条件下植物生长物质对马铃薯块茎形成的影响 [J], 李灿辉
5.马铃薯试管块茎形成机制的研究：BA对试管块茎形成与膨大的影响 [J], 柳俊;谢从华
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