牛奶中酪蛋白的提取与分析培训讲学

牛奶中酪蛋白的提取

与分析

实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析实验材料：牛奶

小组成员：

实验时间：

一：实验题目：牛奶中酪蛋白的提取与分析

二：报告撰写者

三、小组成员

实验仪器

温度计、布氏漏斗（*）、pH试纸（*）、抽滤瓶（*）水浴锅、烧杯、量筒、表面皿（*）、电子天平（*）、2个1000ml的容量瓶（*）、2张醋酸纤维薄膜（2cm×8cm 厚度120nm）成品（*）、培养皿9—10cm（*）、毛细管（*）、尺子、铅笔、单面刀片（*）、镊子、普通滤纸（*）、电泳槽、玻璃板8cm×12cm（*）、752型分光光度计（*）、细布（*）0.5ml、1.0ml、2.0ml、5.0ml 的移液管、试管、试管架、

四、实验材料

牛奶（蒙牛特仑苏和伊利金典）

五、实验试剂

特仑苏400ml、金典200ml、1.66g巴比妥（*）、12.76g巴比妥钠（*）、0.5g 氨基黑10B（*）、50ml甲醇AR（*）、100ml冰醋酸AR（*）、95%的乙醇250ml（*)、95%的乙醚100ml（*）、0.2mol/L的乙酸100ml（*）、0.2mol/L 的乙酸钠100ml（*）、25g氢氧化钠固体（*）标准酪蛋白、15mg五水硫酸铜（*）、60mg酒石酸钾钠（*）

所需试剂配制方法：

乙醇乙醚混合液的配制：

10ml95%的乙醇10ml95%的乙醚

配制乙醇乙醚1:1的混合

乙醇钠缓冲液的配制： 0.2mol/L 的乙酸51ml 0.2mol/L 的乙酸钠49ml

巴比妥钠缓冲液的配制： 巴比妥1.66g 巴比妥钠12.76g 染色液的配制： 0.5g 氨基黑10B

50ml 甲醇AR 10ml 冰醋酸AR

漂洗液的配制： 45ml95%乙醇AR 5ml 冰醋酸AR

蒸馏水

透明液的配制： 25ml 的冰醋酸AR 75ml 的无水乙醇AR

0.05mol/L 氢氧化钠溶液的配制： 16g 的氢氧化钠固体定容至1000ml 10%氢氧化钠溶液的配制： 5g 的氢氧化钠固体定容至50ml

双缩脲试剂的配制：

配制巴比妥钠缓冲液

+40ml

蒸馏水，混匀既得染

配制pH4.6的乙酸钠缓冲液

混匀得染色液

混匀得透明液

溶于5ml 蒸馏水，在搅拌情况下，

15mg五水硫酸铜

60mg酒石酸钾钠

标准酪蛋白溶液A的配制（10mg/ml）：

用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制10ml

从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液1、2的配制（2-9mg/ml）：

用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制10ml

标准酪蛋白溶液B的配制（1500μg/ml）：

用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制

从特仑苏和金典中提取的酪蛋白样品液3、4的配制（50-1500μg /ml）：

用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制

七、实验目的

1.掌握从牛奶中提取酪蛋白的方法

2.了解蛋白质分离纯化的基本办法

3.学习电泳的基本原理及掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离酪蛋白的具体操作

4.掌握双缩脲法和紫外吸收法测定蛋白质含量的原理及操作方法并比较两

种方法

5.熟悉分光光度计的原理和操作

6.比较特仑苏与金典中的酪蛋白含量

八、实验原理

酪蛋白在其等电点时静电荷为零，同种电荷的相互排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调节到PH4.6，酪蛋白就可以从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶解于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白中除去脂类杂质。

酪蛋白并不是单一的一种蛋白质，而是多种性质类似的蛋白质的统称。其一般由αs—，β—，γ—，κ—4种类型组成。它们各自的等电点（pI）具有一定的差异，本实验将酪蛋白溶液点样于用pH8.6(高于酪蛋白各型等电点)缓冲液浸泡过的醋酸纤维膜上，并在该缓冲液体系中进行电泳，使酪蛋白分子上带上不同量的负电荷，在电泳过程中酪蛋白分子由负极向正极移动，同时酪蛋白各类型分子的相对分子量也不同，因此在电泳过程中其迁移率也不同，从而把酪蛋白的各种类型分离开来。

酪蛋白各组分的含量、等电点及大小

双缩脲在碱性溶液中能与二价铜离子产生紫红色络合物，该反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中因含有两个以上的肽键，因此也能发生双缩脲反应。蛋白质在碱性溶液中与二价铜离子产生紫红色络合物，其颜色的深浅在一定范围内与蛋白质的含量称正比，与蛋白质的氨基酸组成及相对分子质量无关。故可用双缩脲反应来测定蛋白质的含量，测定范围为0.5-10mg/ml蛋白质。

由于蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等残基中具有共轭双键，使得蛋白质在280nm处具有最大吸收值，且其光吸收值与浓度在一定范围内成正比，因此，该法可用作蛋白质定量测定。该法测定蛋白质含量时具有简单、灵敏、快速、不消耗样品、不受低浓度盐干扰等优点，但该法准确度较差，特别是如果样品中含有嘧啶、嘌呤等吸收紫外光的物质时，会出现较大的干扰，这时，就需要通过紫外吸收差来求蛋白质浓度，但也存在着一定的误差。

九、实验步骤

（一）酪蛋白的提取

1、酪蛋白的等电点沉淀

做六组平行试验，每组分别：将100ml的牛奶放到500ml的烧杯中，

加入40度左右的乙酸钠缓冲液，直到pH达4.6左右，用pH试纸调

试。将上述悬浊液冷却至室温，然后放置5min，用细布过滤，收集

沉淀。

2、除去脂类杂质

将上述沉淀用少量水洗数次，然后悬浮于30ml95%的乙醇中。将此

悬浮液倾入布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再倒入乙醇—乙醚混合

液总洗涤沉淀两次，最后再乙醚洗涤沉淀两次，抽干。将沉淀从布氏

漏斗中移去。在表面皿上摊开以除去乙醚，干燥后得到的即为酪蛋

白。准确称重。

（二）酪蛋白的分离与分析

3、醋酸纤维薄膜的准备（2张）

将醋酸纤维薄膜缓缓进入盛有巴比妥钠缓冲液的器皿中，全部润湿

10-30min，至膜上无白点存在。

4、样品处理

分别取出从特仑苏和金典中制备的酪蛋白0.1g，加5ml0.05mol/L的

NAOH溶解，备用。

5、仪器和薄膜的准备