与黄花马蹄莲互作过程中胡萝卜软腐果胶杆菌的差异表达蛋白分析

P． c． c， 1998 年前属于欧文氏菌属［5］） 。P． c． c 引起的软腐病一直是植物病理学研究的重要内容之一 ， 特别 ［6 ］ ［7 － 8 ］ 。 随着蛋白组研 与其致病相关的研究更有所增加 是在胡萝卜果胶软腐杆菌的全基因序列公布后 ， 究技术的进步， 在某些农作物病原菌的致病性过程中蛋白质差异表达开始得到研究 ， 如柑橘溃疡病菌 ［9 ］ （ Xanthomonas axonopodis pv． citri） 等。在彩色马蹄莲中， 黄花马蹄莲对 P． c． c 最为敏感， 本研究选用该 品种的叶片组织提取液与果胶杆菌 P． c． c 离体互作， 利用双向电泳和质谱分析技术， 分析互作过程中病原 菌胞内蛋白差异表达， 为探寻病原菌的致病相关基因及寄主在致病过程中的作用提供佐证 。
1． 2． 3
· L － 1 二硫苏糖醇平衡 15 min， · L － 1 碘乙酰胺平衡 15 min。第二向为 SDS 聚丙烯酰胺凝 mmol 再用 250 mmol PAGE ） ： 分离胶 12． 5% ， 45 min； 17 W， 4． 5 h。 利用银染 胶电泳（ SDS浓缩胶 4． 8% ， 程序为每块胶 2 W， ［15 ］ ， ， 3 。 法 进行染色 扫描仪扫描图像 每个处理重复 次 1． 2． 4
［12 ］
· min － 1 、 4 ℃ 离心 20 min， 的方法进行蛋白浓缩及纯化： 粗蛋白溶液 12 000 r 取上清液
5 mL， － 20 ℃ 预冷后， · min － 1 、 4 ℃ 再次离心 20 min， 加入 25 mL 丙酮， 过夜沉淀。12 000 r 弃上清液， 加入 1． 2 mL 再水化液将蛋白团块溶解， 用截留相对分子质量为 3 000 的超滤管 （ Miliipore ） 超滤至终体积约 ［13 ］ 200 μL。采用 Bradford 法 测定蛋白含量。
1． 2． 2
病原菌体内总蛋白的提取
［2 ］ 挑取本研究室自彩色马蹄莲软腐组织中分离获得的 PccS1 单菌落，
［11 ］ 2YT 培养基过夜培养 12 h， 分别取 20 μL 加入到 100 mL 的 2YT 和含 0． 4% 寄主叶片提取液 的 2YT 培
HP） 中， 3 000 r · min － 1 、 4 ℃ 离心 30 min， 10 mL 灭菌水悬 养基（ 以下简称 2YT培养至 D600 = 1． 2 ， 弃上清液， 7 000 r · min － 1 、 4 ℃ 离心 20 min， 浮， 取沉淀， 即为 PccS1 菌体。 用 QIAGFNA 公司提供的细菌蛋白提取试剂盒提取病原菌胞内蛋白 ： 60 mg 溶菌酶在 600 μL 裂解缓 － 20 ℃ 保存备用。取 10 mL 裂解缓冲液， 冲液中溶解、 分装， 加入 100 μL 溶菌酶溶液和 10 μL 核酸酶溶 · L － 1 TrisHCl， pH 7． 2 ） 悬浮， 3 000 r · min － 1 、 4 ℃ 液。将获得的 PccS1 菌体用 20 mL 清洗缓冲液 （ 50 mmol 离心 10 min， 重复 2 次， 取沉淀。沉淀用液氮预冷后冰浴 15 min， 加入 10 mL 含有溶菌酶和核酸酶的裂解 14 000 r · min － 1 、 4 ℃ 离心 30 min， 缓冲液轻轻悬浮， 冰孵 30 min， 上清液即为粗蛋白溶液。 参照 Zhao 等
34 （ 5 ） ： 63 － 66 南京农业大学学报 2011 ， Journal of Nanjing Agricultural University
http： / / nauxb． njau． edu． cn

收稿日期：2010 － 12 － 03 基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目
* Email： fanjq@ njau． edu． cn。 作者简介：杨钟灵， 硕士研究生。 通讯作者： 范加勤， 副教授， 主要从事植物检疫学与入侵生物学研究，
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第 34 卷
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［14 ］ PAGE ） ： 加入 双向电泳 参照 Villeth 等 的方法。第一向为等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ IEF460 μL 上样液（ 120 μg 蛋白质， 1% DTT， 1% IPG Buffer（ pH 4 ～ 7 ） ， 1 × 溴酚蓝， IEF 再水化液 ） 至持胶槽， 700 V 0． 5 h， 1 500 V 1． 5 h， 9 000 V 3 h， 9 000 V 4 h。 等电聚焦完成后， 参数为 300 V 0． 5 h， 胶条用 100
+ + 中图分类号：S436． 341． 1 3 ；S682． 2 64
文献标志码：A
文章编号：1000 － 2030 （ 2011 ） 05 － 0063 － 04
Proteomic analysis of Pectobacterium carotovorum subsp． carotovorum in the interaction with the host plant Zantedeschia elliotiana ‘Black magic ’ in vitro
彩色马蹄莲（ Zantedeschia sp． ） 为天南星科、 马蹄莲属 （ Zantedeschia sp． Spreng ） 多年生球根花卉， 因其 ［1 ］ 艳丽的色彩、 高雅的姿态被予为 21 世纪的“花卉之星 ” 。 然而， 在全球范围内， 由于细菌性软腐病严重
［2 － 3 ］ ［4 ］ 。 据 Snijder 等［3］、 且没有理想的防治方法， 极大地阻碍了彩色马蹄莲产业的发展 易建平等 报 发生， 道， 其病原菌为胡萝卜果胶软腐杆菌胡萝卜亚种 （ Pectobacterium carotovorum subsp． carotovorum， 下文简称
材料与方法
供试菌株
［2 ］ 胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种 （ P． c． c） 菌株 PccS1 ， 由本实验室分离和鉴定 。
试验方法
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寄主叶片提取液的制备 参照 Andrade 等 的方法制备寄主组织提取液。 挑选长势、 大小一致 ‘Black magic’ ） 叶片（ 温室培养 60 d， （ 30 ± 5 ） ℃ ） 10 g， 75% 乙醇表面 的黄花马蹄莲（ Zantedeschia elliotiana · L －1， NaCl 5 g · L －1， Yeast Extract 10 g · L －1， pH 7． 0 ） 研磨， 加入 100 mL 的 2YT 培养基（ Tryptone 17 g 消毒， 7 000 r · min － 1 、 4 ℃ 离心 10 min， 纱布过滤 2 次， 取 50 mL 滤液， 重复 2 ～ 3 次， 弃沉淀， 取上清液， 再用 0． 22 － 70 ℃ 保存备用。 μm 的细菌过滤器过滤， 滤液即为 10% 叶片提取液，
． 南京农业大学学报， 2011 ， 34 （ 5 ） ： 63 － 66 杨钟灵， 钱国良， 蒋欢， 等． 与黄花马蹄莲互作过程中胡萝卜软腐果胶杆菌的差异表达蛋白分析［J］
与黄花马蹄莲互作过程中胡萝卜软腐果胶杆菌的 差异表达蛋白分析
杨钟灵， 钱国良， 蒋欢， 胡白石， 刘凤权， 范加勤
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（ 南京农业大学植物保护学院 / 农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室 ， 江苏 南京 210095 ） 摘要：通过病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种与黄花马蹄莲组织的离体互作 ， 运用双向电泳技术、 质谱技术及 ImageMaster 2D platinum 5． 0 （ GE） 软件对互作过程中蛋白质差异表达进行分析 。结果表明： 70 个蛋白点在互作中存在表达差 异， 占蛋白点总数的 18． 13% 。 通过质谱分析发现： 2 个特异表达蛋白分子伴侣 DnaK 和 1 － 脱氧木酮糖 － 5 － 磷酸合酶 （ DXS） 均为代谢类蛋白； 3 个显著上调表达蛋白中 ATP 合酶 α 亚基和半胱氨酸合酶为代谢类蛋白 ， 而 β － 内酰胺酶为抗生 素类蛋白。 关键词：胡萝卜软腐果胶杆菌； 黄花马蹄莲； 离体互作； 蛋白质组分析
YANG Zhongling， QIAN Guoliang， JIANG Huan， HU Baishi， LIU Fengquan， FAN Jiaqin *
（ College of Plant Protection / Key Laboratory of Integrated Management of Crop Diseases and Pests， Ministry of Education， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095 ， China） Abstract ： A proteomic approach was applied in this study on the changes of proteins expressed by the pathogen bacteria Pectobacterium carotovorum subsp． carotovorum（ P． c． c） in the course of interation with the host plant tissue（ Zantedeschia elliotiana ‘Black mag） in vitro by using twodimensional electrophoresis（ 2DE） ， mass technology and ImageMaster 2D platinum 5． 0 （ GE） software． The ic ’ 18． 13% of the total protein spots（ 70 /386 ） in the gels indicated expression high differentially． Totally 5 proteins results showed that， were identified by mass spectrometry analysis； it was found that in addition to betalactamase（ upregulating exprssed proteins ） which was antibiotic protein； other four proteins all belonged to metabolic enzymes， among them， molecular chaperone DnaK and 1deoxyDxylulose5phosphate synthase （ DXS ） were proteins specifically expressed； ATP synthase subunit alpha and cysteine synthase were upregulating exprssed proteins． Key words： Pectobacterium carotovorum subsp． carotovorum； Zantedeschia elliotiana； interaction in vitro； proteomic analysis