糖尿病肾病肾脏微小血管病变实验研究_张丽芬_黄文政_吕仁和

1. 2. 3 图像分析和测量方法 图像采集用 Leica DM 4000B － DFC 300 FX（ 德国） 数据成像系统，图像分析 和处理采用 QWin 图像处理与分析软件。
收稿日期： 2014 － 02 － 07 基金项目： 国家自然科学基金青年基金项目（ 30500671） 作者简介： 张丽芬（ 1973 － ） ，女，河北人，副主任医师，硕士研究生导师，
博士，研究方向： 慢性肾病的发病机制及防治研究。
中心区大量神经元细胞坏死，对治疗无反应。但在本 实验中发现，缺血 48 h、72 h 各治疗组间 IL － 1β 表达 无差异，但与模型组比较，均有显著差异（ P ＜ 0. 01 ） ， 表明各治疗组在持续的缺血状态下不仅有效，而且效 果颇佳。此结论有待今后进一步研究。
Key words： peritubular capillaries （ PTC） ； glomerular injury sclerosis （ GIS） ； diabetic nephropathy
高血糖在糖尿病肾病发生发展中起重要作用［1］。 持续的高血糖是损伤大小血管的独立危险因素。高浓 度的葡萄糖损伤内皮细胞，使内皮细胞生存期缩短，表
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损害已是共识［3］。目前对糖尿病肾病的研究多集中在 肾小球和肾小管间质方面，对于肾脏细胞的研究也集 中在肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞，对于肾血管 及内皮细胞的研究还很少。
本研究在糖尿病肾病模型成功的基础上，对糖尿 病肾病的肾脏标本进行了多种染色，采用病理图像分 析技术，参考国外文献的肾脏形态学测量方法，对糖尿 病肾病肾脏病理的肾小球硬化指数、肾小球体积、细胞 外基质、肾小管周围毛细血管网（ PTC） 、肾脏血管等进 行了动态观察，得出科学数据。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 实 验 动 物 选 用 健 康 SD 大 鼠 40 只，SSPF / VAF 清洁级，雄性，体重 180 ～ 220 g，动物合格证号： SCXK（ 京） 2002 － 0003，由北京维通利华实验动物公司 提供。 1. 1. 2 实验试剂和仪器 链脲佐菌素（ Streptozotocin， STZ） ，Sigma 公司（ 批号： B69776） 。HE 染色试剂（ Hematoxylin － and － Eosin Stains） 由北京大学人民医院中 心实验室病理研究室提供； PAS 染色试剂盒 （ Periodic Acid － Schiff Ｒeaction ） 、PASM 染 色 试 剂 盒 （ Periodic Acid － Silver Methenamine ） 、马 松 三 色 染 色 试 剂 盒 （ Masson's Trichrome Stains） 均由北京天合力恩科技发 展中心提供，抗人 α － SMA 单克隆抗体（ MAB － 0003； Maxim Biotech Inc，San Francisco，CA，USA； 1： 50 ） 。 ChemMateTMEnVision 二步法抗兔 / 鼠通用型免疫组化 检测 试 剂 盒 （ GK500705； ChemMateTMEnVision Detection Kit，Peroxidase / DAB，Ｒabbit / Mouse，DakoCy － . tomation，Denmark） 。病理切片机（ Leica ＲM 2135 德 国） 、病理包埋机（ Leica EG1160 德国） 、烤片机、病理 切片 架、立 式 染 缸、孵 育 盒、定 时 器、冲 洗 瓶、Leica HI1220 水浴锅、图像采集系统（ Leica DM 4000B － DFC 300 FX） 。图像数据分析处理采用 Leica Qwin 图像分 析软件。 1. 2 方法 1. 2. 1 模型制作 大鼠经普通饲料适应性饲养 1 周 后，随机抽取 8 只作为假手术对照组，大鼠在腹腔麻醉 状态下，打开腹腔，剥离左肾脂肪包膜，关闭腹腔，缝合 切口。余 32 只大鼠行糖尿病肾病造模术，先行左肾摘 除，术后 1 周 尾 静 脉 注 射 STZ 35 mg · kg － 1 （ 用 0. 1 mmol·L － 1 枸橼酸缓冲液，pH = 4. 2，4 ℃ ，配制成 2% STZ 溶液 ） ，72 h 后，测 空 腹 血 糖 （ FPG ） 及 尿 糖，以 FPG≥16. 65 mmol·L － 1、尿糖强阳性、尿量大于假手 术组 50% 者为模型制备成功。实验期间每组大鼠分 笼饲养，随意饮水，食用标准动物饲料。 1. 2. 2 标本采集及检测 分别于实验 4、8、12、16、20 周选取各组大鼠 5 只，1. 5% 戊巴比妥钠 50 mg / kg 腹 腔注射麻醉后，迅速剖腹取出右肾，剥离肾包膜，肾组 织自肾门切成两片，放入 10% 中性福尔马林固定。常 规脱水、透明、石蜡包埋，连续 4 μm 切片，固定于载玻 片上，进行 HE、PAS 和 Masson 染色。α － SMA 免疫组 织化学染色标记肾小血管。在 α － SMA 染色下肾小血 管呈深棕色。重点观察肾小球系膜增生、硬化及基底 膜（ GBM） 厚薄，观察肾小管间质形态学和肾小管周围 血管（ PCT） 网改变。
关键词： 肾小管间质毛细血管网; 肾小球硬化指数; 糖尿病肾病 中图分类号： Ｒ587． 2 文献标志码： A 文章编号： 1000-1719（ 2014） 08-1758-04
Study on Ｒenal Microvascular Disease of Diabetic Neph毛细血管收缩，肾小球基底膜增厚等，进 而引 起 肾 小 球 系 膜 细 胞 病 变，合 成 大 量 的 细 胞 外 基 质［2］。肾脏微小血管和内皮细胞在糖尿病肾病中受到
宫牛黄丸组间无差异。可见在这两个时段内，井穴放 血、安宫牛黄丸、针药结合组均有抑制 IL － 1β 表达的 作用，尤以针药结合效果最佳。结果证明在脑缺血早 期，井穴放血与安宫牛黄丸结合能够有效抑制致热性 细胞因子 IL － 1β 的表达，从而起到很好的泄热抗炎效 果，以发挥脑保护作用。另外，已知缺血状态下 IL － 1β 过多持续的产生，会出现神经损伤毒性，造成缺血
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辽宁中医杂志 2014 年第 41 卷第 8 期 DOI∶10． 13192 / j． issn． 1000-1719． 2014． 08． 087
糖尿病肾病肾脏微小血管病变实验研究
张丽芬1 ，黄文政2 ，吕仁和3
（ 1． 北京中医药大学第三附属医院肾内科，北京 100029； 2． 天津中医药大学第一附属医院肾内科，天津 300193； 3． 北京中医药大学东直门医院肾病内分泌科，北京 100700）
摘 要： 目的: 观察微血管损伤在糖尿病肾病中发病的关键作用。方法: 以单侧肾切除并链脲佐菌素尾静脉注射建 立糖尿病肾病模型，测定动态观察 4、8、12、16、20 周肾小管周围毛细血管网( PTC) 、血管内膜厚度、肾小球硬化指数、肾 小球毛细血管袢、肾小球体积、细胞外基质等指标。结果: 随造模时间延长，糖尿病肾病组大鼠肾小球毛细血管袢开放面 积减少，肾小球体积增大，肾间质 PTC 网减少，动脉内膜增厚，肾小球硬化指数、系膜基质增加。与假手术组比较均有统 计学意义( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) 。结论: 肾间质 PTC 网与肾小球硬化呈明显负相关，PTC 网越少，肾小球毛细血管褂开 放面积减少，肾小球硬化更严重; 同时 PTC 网减少导致肾缺血也是肾间质纤维化和肾乳头坏死的原因。
Abstract： Objective： To explore the key pathogenesis of microvascular disease in diabetic nephropathy． Methods： We established diabetic nephropathy model in rats with unilateral kidney and streptozotocin intravenously． After the success of modeling，we dynamically observed peritubular capillaries （ PTC） ，ratio of intimal thickening （ ＲIT） ，glomerular injury sclerosis （ GIS） ，glomerular tuft area （ TA） ，glomerular tuft volume （ GV） and extracellular matrixc （ ECM） at experimental 4th，8th，12th，16th，20th weekend． Ｒesults： With the modeling time prolonged，diabetic nephropathy rats glomerular capillary open area was reduced and glomerular volume grew bigger and peritubular capillaries（ PTC） number was reduced． The ratio of intimal thickening was thickening． The glomerular injury sclerosis （ GIS） and extracellular matrixc （ ECM） were increased． There were statistical significance compared with that of the sham operation group（ P ＜ 0． 05 or P ＜ 0． 01） ． Conclusion： There is a strong correlation between PTC and GIS in DN． The lesser the PTC，the more severe the glomerularsclerosis． At the same time，reduction of peritubular capillaries also leads to interstitial fibrosis and renal papillary necrosis of kidney．