康为世纪 CW0503高纯度质粒大提试剂盒

PurePlasmid Maxi Kit

高纯度质粒大提试剂盒

Version06302010‐2.1

I 组分说明

Catalog no. CW0503 CW0503A

Number of preps. 10 2

Buffer P1 100 ml 25 ml

Buffer P2 100 ml 25 ml

Buffer P3 100 ml 25 ml

Buffer EB 30 ml 10 ml

RNase A(10 mg/ml) 1 ml 250 μl

Fliter 10 2

Collection Tube(50ml) 10 2

Protocol 1 1

II 保存条件

该试剂盒室温干燥条件下（15-25℃）可保存一年，更长的保存时间可置于2-8℃。若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀。单独包装的RNase A可室温（15-25℃）保存，长时间保存置于2-8℃，加入RNase A后的Buffer P1置于2-8℃保存，可以稳定保存半年。

III 产品简介

本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，通过独特的缓冲系统和异丙醇沉淀方法，可快速获得大量高纯度的质粒DNA。由本试剂盒所得质粒可直接用于转染细胞，DNA测序，PCR，体外转录，转化细菌，内切酶消化等。

IV 注意事项

1．Buffer P1 在使用前先加入RNase A（将试剂盒中提供的RNase A 全部加入），混匀，置于2–8℃保存。

2．使用前请先检查Buffer P2 和Buffer P3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。3．注意不要直接接触Buffer P2 和Buffer P3，使用后应立即盖紧盖子。

4．提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。

V 需要客户自备的试剂

1.异丙醇

2.5M NaCl溶液

Ⅵ 操作步骤

1.取100ml （根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200ml）过夜培养的菌液，加入离心管中，10,000 rpm

(~11,500×g )离心3 分钟收集细菌，尽量吸弃上清。

注意：质粒拷贝数较低或>10kb时，可以通过二次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，同时后续所加试剂Buffer P1、P2及P3的量需加倍。

2.向留有菌体沉淀的离心管中加入10 ml Buffer P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器充分混

匀，悬浮细菌沉淀。

注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低

3.向离心管中加入10 ml BufferP2，温和地上下颠倒混匀6－8 次，使菌体充分裂解，室温放置5 分钟。

注意：不要剧烈震荡，以免造成所提质粒中基因组DNA污染。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。

4.向离心管中加入10 ml Buffer P3，立即温和地上下颠倒混匀6–8 次，此时出现白色絮状沉淀，然后室温放置10分钟

左右，10,000 rpm (~11,500×g )离心5-10 分钟。

注意：Buffer P3 加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。

5.将上清全部倒入Fliter 中，8,000 rpm (~6,200×g )离心3-5分钟，滤液收集在Collection Tube中。

6.向滤液中加入0.35 倍滤液体积的异丙醇和0.5倍异丙醇体积的5M NaCl，上下颠倒充分混匀。

注意：加入异丙醇过多容易导致RNA 污染

7.4℃，10,000 rpm (~11,500×g )离心30 分钟，小心弃上清，注意不要丢掉沉淀。

8.向管中加入6ml 70%乙醇充分洗涤沉淀，4℃ 10,000 rpm (~11,500×g )离心10分钟，小心弃上清，注意不要丢掉沉

淀。

9.重复步骤8。

10.室温干燥10-20 分钟，加入1-1.5ml Buffer EB， 充分溶解沉淀。DNA 产物应-20℃保存。