牛奶中酪蛋白的提取与分析培训讲学
牛奶中酪蛋白的提取
实验五牛奶中酪蛋白的提取
一、实验目的
学习从牛奶中制备酪蛋白的方法
了解从牛奶中制取酪蛋白的原理
二、实验原理
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5/100ml。
酪蛋白是含磷蛋白质的混合物，相对密度1.25~1.31，不溶于水、醇、有机溶剂，等电点为4.7利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯的酪蛋白。
三、实验材料与仪器
纯牛奶、白醋、滤纸、被子、锅等
四、实验步骤
将250ml或200ml牛奶置于锅中，隔水水浴小火加热，不断搅拌，加热至沸腾时停止搅拌和加热。
在牛奶中加入少量盐，并慢慢加入白醋，并轻轻搅拌，观察到牛奶中开始有白色絮状沉淀出现后，停止搅拌和加醋，静置10min。
待上述悬浮液冷却至室温，用滤纸过滤，得到滤渣。
用水清洗滤渣3次，每次都过滤得滤渣。
滤渣再用白酒清洗3次，每次都过滤得滤渣。
将滤渣摊在滤纸上风干，得酪蛋白制品
称重并品尝酪蛋白制品
五、实验结果记录与分析
酪蛋白（g/100ml）=（酪蛋白（g）/200ml或250ml ）*100
得率=测得含量/理论含量*100%
酪蛋白=（13.3g/200ml）*100=6.65 g/ml
结论：闻起来有较大的奶香味和酒精味。
在过滤的过程中，粘在滤纸上跟纱布，抠不下来，所以数据应该会偏小了。
实验10 从牛奶中分离酪蛋白
四、实验操作步骤
1. 酪蛋白的粗提 在烧杯中加入2g脱脂奶粉，再加入40℃，pH=4.7的醋 酸-醋酸钠缓冲溶液40ml，用pH精密试纸检验液体的pH值。 将上述悬浮液冷却至室温。离心5 min （3000 r /min）。弃 去清液，得酪蛋白粗制品。 2.酪蛋白的纯化 (1)用水洗涤沉淀 2次：离心管中加入5ml蒸馏水，用玻棒充分 搅拌，洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白，乳糖以及 残留的缓冲溶液），离心5min（3 000r/min），弃去上清液。 (2)在沉淀中加入5ml95%乙醇，搅拌片刻，用乙醇洗涤主要是 除去磷脂类物质。将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用 乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用5ml乙醚洗沉淀2次以 除去脂肪类物质，抽干。
三、实验用品
材料：脱脂乳或脱脂奶粉。 仪器用具：离心机、抽滤装置、精密pH试纸、电炉、烧杯、 温度计、电子天平 试剂： 1、95%乙醇 2、无水乙醚 3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液 先配A液与B液：A液：0.2mol/L醋酸钠溶液 称NaAC· 3H2O 54.44g，定容至2000ml；B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优 纯 醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。取A液1770ml， B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液。 4、乙醇——乙醚混合液：乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）
搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中
和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能
使乳白蛋白沉淀。过滤除去沉淀，在滤液中加入
1～2粒沸石，加热浓缩至3～5ml，加入10ml 95% 乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后 在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。 加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇
酪蛋白的提取与测定
牛乳中酪蛋白的制备与浓度测定一、实验目的1、学习从牛乳中分离酪蛋白的原理和方法2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理，熟悉紫外分光光度计的使用4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度二、实验原理1、准备酪蛋白原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。
牛乳在PH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称为乳清蛋白。
酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。
乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水和能力很强，分散性高，在乳中呈高分子状态。
本法利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
2、紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理：大多数蛋白质由于有酷氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定。
但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm，通过测定在280nm和260nm时A的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度。
3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理：考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。
在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。
三、实验器材与试剂1、制备酪蛋白：烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、95%乙醇、无水乙醚2、紫外光吸收法：紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿0.9%NaCl、1mol/LNaOH溶液、1mol/L乙酸溶液3、考马斯亮蓝法：紫外可见光分光光度计、试管1.5cm×15cm(×9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白（0.1mg/ml）、考马斯亮蓝、0.9%NaCl四、实验步骤制备酪蛋白1、将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃2、将20mL牛奶加热至40℃，在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3、用精密pH试纸调pH至4.7，可见溶液变为乳白色悬浮液4、待悬浮液冷却至室温，4000rpm离心5min，弃上清，得酪蛋白粗制品5、用蒸馏水洗沉淀3次，3000rpm离心5min，弃上清6、在沉淀中加入20mL95％乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤7、用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次（10ml/次），最后用乙醚洗涤沉淀2次（10ml/次），抽干8、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品9、准确称量，计算含量和得率紫外光吸收法1．取待测样品溶液置于的石英比色皿中，于分光光度计波长280nm和260nm，分别读取A280nm和A260nm，用生理盐水为比色空白对照。
牛奶中酪蛋白的提取 (1)_19090
牛奶中酪蛋白的分离
一、引言
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。
酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在，胶粒直径约为20～800纳米，平均为100纳米。
在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。
本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7-4.8时，酪蛋白沉淀。
二、实验材料和试剂
1.脱脂乳或脱脂奶粉。
2.器材：（1）台式离心机；（2）精密pH试纸或酸度计；（4）表面皿；（5）纱布或滤纸；（6）毛细管或细口吸管；（7）离心管（10mL，或与离心机配套）若干，本实验中用10mL离心管约5个/小组。
三、实验步骤
1. 从牛奶中分离酪蛋白
在烧杯中加入2g脱脂奶粉（纯牛奶水分含量87-88%），再加入40℃，PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2mol/L或1mol/L)，用PH精密试纸检验液体的PH值，调至PH4.8。
静置冷却至室温，倾去上层清液，剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中，用转速为3000转/分离心分离3～5分钟，倾出上层清液，（合并于上一清液中），得酪蛋白粗品。
2. 酪蛋白含量的测定
离心管中加入5mL蒸馏水，用玻棒充分搅拌，洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白，乳糖以及残留的缓冲溶液），离心后弃去上层液，再用蒸馏水洗一次。
于试管中加入5mL95%乙醇，充分搅拌，离心后弃去乙醇溶液，用乙醇洗涤主要是除去磷脂类物质。
最后再用5mL 乙醚以同样方法洗涤，以除去脂肪类物质。
将酪蛋白沉淀物凉干，称重、并计算得率（酪蛋白约占牛奶蛋白80%）。
从牛奶中提取酪蛋白
实验二从牛奶中提取酪蛋白一、实验目的要求1.学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。
2.了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。
二、实验原理牛乳中的主要蛋白质是酪蛋白，含量约为3.5g/100ml。
酪蛋白是含磷蛋白质的混合物，相对密度1.25-1.31，不溶于水、醇、有机溶剂，等电点为4.7.利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH值调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
用乙醇洗涤沉淀物，除去脂质杂质后便可得到纯的酪蛋白。
三、原料与器材鲜牛奶、恒温水浴锅、台式离心机、抽滤装置。
四、试剂1.95%乙醇2.无水乙醚3.0.2mol/l的醋酸-醋酸钠缓冲液A液（0.2mol/l的醋酸-醋酸钠溶液）：称取NaAc.3H2O54.44g，定容至2000ml。
B液（0.2mol/l的醋酸-醋酸钠溶液）：称取优级纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g，定容至1000ml。
取A液1770ml与B液1230ml混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3000ml。
4.乙醇-乙醚混合液乙醇：乙醚=1：1（体积比）。
五、操作步骤1.将5ml牛奶置试管或小烧杯中，在水浴中加热至40℃，在搅拌下漫漫加入预热至40℃（应注意两种液体都应先预热至40℃再用），pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液5ml，用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7(用1%NaOH或10%醋酸溶液进行调整)。
观察牛奶开始有絮状沉淀出现后，保温一定时间使沉淀完全。
将上述悬浮液冷却至室温。
离心分离8min（8000r/min）或15min（2000r/min），弃去上清液，得到酪蛋白粗制品。
2.用蒸馏水洗涤沉淀3次（洗涤时将沉淀颗粒用干净吸管吹开或用毛细管的封闭一端搅开，充分洗涤），离心5min（12000r/min）或10min（3000r/min），弃去上清液。
3.在沉淀中加入3ml95%的乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。
用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次，最后用乙醚洗涤沉淀2次，抽干。
牛奶中酪蛋白的提取与分析
实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析实验材料：牛奶小组成员：实验时间：一：实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析二：报告撰写者三、小组成员实验仪器 温度计、布氏漏斗（*）、pH 试纸（*）、抽滤瓶（*）水浴锅、烧杯、量筒、表面皿（*）、电子天平（*）、2个1000ml 的容量瓶（*）、2张醋酸纤维薄膜（2cm ×8cm 厚度120nm ）成品（*）、培养皿9—10cm （*）、毛细管（*）、尺子、铅笔、单面刀片（*）、镊子、普通滤纸（*）、电泳槽、玻璃板8cm ×12cm （*）、752型分光光度计（*）、细布（*）0.5ml 、1.0ml 、2.0ml 、5.0ml 的移液管、试管、试管架、 四、实验材料牛奶（蒙牛特仑苏和伊利金典） 五、实验试剂 特仑苏400ml 、金典200ml 、1.66g 巴比妥（*）、12.76g 巴比妥钠（*）、0.5g 氨基黑10B （*）、50ml 甲醇AR （*）、100ml 冰醋酸AR （*） 、95%的乙醇250ml （*)、95%的乙醚100ml （*）、0.2mol/L 的乙酸100ml （*）、0.2mol/L 的乙酸钠100ml （*）、25g 氢氧化钠固体（*）标准酪蛋白、15mg 五水硫酸铜（*）、60mg 酒石酸钾钠（*） 所需试剂配制方法：乙醇乙醚混合液的配制： 10ml95%的乙醇10ml95%的乙醚乙醇钠缓冲液的配制： 0.2mol/L 的乙酸51ml0.2mol/L 的乙酸钠49ml 巴比妥钠缓冲液的配制： 巴比妥1.66g巴比妥钠12.76g染色液的配制： 0.5g 氨基黑10B 50ml 甲醇AR 10ml 冰醋酸AR 漂洗液的配制： 45ml95%乙醇AR 5ml 冰醋酸AR 蒸馏水透明液的配制： 25ml 的冰醋酸AR 75ml 的无水乙醇AR0.05mol/L 氢氧化钠溶液的配制： 16g 的氢氧化钠固体定容至1000ml 10%氢氧化钠溶液的配制： 5g 的氢氧化钠固体定容至50ml 双缩脲试剂的配制：15mg 五水硫酸铜60mg 酒石酸钾钠标准酪蛋白溶液A 的配制（10mg/ml ）： 用0.05mol/L 氢氧化钠溶液配制10ml从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液1、2的配制（2-9mg/ml ）：配制巴比妥钠缓冲液（pH8.6,0.06mol./L ）,将上述二者混合后定容于1000ml+40ml 蒸馏水，混匀既得染色液配制乙醇乙醚1:1的混合液配制pH4.6的乙酸钠缓冲液（0.2mol/l ）混匀得染色液混匀得透明液溶于5ml 蒸馏水，在搅拌情况下，加入10%氢氧化钠溶液3ml ，用蒸馏水稀释到10ml ，用棕色瓶避光保存用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制10ml标准酪蛋白溶液B的配制（1500μg/ml）：用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液3、4的配制（50-1500μg /ml）：用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制七、实验目的1.掌握从牛奶中提取酪蛋白的方法2.了解蛋白质分离纯化的基本办法3.学习电泳的基本原理及掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离酪蛋白的具体操作4.掌握双缩脲法和紫外吸收法测定蛋白质含量的原理及操作方法并比较两种方法5.熟悉分光光度计的原理和操作6.比较特仑苏与金典中的酪蛋白含量八、实验原理酪蛋白在其等电点时静电荷为零，同种电荷的相互排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调节到PH4.6，酪蛋白就可以从牛乳中分离出来。
牛奶中酪蛋白含量的测定
在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负 电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相 互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点 时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。酪蛋白的等电点为左右（不同结构的酪蛋 白等电点有所不同），本实验中将牛乳的 pH 调值时，酪蛋白就沉淀出来。
称取的酪蛋白样品质量为，稀释倍数为 500 倍。 =
=%
五、误差分析与讨论
1、本次制备实验中得到的蛋白质量较多，但纯度较低，分析原因如下： 1）得到的蛋白质略呈黄色，且有些发粘，说明可能脱脂不彻底，蛋白质产品中 含有脂质。 2）考马斯亮蓝 G520 染液中有沉淀，最后影响考马斯亮蓝-蛋白质复合物溶液的 吸光度。 3）配制标准溶液时操作上可能有误差，如往试管中加入溶液时挂在管壁，且最 终也没有与下方溶液混合均匀，导致标准溶液的浓度可能不准，致使标准曲线不 准，数据处理时也发现数据线性并不好，尤其是浓度较大时，虽然可能是超出考 马斯蓝线性范围，但不能排除操作失误的可能。 2、注意事项
1）试管提前一周清洗干净并晾干，否则制作标准曲线时无法保证各管浓度。并 且不干净的试管在加溶液时容易挂管壁，不利于控制标准蛋白液浓度。 2）在配制不同浓度标准蛋白液时，各组分的体积要准确移取，特别是量较少的 标准蛋白液，只要稍微洒出一点就会导致较大的相对误差 3）蛋白质粗品的洗涤一定要按照规范做，每一次离心洗涤时要将搅匀，在布氏 漏斗上洗涤时要先微接抽气管，待洗出液缓慢流出后，再接紧橡皮管抽干。
牛奶中酪蛋白的提取与分析Word版
牛奶中酪蛋白的提取与分析Word版酪蛋白是牛乳中含量最多的蛋白质，为牛乳中蛋白质总量的80%以上。
酪蛋白可分为α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白三种，其中α-酪蛋白和β-酪蛋白含量最高，约占酪蛋白总量的90%以上。
提取酪蛋白的方法有多种，常用的包括离心法、薄膜浓缩法和离子交换法等。
以下介绍一种离子交换法提取酪蛋白的方法。
材料和仪器设备：牛乳、0.02mol/L Na2HPO4（pH 8.2）、0.02mol/L NaH2PO4（pH 8.2）、0.5mol/L NaCl、硫酸钠、洗涤液、pH计、离心机、离子交换树脂（如DEAE-Sepharose CL-6B）、紫外分光光度计、SDS-PAGE凝胶电泳装置等。
步骤：1.将鲜牛乳离心去除脂肪，得到鲜乳液。
2.将鲜乳液加入同体积的0.5mol/L NaCl中，用搅拌器搅拌20min，离心分离得到上清液。
3.将上清液通过一根DEAE-Sepharose CL-6B离子交换树脂柱，收集流出液。
树脂柱洗涤至底座pH值稳定，得到初始洗涤液。
4.逐渐将洗涤液pH值升高至8.2，得到目标蛋白（酪蛋白）。
该步骤中DEAE-Sepharose CL-6B离子交换树脂中的团聚物质还可以部分与酪蛋白亲和，因此流出液中含有除酪蛋白外的其他物质，节约了纯化酪蛋白的成本。
5.将流出液进行浓缩处理。
常用的浓缩方法有薄膜浓缩法和淀粉微球浓缩法等。
淀粉微球浓缩法简便易行，且收率较高。
将淀粉往加入称量瓶中，加入适量的紫外吸收物质作为指示剂，加入约5倍的蒸馏水，搅拌至淀粉微球均匀分散，待微球沉淀后取上清液即可。
6.用紫外分光光度计对提取的酪蛋白进行检测，并进行酪蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析。
其中，SDS-PAGE凝胶电泳分析操作步骤较为繁琐，主要包括制备凝胶、电泳、染色、显色等过程。
制备凝胶时，常用的凝胶包括10%、12%和15%三种，根据待测蛋白大小进行选择。
学习指南4-1 牛乳中酪蛋白的制备
牛乳中酪蛋白的制备——学习指南
l学习重点
1. 学习从牛乳中分离酪蛋白的原理和方法。
2. 掌握等电点在蛋白质分离、纯化和鉴定中的应用。
l知识要点
1. 酪蛋白：是乳品中重要的蛋白质组分，占牛乳总蛋白质的80%。
酪蛋白可以促进机体对钙、磷离子的吸收，调节机体免疫功能。
2. 等电点沉淀法：当溶液的pH值为蛋白质等电点时，蛋白质溶解度最低，可用于蛋白质的沉淀制备。
l试剂
1. 0.2mol/L pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。
2. 冰醋酸。
3. 95%乙醇。
4. 无水乙醚。
5. 乙醇-乙醚混合液（95%乙醇、无水乙醚体积比1:1）。
l材料
市售牛乳
l仪器
恒温水浴锅、高速离心机、循环水泵、抽滤装置、电子天平
l
l注意事项
实验的关键是将pH值调至酪蛋白的等电点。
牛奶的乳浊液可能会影响pH试纸的颜色判断，可将溶液调至等电点附近，离心后再检测上清的pH值。
牛奶中酪蛋白的分离与鉴定学习资料
学习资料
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六 结果处理
❖ 方法一 脂肪(％)＝(m6-m5) / m4 ×100
❖ 方法二 脂肪(％)＝(m3-m7) / m4 ×100
m6——接受瓶和脂肪的质量，g； m5——接受瓶的质量，g； m4——样品的质量(如为测定水分
后的 样品质量计)，g。
m3——未抽提滤纸包的质量，g； m7——抽提后滤纸包的质量，g； m4——样品的质量(如为测定水分
学习资料
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五 注意事项
（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的520 min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳 定。
（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比 色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完 后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
（3）一些阳离子如K+、Na+、Mg2+、乙醇等物质对 测定无影响，而大量的去污剂如SDS等会严重干扰 测定。
❖ 酪蛋白在其等电点时由于静电和为零，同种电荷间的 排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳 调到pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。酪蛋白 不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制剂中将脂 类杂志除去。
学习资料
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三 仪器、原料和试剂
❖ 仪器：温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、水浴锅、 烧杯、 量筒、表面皿、天平、离心机等
学习资料
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3 称重
❖ 取下接受瓶，回收乙醚，待接受瓶内乙醚剩 1 ～2 ml 时，在水浴上蒸干，再于100～ 105℃干燥 2小时，取出放干燥器内冷却30分 钟，称重，并重复操作至恒重（m6）。
❖ 取出滤纸包，于户外晾至无乙醚味，置入恒 温箱内，烘干，然后移入干燥缸内冷却后称 重，重复操作至恒重（m7）。
实验三 牛乳中酪蛋白的制备与鉴定
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四、实验步骤
1、酪蛋白的制备： （1）量取10mL牛奶置于25mL刻度试管中，水浴中加 热至40℃。在搅拌下慢慢加入10mL预热至40℃的乙酸-乙 酸钠缓冲液（pH4.6）。用精密试纸调pH值至4.8（可选择 1%氢氧化钠或10%乙酸溶液进行调整）。40℃保温10min， 使沉淀完全。 （ 2）将上述悬浮液冷却至室温。 2000r/min离心 5min ，
弃去上清液。
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四、实验步骤
1、酪蛋白的制备： （ 3 ）往沉淀物中加入 5mL 蒸馏水，混匀后 2000r/min 离心5min， 弃去上清液。 （ 4 ） 将 洗 净 的 沉 淀 物 加 入 3mL 无 水 乙 醇 ， 混 匀 后
2000r/min离心5min， 弃去上清液，得酪蛋白粗制品。
（ 5 ）将沉淀物全部摊开在已称过重的滤纸上，置于 25℃烘箱中烘干。
实验三 牛乳中酪蛋白的制备与鉴定
温馨提示：请将教室水浴锅打开，温度调至
40℃。并将乙酸-乙酸钠缓冲液（1瓶/室）放入水
浴锅内，预热至40℃。
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一、实验目的
（1）学习从牛乳中制备酪蛋白的方法。 （2）了解从牛奶中制取酪蛋白的原理。 （3）验证蛋白质的双缩脲反应性质。 （4）学习和掌握蛋白质双缩脲反应的原理和方法。
并放出一分子氮，双缩脲在碱性环境中能与 Cu2+
结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
二、实验原理
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，
也能发生此反应，因此该反应可用于蛋白质的定
性或定量测定。
N 端 C 端
三、仪器和试剂
1、仪器： 恒温水浴锅、低速离心机、电子天平、酒精灯等。
2、试剂：
乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.6）、1%氢氧化钠、 10%乙酸、蒸馏水、无水乙醇、10%氯化钠、0.5%碳 酸钠、0.1mol/L氢氧化钠、0.2%盐酸、饱和氢氧化钙、 尿素、10%氢氧化钠、1%硫酸铜。
牛奶中酪蛋白和乳糖分离及检测方法讲义PPT课件(12张)
⒋ 乳糖的测定
• 糖脎 • 取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试
管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂①，摇匀， 试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振 摇，加热10～15分钟后，取出放置冷却，乳糖脎 成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结 晶形态，可证实为乳糖。 ①苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触 及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。
•
7.施工中确因作业需要拆除各类防护 设施的 ，应由 作业班 组向项 目副经 理提出 申报， 经采取 有效的 安全补 救措施 后方能 拆除； 作业完 毕后， 项目副 经理应 督促有 关人员 及时做 好复原 工作， 经重新 验收后 方可使 用。
•
8.当土建结构施工完成后转入装饰或 安装施 工时， 必须对 临边、 洞口、 管弄井 和电梯 井等安 全防护 设施重 新进行 验收， 确认合 格后， 方能投 入使用 。如装 饰或安 装作业 交付其 它施工 单位时 ，双方 应履行 交接手 续，做 到职责 明确。
⒉ 牛奶中乳糖的分离
• ①将1. ①中加入碳酸钙的滤液置于蒸发皿 中，用蒸气浴浓缩至约15mL，稍冷后，在 溶液中加入约90mL95%乙醇，再加热，使 其混合均匀，趁热过滤，滤液不是特别澄 清。将滤液移至锥形瓶中，加塞，放置1-2 天，让乳糖充分结晶，过滤分离出乳糖晶 体。用冷的95%乙醇洗涤结晶，干燥后称 重。
4.对安全部门或上级提出的事故隐患 整改要 求，按 照纠正 和预防 措施要 求，落 实人员 实施整 改；
•
5.负责对重点、危险部位和过程的监 控，落 实监控 人员， 组织对 监控人 员素质 和技能 的培训 及上岗 前的交 底；
•
6.对已发生的事故隐患落实整改，并 向项目 副经理 反馈整 改情况 。发生 工伤事 故，应 立即采 取措施 ，协同 安全部 门开展 事故的 应急救 援，并 保护现 场，迅 速报告 。
牛奶中酪蛋白含量的测定
牛奶中酪蛋白的提取及含量测定一、实验原理1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%）、脂类（4%）、蛋白质（3.5%）、维生素、微量元素（Ca、P等矿物质）、水（87%）牛奶中的糖主要是乳糖。
乳糖是一种二糖，它由D-半乳糖分子和D-葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成。
乳糖溶于水，不溶于乙醇，当乙醇混入乳糖水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。
牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和乳清蛋白两种，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。
酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。
而乳清蛋白水合能力强，分散性强，在牛乳中呈高分子状态。
2、等电点沉淀法：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。
酪蛋白的等电点为4.7左右（不同结构的酪蛋白等电点有所不同），本实验中将牛乳的pH调值4.7时，酪蛋白就沉淀出来。
市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂来增加粘稠度，以致即使pH调至等电点酪蛋白也沉淀的很少，故实验时可将pH稍微调过多一点再调回等电点。
同时，市售牛奶由于生产过程通常导致酪蛋白组分发生变化，因而使pI偏离了4.7，通常偏酸。
3、酪蛋白的提纯根据乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性质差异，可以用纯水洗涤来除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的杂质，再用乙醇除去脂类，然后过渡到用乙醚洗涤，由于乙醚很快挥发，最终得到纯粹的酪蛋白结晶。
4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝结合法）考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G520的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰变为595nm。
在一定范围内，考马斯亮蓝G520-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以测定蛋白质浓度。
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牛奶中酪蛋白的提取与分析实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析实验材料：牛奶小组成员：实验时间：一：实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析二：报告撰写者三、小组成员实验仪器温度计、布氏漏斗（*）、pH试纸（*）、抽滤瓶（*）水浴锅、烧杯、量筒、表面皿（*）、电子天平（*）、2个1000ml的容量瓶（*）、2张醋酸纤维薄膜（2cm×8cm 厚度120nm）成品（*）、培养皿9—10cm（*）、毛细管（*）、尺子、铅笔、单面刀片（*）、镊子、普通滤纸（*）、电泳槽、玻璃板8cm×12cm（*）、752型分光光度计（*）、细布（*）0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml 的移液管、试管、试管架、四、实验材料牛奶（蒙牛特仑苏和伊利金典）五、实验试剂特仑苏400ml、金典200ml、1.66g巴比妥（*）、12.76g巴比妥钠（*）、0.5g 氨基黑10B（*）、50ml甲醇AR（*）、100ml冰醋酸AR（*）、95%的乙醇250ml（*)、95%的乙醚100ml（*）、0.2mol/L的乙酸100ml（*）、0.2mol/L 的乙酸钠100ml（*）、25g氢氧化钠固体（*）标准酪蛋白、15mg五水硫酸铜（*）、60mg酒石酸钾钠（*）所需试剂配制方法：乙醇乙醚混合液的配制：10ml95%的乙醇10ml95%的乙醚配制乙醇乙醚1:1的混合乙醇钠缓冲液的配制： 0.2mol/L 的乙酸51ml 0.2mol/L 的乙酸钠49ml巴比妥钠缓冲液的配制： 巴比妥1.66g 巴比妥钠12.76g 染色液的配制： 0.5g 氨基黑10B50ml 甲醇AR 10ml 冰醋酸AR漂洗液的配制： 45ml95%乙醇AR 5ml 冰醋酸AR蒸馏水透明液的配制： 25ml 的冰醋酸AR 75ml 的无水乙醇AR0.05mol/L 氢氧化钠溶液的配制： 16g 的氢氧化钠固体定容至1000ml 10%氢氧化钠溶液的配制： 5g 的氢氧化钠固体定容至50ml双缩脲试剂的配制：配制巴比妥钠缓冲液+40ml蒸馏水，混匀既得染配制pH4.6的乙酸钠缓冲液混匀得染色液混匀得透明液溶于5ml 蒸馏水，在搅拌情况下，15mg五水硫酸铜60mg酒石酸钾钠标准酪蛋白溶液A的配制（10mg/ml）：用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制10ml从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液1、2的配制（2-9mg/ml）：用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制10ml标准酪蛋白溶液B的配制（1500μg/ml）：用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液3、4的配制（50-1500μg /ml）：用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制七、实验目的1.掌握从牛奶中提取酪蛋白的方法2.了解蛋白质分离纯化的基本办法3.学习电泳的基本原理及掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离酪蛋白的具体操作4.掌握双缩脲法和紫外吸收法测定蛋白质含量的原理及操作方法并比较两种方法5.熟悉分光光度计的原理和操作6.比较特仑苏与金典中的酪蛋白含量八、实验原理酪蛋白在其等电点时静电荷为零，同种电荷的相互排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调节到PH4.6，酪蛋白就可以从牛乳中分离出来。
酪蛋白不溶解于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白中除去脂类杂质。
酪蛋白并不是单一的一种蛋白质，而是多种性质类似的蛋白质的统称。
其一般由αs—，β—，γ—，κ—4种类型组成。
它们各自的等电点（pI）具有一定的差异，本实验将酪蛋白溶液点样于用pH8.6(高于酪蛋白各型等电点)缓冲液浸泡过的醋酸纤维膜上，并在该缓冲液体系中进行电泳，使酪蛋白分子上带上不同量的负电荷，在电泳过程中酪蛋白分子由负极向正极移动，同时酪蛋白各类型分子的相对分子量也不同，因此在电泳过程中其迁移率也不同，从而把酪蛋白的各种类型分离开来。
酪蛋白各组分的含量、等电点及大小双缩脲在碱性溶液中能与二价铜离子产生紫红色络合物，该反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中因含有两个以上的肽键，因此也能发生双缩脲反应。
蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子产生紫红色络合物，其颜色的深浅在一定范围内与蛋白质的含量称正比，与蛋白质的氨基酸组成及相对分子质量无关。
故可用双缩脲反应来测定蛋白质的含量，测定范围为0.5-10mg/ml蛋白质。
由于蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等残基中具有共轭双键，使得蛋白质在280nm处具有最大吸收值，且其光吸收值与浓度在一定范围内成正比，因此，该法可用作蛋白质定量测定。
该法测定蛋白质含量时具有简单、灵敏、快速、不消耗样品、不受低浓度盐干扰等优点，但该法准确度较差，特别是如果样品中含有嘧啶、嘌呤等吸收紫外光的物质时，会出现较大的干扰，这时，就需要通过紫外吸收差来求蛋白质浓度，但也存在着一定的误差。
九、实验步骤（一）酪蛋白的提取1、酪蛋白的等电点沉淀做六组平行试验，每组分别：将100ml的牛奶放到500ml的烧杯中，加入40度左右的乙酸钠缓冲液，直到pH达4.6左右，用pH试纸调试。
将上述悬浊液冷却至室温，然后放置5min，用细布过滤，收集沉淀。
2、除去脂类杂质将上述沉淀用少量水洗数次，然后悬浮于30ml95%的乙醇中。
将此悬浮液倾入布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再倒入乙醇—乙醚混合液总洗涤沉淀两次，最后再乙醚洗涤沉淀两次，抽干。
将沉淀从布氏漏斗中移去。
在表面皿上摊开以除去乙醚，干燥后得到的即为酪蛋白。
准确称重。
（二）酪蛋白的分离与分析3、醋酸纤维薄膜的准备（2张）将醋酸纤维薄膜缓缓进入盛有巴比妥钠缓冲液的器皿中，全部润湿10-30min，至膜上无白点存在。
4、样品处理分别取出从特仑苏和金典中制备的酪蛋白0.1g，加5ml0.05mol/L的NAOH溶解，备用。
5、仪器和薄膜的准备电泳装置的准备：用四层干净的滤纸作滤纸桥，将其用缓冲液润湿，铺垫在电泳槽支架上，电泳槽内加入巴比妥钠缓冲液至刻度线处，并使两槽中的缓冲液保持在同一液面。
注意滤纸桥的底边必须进入缓冲液中，并将电极仪连接好。
用镊子将浸泡好的醋酸纤维薄膜从缓冲液轻轻取出，注意用镊子夹在薄膜的一边角处，将无光泽面朝上，平放在干净滤纸上，其上再放一层滤纸，用手轻压，以吸取薄膜上多余的缓冲液。
6、点样取出湿润的醋酸纤维素薄膜，夹在两层滤纸间吸取多余的缓冲液，无光泽面向上，在距离薄膜一端1.5cm处，用铅笔轻轻画一直线。
用玻璃棒粘取酪蛋白样品液，涂于盖玻片边缘处，将盖玻片截面与薄膜无光泽面（涂有醋酸纤维素）画线处垂直接触，轻轻3-5s，是样品渗入膜内，然后轻轻提起盖玻片，点样完毕。
7、放膜揭开电泳槽盖子，把薄膜两端平贴在滤纸桥上，放膜时需特别注意：点样面朝上（与滤纸直接接触形成电流闭合环路），点样端放于电泳槽负极端（酪蛋白已带上负电荷，电泳时从负极向正极移动）。
把膜放好拉直后立即盖上电泳槽盖子，以防膜边干。
8、电泳打开电泳仪电泳开关，调节电压至90-110V，电流0.4-0.6mA/cm，电泳时间45-60min。
在电泳过程中，应该注意控制电压和电流强度，以防过高或者过低，并保持电泳的连续性。
9、染色与漂洗脱色电泳关闭后，关闭电源，用镊子立即取出薄膜，直接浸泡在染色液中染色3-5min，取出后用漂洗液漂洗数次，每次约10min，直至背景蓝色脱尽。
然后用蒸馏水清洗一下，用滤纸吸去膜上多余的水分，用电吹风的冷风将薄膜吹干。
10、透明将吹干后的薄膜进入透明液中15s左右，立即用镊子取出，平放在干净的玻璃板上，轻轻赶去气泡，铺平膜，用电吹风冷风将膜吹干，即得到一张透明的电泳区带图谱。
11、定量将漂洗干净的薄膜用滤纸吸干后剪下各蛋白质区带，分别浸泡于盛有4ml0.4mol/L的NAOH溶液中，37度保温5-10min，待色泽全部被浸出后，将溶液在590nm波长下比色。
分部测出各蛋白质部分的吸光度，和它们的总吸光度。
（三）牛奶中酪蛋白含量的测定——双缩脲法12、标准曲线的制作取21支干燥干净试管编号（每个编号3支平行试管），按下表加入各试剂将各试管混匀后，在室温下放置30min，每次均以1号试管调零测定各管在540nm波长下的吸光度。
取3组测定的平均值，以吸光度为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制蛋白质标准曲线，并计算二次线性回归方程。
13、样品测定及分析——特仑苏取三支试管，分别吸取1.0ml酪蛋白样品液1，然后加入4.0ml双缩脲试剂，室温下放置30min。
以1号试管调零测定540nm波长下样品液的吸光度。
对照标准曲线或代入二次线性回归方程求出样品液中蛋白质的含量。
14、样品测定及分析——金典取三支试管，分别吸取1.0ml酪蛋白样品液2，然后加入4.0ml双缩脲试剂，室温下放置30min。
以1号试管调零测定540nm波长下样品液的吸光度。
对照标准曲线或代入二次线性回归方程求出样品液中蛋白质的含量。
（四）牛奶中酪蛋白含量的测定——紫外吸收法15、标准曲线的制作将标准酪蛋白溶液B用0.05mol/L氢氧化钠溶液分别配制成一系列浓度的标准酪蛋白溶液：50,100,200,400,600,800,1000,1500μg/ml。
以0.05mol/L氢氧化钠溶液作为对照调零，选用光程1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定上述各标准溶液的光吸收值，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘出蛋白质标准曲线，并计算二次线性回归方程。
16、样品测定及分析——特仑苏取一定的酪蛋白样品液3，以0.05mol/L氢氧化钠溶液作为对照调零，选用光程1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定酪蛋白样品液的光吸收值，对照标准曲线或代入二次线性回归方程，然后求出样品液中蛋白质的含量。
17、样品测定及分析——金典取一定的酪蛋白样品液4，以0.05mol/L氢氧化钠溶液作为对照调零，选用光程1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定酪蛋白样品液的光吸收值，对照标准曲线或代入二次线性回归方程，然后求出样品液中蛋白质的含量。
十、实验预期结果1、提取的酪蛋白为白色粉末状，中夹杂黄色块状物体。
其产率的计算公式为=测得含量/理论含量*100% （理论含量特仑苏为3.3g/100g，金典为3.5g/100g）2、电泳后得到的图谱应该为四条条带:αs—，β—，γ—，κ—4种类型.3、αs—酪蛋白、β—酪蛋白、γ—酪蛋白、κ—酪蛋白的理论含量（%）分别为：45-55、25-35、8-15、3-7.十一、参考文献现代生物化学实验技术蒋立科杨婉身中国农业出版社 2003.8版生物化学实践设计与实践蒋立科罗曼高等教育出版社 2007.10 版生物化学实验黄建华袁道强陈世锋化学工业出版社 2009.3 版。