裂褶菌F17对刚果红的脱色及主要降解酶的研究

收稿日期:2006-09-07;修回日期:2007-05-06作者简介:唐文忠(1982-)安徽肥西人,硕士研究生;通讯作者:荚 荣(1964-)安徽芜湖人,教授,硕导,主要从事环境生物技术方面研究,E-m ai:l ji arong @ah163 co m 。

基金项目:安徽省教育厅自然科学研究项目(2006KJ 162B );安徽大学人才队伍建设项目和研究生创新计划项目裂褶菌F17对刚果红的脱色及主要降解酶的研究唐文忠,荚 荣,程晓滨,李旭东(安徽大学生命科学学院,合肥 230039;安徽省生态工程与生物技术重点实验室,合肥 230039)摘 要:裂褶菌F17在限氮培养基中对偶氮染料刚果红表现出较高的脱色能力。

最佳脱色条件为:温度28 、初始p H 值4 5以及菌体摇瓶培养3d 加入染料,染料浓度以100m g /L 为宜。

诱导因子藜芦醇、吐温80、土豆汁和松木屑的加入明显提高了脱色率,而叠氮化钠和氰化钾的加入对脱色有显著的抑制作用。

酶活检测表明,裂褶菌F 17在刚果红脱色过程中主要产生M nP ,L i P 活力很小,未检测到Lac 。

此外,刚果红的脱色率与累积M nP 酶活具有良好的线性关系,相关系数为0 973。

推测裂褶菌F17对刚果红脱色的主要降解酶为M nP 。

关键词:裂褶菌F17;刚果红;脱色条件;M nP;相关性中图分类号:Q 958 1文献标识码:A文章编号:1008-9632(2007)04-0024-05由于生产和使用的要求,决定了人工合成染料属于高度稳定的有机分子,具有耐光、耐热、耐物理化学作用及难生物降解等特性。

而全球每年大约要生产70万吨的染料,估计有10%~15%的染料在使用过程中被释放到环境中,造成严重的污染,其中80%是偶氮染料[1,2]。

刚果红是典型的双偶氮染料,也是第一个人工合成的直接染料,被广泛应用于纺织、造纸、印染等工业[3]。

白腐真菌是一类丝状真菌,它对难降解的污染物具有广谱降解作用,尤其是能降解多环芳香烃类和毒性较大的有机污染物,包括不同结构的多种染料[4,5]。

白腐真菌在一些主要营养物(碳、氮、硫)受到限制时产生木质素降解酶系,包括木质素过氧化物酶(L i P )、锰过氧化物酶(M nP )和漆酶(Lac)。

L i P 和M nP 是木素降解酶系中起主要作用的两种过氧化物酶,它们是在白腐真菌次生代谢过程中合成且被分泌到胞外,经H 2O 2引发一系列自由基链反应,依靠氧化还原反应对染料进行脱色、降解和矿化[6,7]。

但是,种类不同的白腐真菌所产酶系存在差别,不同的培养条件和环境因素也影响其降解酶的合成与分泌[8],进而影响污染物的降解效率。

本实验室已选育出1株对多种染料脱色降解能力较强的白腐真菌 裂褶菌F17(Schizophyllu m sp F17)[9],该菌在限氮液体培养条件下,分泌L i P 与M nP 。

本文以偶氮染料刚果红为作用对象,研究裂褶菌F17对其脱色的最佳条件,并分析脱色过程中的主要降解酶,为研究该菌株的脱色、降解机理以及实际应用奠定基础。

1 材料与方法1 1 菌种和染料裂褶菌F17本实验室分离、保存。

偶氮染料刚果红购自上海试剂三厂, m ax :495n m,分子量:696 67。

1 2 培养基斜面培养基(P DA ):马铃薯200g /L,蔗糖20g /L ,琼脂30~40g ,p H 值自然。

限氮培养基[9]:葡萄糖10g /L ,酒石酸铵0 2g /L ,KH 2PO 42 0g /L ,CaCl 20 1g /L ,M gSO 4!7H 2O 0 5g /L ,0 1g /L V B110mL ,B ∀微量元素溶液70mL ,0 1m ol/L 乳酸-乳酸钠缓冲液(p H 值4 2)100mL 。

1 3 试验方法裂褶菌F17接种于斜面培养基上,28 、培养3~4d ,用无菌水洗入三角烧瓶中,匀浆器打匀成碎菌丝片段,分别吸取5mL 等分到装有95mL 的限氮培养基烧瓶中,28 、130r /m in 摇床振荡培养形成大小一致的菌丝球。

菌液培养一定时间后,在摇瓶中加入染料(3个平行),每隔24h 取样测定脱色率和生物量,在研究主要降解酶试验时,同步测定M nP 、L i P 和Lac 酶活。

1 4 脱色率和生物量的测定脱色率的测定[10,11]:用分光光度法测定并计算某一培养时间内培养液中剩余染料浓度a 1(a 为原染料浓度)。

则染料脱色率=(a-a 1)/a #100%。

生物量的测定:菌体过滤并用蒸馏水数次冲洗后测其湿重。

1 5 酶活测定L i P的测定[12]∃0 2mol/L酒石酸缓冲液(p H值3 0)1 5mL,15mm ol/L藜芦醇1 0mL,粗酶液0 4mL,15mmol/L H2O20 1mL启动反应,25 水浴3m i n,于310n m测其吸光度,以0 1mL缓冲液代替H2O2作空白对照,定义每分钟使1 mo l的藜芦醇氧化成藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

M nP的测定[12]∃0 1mo l/L乳酸钠缓冲液(p H值4 5)3 4mL,40mmol/L M nSO40 1mL,粗酶液0 4mL,1 6mmol/L H2O20 1mL启动反应,25 水浴5m in,于240n m测其吸光度,以0 1mL缓冲液代替M nSO4作空白对照,定义每分钟氧化1 m oM l n2+成为M n3+所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

Lac的测定方法见参考文献[13]。

2 结果与讨论2 1 裂褶菌F17对刚果红脱色的影响因素2 1 1 培养温度对脱色率的影响本实验设置了5个温度梯度:20 、28 、35 、40 、45 ,在初始p H值4 5的条件下培养3d后加入染料,终浓度为100mg/L,不同时间段刚果红的脱色率如图1所示。

由图可以看出,温度对脱色率的影响非常显著,20 时染料的脱色率较低,28 时脱色最佳, 72h后脱色率能达64 2%,35 、40 、45 时染料的脱色率下降较大。

温度是菌体生长和酶作用的重要因素,根据实验结果,选择28 作为最佳脱色温度。

2 1 2 p H值对脱色率的影响表1 培养基p H值变化情况T ab l e1The change of pH of cu lt u re m ed i um阶段p H初始3 04 04 55 06 0培养3天2 53 64 04 04 2调节限氮培养基的p H值为3 0、4 0、4 5、5 0、6 0,菌体培养3d后加入染料,终浓度为100mg/L,限氮培养基p H值变化情况见表1,不同时间段刚果红的脱色率见图2。

由表1可以看出,菌体真正脱色p H值是在2 5~4 2之间,说明菌体在生长代谢过程中有产酸现象,导致p H值下降。

由图2可以看出,初始pH 值在4 5~6之间,染料均有较高的脱色率,故选择初始p H值4 5作为最佳脱色p H值。

2 13 染料加入时间对脱色率的影响分别在摇瓶接种后的第2d、3d、4d、5d加入染料,终浓度为100m g/L,不同时间段刚果红的脱色率见图3。

由图结果可知,染料于接种后的第2d加入,脱色率很低,可能染料对菌体生长及代谢存在抑制作用;3d 或4d后加入,脱色率明显提高。

本实验选择在接种后的第3d加入染料。

脱色时间(h)ti m e图1 培养温度对刚果红脱色率的影响( )F i g1E ffect of cu lt u re te m perat u re on t he decol orizati onpercen t age of Congo red()脱色时间(h)ti m e图2 p H值对刚果红脱色率的影响F i g2E ffect of p H on t he deco l ori zati on percen t age of Congo red2 1 4 染料浓度对脱色率的影响菌体培养3d后,分别加入浓度为50mg/L、100mg/ L、150mg/L、200mg/L的染料,测定不同时间段刚果红的脱色率,结果见图4。

由图可见,刚果红浓度增大,裂褶菌F17保持一定的脱色率,并且,在刚果红浓度100mg/L内,随浓度增大脱色率反而提高,当染料浓度达到200mg/L时,脱色率下降较大,而且通过实验观察发现,72h后菌体仍吸附大量染料。

表明高浓度的染料对降解有一定的抑制作用,脱色以吸附为主。

脱色时间(h)ti m e图3 染料加入时间对刚果红脱色率的影响(d)F i g3E ffect of the ti m e of dye add ition on thed ecolorizati on p ercentage of Congo red(d)脱色时间(h)ti m e图4染料浓度对刚果红脱色率的影响(m g /L)F i g 4E ffect of dye concentrati on on t he decolorizati onpercentage of Congo red(m g /L)2 1 5 诱导因子的加入对脱色率的影响分别在限氮培养基中补充终浓度为0 5mm ol/L 、1 0mmol /L 、1 5mmol /L 、2 0mmo l/L 的藜芦醇,结果见图5。

另外,分别在另组限氮培养基中补充终浓度为0 05%、0 1%、0 5%、1 0%的吐温80,结果见图6。

由图可知,当藜芦醇和吐温80的浓度分别达到1 0mmol /L 和0 1%时,刚果红的脱色率和脱色速率都有显著提高,脱色24h 后,脱色率就分别达到70 5%和63 8%,72h 后脱色率分别为89%和92 9%。

随着浓度的增加,脱色率相差不大,故选择藜芦醇和吐温80的最佳补充浓度分别为1 0mmo l/L 和0 1%。

脱色时间(h)ti m e图5 藜芦醇对刚果红脱色率的影响(mm ol/L)Fig 5E ffect of veratryl alcoho l on the decol oriz ati on percen tageof Congo red(mmol/L)脱色时间(h)ti m e图6 吐温80对刚果红脱色率的影响F i g 6E ffect of t w een 80on the decol oriz ati on percen tage ofC ongo red2 1 6 天然物质对脱色率的影响分别在限氮培养基中补充终浓度为20g /L 、50g /L 、100g /L 、150g /L 的土豆汁;另外,分别在另组限氮培养基中补充终浓度为1g /L 、3g /L 、5g /L 、7g /L 的松木屑,进行脱色试验。

研究结果得出,终浓度为50g /L 的土豆汁或3g /L 的松木屑,都能明显提高刚果红的脱色率和脱色速率。