2011-10-12-1 微小RNA-29b体外抑制皮肤成纤维细胞胶原蛋白1的研究

ｍｍ×５ ｍｍ
ｌａｌ（１：５００）、ｌａ２（１：１０００）、Ｂ．ａｃｔｉｎ（１：３０００）。蛋白条 带经软件Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ定量分析。 ６．荧光素报告载体构建和检测：根据Ｖａｎ Ｒｏｏｉｊ 等¨１报道方法，应用ＰＣＲ将胶原蛋白ｌａｌ和ｌａ２各自 ３’端非翻译区（３’．ＵＴＲ）中含有可能的ｍｉＲ－２９ｂ结合 位点的片段扩增、克隆到荧光素报告酶载体ｐＧＬ３中， 后经测序鉴定。将成功构建的报告载体分别定义为 ｐＧＬ３－ｍｉＲ－２９ｂ・ｃｏｉｌａｌ和ｐＧＬ３－ｍｉＲ－２９ｂ－ｃｏｌｌａ２。将
０ｆ ｍｉＲ－２９ｂ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｌ ａｌ
ａｎｄ ｌ ｏ【２（ｍＲＮＡ：５６．８％ａｎｄ
ｔｅｉｎ：５１．６％ａｎｄ ４０．８％），ｗｈｅｒｅａｓ ｍｉＲ－２９ｂ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅｍ ａｔ ｂｏｔｈ ｍＲＮＡ（４．４ ｆｏｌｄｓ ａｎｄ ３．６ ｆｏｌｄｓ）ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ（２．２ ｆｏｌｄｓ ａｎｄ １．７ ｆｏｌｄｓ）．Ｔｈｅ ｈｅｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ（５２．１％ａｎｄ ４３．４％）ｗｈｅｎ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏ．ｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＷＵ
Ｙｕ．ｎｏｎｇ。Ｅｍａｉｌ：ｗｙｌｌ２８０＠１６３．ｃｏｒｎ
Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅｓ ｏｆ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｇｅｎ １ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｋｉｎ
ｍｉｃｒｏＩ心『Ａ－２９ｂ ｏｎ ｃｏｌｌａｇｅｎ １ ｉｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ 财ⅣＧ Ｙａｈ．１ｉｎｇ‘．形４ⅣＧ磊－ ｋ，ＹＡＮＧ Ｍｉ：｝ｉ吼ｇ，ＣＨＥＮＧ Ｊ证，ＷＵ Ｙｕ—ｎｏｎｇ．’Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓ缸ｙ， ＮａｎｊｉｎＫ ２１∞２９．Ｃｈｉｎａ
ａｎｄ ｍｉＲ－９２
ｍＲＮＡ：ＲＮＡ提取按照ｍｉｒＶａｎａＴＭ
ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
等。ｍｉＲ－２９家族成员之间具有共同的种子序列，与胶 原蛋白ｌａｌ和ｌａ２均有数个可能的保守结合位点。 ２．ｍｉＲ．２９ｂ体外抑制皮肤成纤维细胞中胶原蛋白 ｌ的表达：应用体外细胞转染ｍｉＲ－２９ｂ模拟物和抑制 物的方法观察胶原蛋白ｌａｌ和ｌａ２的表达变化。转染 模拟物４８ ｈ后，细胞内ｍｉＲ－２９ｂ的表达水平比对照组 增加了１４．８倍。应用定量ＲＴ－ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检 测转染后细胞内胶原蛋白１ａｌ和１ａ２的ｍＲＮＡ和蛋白 表达变化，结果显示（图１）：与对照组比较，两者在 ｍＲＮＡ水平上分别降低了５６．８％和４７．８％（Ｉｔ＝３， Ｐ＜０．０５），在蛋白水平上分别降低了５１．６％和 ４０．８％（／７，＝３，Ｐ＜０．０５）。进一步采用体外转染２－甲 氧基修饰的寡核苷酸（抑制物），特异性抑制内源性 ｍｉＲ．２９ｂ表达。转染后４８ ｈ，内源性的ｍｉＲ－２９ｂ表达 水平明显降低，约降低了８５．１％。细胞中胶原蛋白 ｌａｌ和ｌａ２的ｍＲＮＡ表达水平分别上升了４．４倍和 ３．６倍（ｎ＝３，Ｐ＜０．０１），相应蛋白表达分别上升了 ２．２倍和１．７倍（，ｌ＝３，Ｐ＜Ｏ。０５），见图２。 ３．ｍｉＲ．２９ｂ通过与胶原蛋白ｌａｌ和ｌａ２的３’ＵＴＲ 相结合发挥调控作用：应用ＰＣＲ法将含有ｍｉＲ．２９ｂ与
・５４１・
司），胶原蛋白１一抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司），ｐ．肌动蛋 白（１３一ａｃｔｉｎ）一抗（Ｓｉｇｍａ公司），进口分装二抗（上海康 成生物公司）。ｍｉＲＮＡ模拟物和抑制剂由上海吉玛公 司合成纯化。 ２．人皮肤成纤维细胞原代培养和体外转染：人皮 肤取自整形外科手术丢弃的标本，术前告知患者并取 得知情同意。获取标本后，经７５％乙醇浸泡和抗生素 冲洗３次后，转移至清洁培养皿，切割成５
ａｎｄ ｌ以ｗｅｒｅ
ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｏｆ－
ｍｅａｇｕＩ℃ｄ ｂｙ ｒｅａｌ．ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｏｒ
ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ．ＰＣＲ）ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｍ
ｔｅｒ ｆｉｂｍｂｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉＲ－２９ｂ ｍｉｍｉｃｓ
Ｑｉａｇｅｎ），定量ＰＣＲ试剂盒ＳＹＢＲ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ逆转录 （ＲＴ）一ＰＣＲ（大连宝生物公司），蛋白定量试剂盒
Ｂｒａｄｆｏｒｄ
ａｓｓａｙ、荧光素报告载体ｐＧＬ３和报告酶检测试 剂盒Ｄｕａｌ－Ｌｕｅｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ公
万方数据
主垡塞验处叠盘查垫！！生垒旦筮垫鲞筮堡翅ｇ！ｉ！』量理§！氇：△Ｐ型！Ｑ！！：！丛：垫：塑！：璺
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｉＲＮＡ
Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ），ｍｉＲＮＡ定量聚合酶链反应
Ｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ，
（ＰＣＲ）检测试剂ｍｉＳｅｆｉｐｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ｍｉＳｃｒｉｐｔ
ＤＯＩ：ＩＯ．３７６０／ｃｎｍ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－９０３０・２０１１・０４・０２１ 基金项目：南京医科大学科技发展基金资助项目（２０１０ＮＪＭＵｌｌ６） 作者单位：２１００２９南京医科大学口腔医学研究所（王琰玲、王子露、 杨迷芳）；南京医科大学口腔医学研究所南京医科大学附属１２１腔医院 口腔颌面外科（程杰、吴煜农） 通信作者：吴煜农，Ｅｍａｉｌ：ｗｙｌｌ２８０＠１６３．ｃｏｕｉ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｐｒｉｍｅｒ ａｓｓａｙ，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
１．生物信息学预测以胶原蛋白ｌａｌ和１ａ２为靶的 ｍｉＲＮＡ分子：应用ｍｉＲＧｅｎ数据库中的ＰｉｃＴａｒ（４－ｗａｙ） 和ＴａｒｇｅｔＳｅａｎＳ来分别预测可能靶向调控胶原蛋白ｌａｌ 和ｌａ２的ｍｉＲＮＡ分子，结果发现每个基因均可能受数 个的ｍｉＲＮＡ分子所调控。其中针对胶原蛋白１ａｌ和 ｌａ２被上述两个软件均预测到的ｍｉＲＮＡ分子分别是 ｌｅｔ－７家族成员、ｍｉＲ．１９６ａ／ｂ、ｍｉＲ．２９ａ／ｂ／ｅ
Ｋｉｔ说明书进行，应用分光光度计Ｎａｎｏｄｒｏｐ测定浓度。
取等量０．５峭ＲＮＡ按照ｍｉＳｃｒｉｐｔ
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔｌ～ＲＴ—ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ和ＳＹＢＲ
ｋｉｔ试剂盒说明书进行相应逆转
录和定量ＰＣＲ反应。ｍｉＲ－２９ｂ和内参Ｕ６引物购自 Ｑｉａｇｅｎ。胶原蛋白１ａｌ、ｌａ２和内参ＧＡＰＤＨ引物序列 应用Ｐｒｉｍｅｒ．Ｂｌａｓｔ设计，序列如下：Ｃｏｌ
ａｎｄ ｍｉＲ－２９ｂ ｍｉｍｉｃｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｉｎ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． ｍｉＲ－２９ｂ ｉｓ
ａ
ｎｏｖｅｌ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｆｉｐｔｉｏｎａｌ
ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ
ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ １
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ；ｍｉｅｒｏＲＮＡ；Ｃｏｌｌａｇｅｎ
１ ａ２
ＮＩ彤３１３接种于２４孔板过夜，后将ｍｉＲ－２９ｂ模拟物
（１００ ｎｍｏｌ／Ｌ）和荧光素报告载体ｐＧＬ３一ｍｉＲ－２９ｂ－
ｅｏｌｌａｌ／ｃｏｌｌ以应用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００进行共转染。
转染后２４ ｈ，应用Ｄｕａｌ．Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ
Ａｓｓａｙ试剂
盒以海肾荧光素酶为内参检测荧光素酶活性变化。 ７．统计学方法：数据以均数±标准差（元±ｓ）表示， 应用ＳＰＳＳ统计软件１３．０行Ｓｔｕｄｅｎｔ—ｔ检验。 结 果
应用荧光素报告酶实验验证胶原蛋白１是否受ｍｉＲ－２９ｂ直接调控。结果 原蛋白１－ａ１ ｍＲＮＡ５６．８％／蛋白５１．６％、ａ２
ｍＲＮＡ
原蛋白１．ａｌ ｍＲＮＡ４．４倍／蛋白３．６倍、以ｍＲＮＡ２．２倍／蛋白１．７倍。体外共转染报告载体和模拟 物后显著降低报告载体的荧光素酶活性，分别达５２．１％和４３．４％。且差异均有统计学意义（Ｐ＜ ０．０５）。结论ｍｉＲ－２９ｂ是参与皮肤成纤维细胞胶原蛋白１的转录后调控分子之一。 【关键词】成纤维细胞；微小ＲＮＡ；胶原蛋白ｌ；转录
１ａｌ ｆｏｒｗａｒｄ：５’． ＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＣＴＧＣＣ－３’ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＣＣＣＹＦ－ ＧＧＧＴＣＣＣＴＣＧＡＣＧＣ－３’；Ｃｏｌ ｌａ２ ｆｏｒｗａｒｄ：５’一ＴＡＣ・ ＣＴＣＣＧＣＣＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧ－３’ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＴＣＴＣＣＧＧＣＴ— ＧＧＧＣＣＣＴｒｒＣＴ．３’：ＧＡＰＤＨ ｆｏｒｗａｒｄ；５’－ＧＴＣＧＣＣＡＧＣ－ ＣＧＡＧＣＣＡＣＡＴＣ－３’ ｒｅｖｅｒｓｅ：５’．ＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴ—
大小的组织块。将其放入灭菌离心管，加入新鲜配置 ０．５％的Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩ置于４℃冰箱过夜。后应用显微器 械将组织块表面薄层上皮轻轻撕去，真皮层进一步切 成小块后放置于培养皿中行常规组织块法培养旧Ｊ。 待细胞爬出长满８０％后行常规细胞传代培养。选用 第３～４代细胞作为后续实验用。转染前将人皮肤成纤 维细胞以５×１０５个／ＩＩｌｌ浓度接种于６孔板过夜，待细胞 汇合６０％左右，按照Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００说明书进行 ｍｉＲＮＡ模拟物和抑制物的转染。转染后４８ ｈ，提取 ＲＮＡ和蛋白进行定量ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测。 ３．生物信息学软件预测可能调控胶原蛋白ｌ ａ１和 １ａ２的ｍｉＲＮＡ分子：应用在线生物学信息学平台 ｍｉＲＧｅｎ中ＰｉｃＴａｒ（４－ｗａｙ）和ＴａｒｇｅｔＳｃａｎＳ分别预测针 对胶原蛋白ｌａｌ和ｌａ２的ｍｉＲＮＡ分子Ｍ Ｊ。为了减少 假阳性，本实验中以上述两种算法所得的重叠ｍｉＲＮＡ 为候选分子。 ４．定量ＲＴ—ＰＣＲ检测ｍｉＲ－２９ｂ和胶原蛋白１ａｌ和
ｌ；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
在皮肤创口愈合过程中胶原纤维过度合成和堆积 是导致瘢痕形成的重要原因之一…。微小ＲＮＡ分子 （ｍｉＲＮＡ）是近年来发现一类重要的非编码ＲＮＡ分 子。主要是以５’端第２—８位核苷酸与靶基因３’端非 翻译区（３’ＵＴＲ）进行互补配对结合后，在转录后水平 参与基因调控，其在增殖、分化、凋亡等多种细胞生物 学过程中发挥重要作用心］。本研究旨在通过生物信 息学和体外细胞学实验寻找调控皮肤成纤维细胞胶原 蛋白１的ｍｉＲＮＡ分子，探讨胶原合成代谢的分子