QIAGEN最新试剂盒质粒大提操作步骤(翻译版)

QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit

Catalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。

在开始之前作如下准备

1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P1

2）pre-chill Buffer P3 4°C存放。

3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。

4）准备异丙醇。

5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。

大量质粒提取过程

在LB培养基中种植转化的E.coli菌。使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。

操作步骤如下

1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。

2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。

3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室

温放置5min。如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。

4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。

5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。

6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。

7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。

8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。

9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。

10用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip柱。

11再用15ml Buffer QN洗脱DNA，用离心管收集DNA洗脱液。

12加入10.5ml异丙醇到洗脱液中使DNA沉淀下来，混匀。大于15000×g，4℃离心30min，离心后小心倒出上清液。

13 洗DNA用5ml无内毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-100%乙醇到试剂盒的无内毒素水中)，15000g，4℃离心10min。小心倒出上清液不要碰到质粒。

14烘干离心管底部的质粒5-10min。用合适体积的无内毒素的Buffer TE重新溶解DNA。

15检测DNA质粒的浓度并记录。