在Transwell小室中分离培养人脐静脉内皮细胞的研究-论文

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人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定

本课题为安徽省自然科学基金安科医药专项资助项目(01043708)作者单位:230001 合肥安徽省立医院普外科安徽医科大学2001级硕士研究生(傅斌生)人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定余继海许戈良汪建荚卫东傅斌生[摘要] 目的探讨新生儿脐静脉内皮细胞的培养及鉴定方法,建立血管内皮细胞培养模型,为体外研究血管内皮细胞提供实验手段。

方法采用胶原酶灌流消化法培养人脐静脉内皮细胞,当原代培养细胞80%以上汇合后,用胰蛋白酶消化传代;根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术(F M 术)免疫荧光检查对细胞进行鉴定。

结果种植在培养瓶中的内皮细胞12小时贴壁生长,48~72小时生长最快,7~10天汇合。

内皮细胞呈接触抑制生长、呈鹅卵石样外观,FM 术检测CD31和V -R-Ag 均为阳性表达。

结论消化酶灌注脐静脉消化内皮细胞是获取血管内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。

[关键词] 内皮细胞;培养C ulture and identif ication of human endothelial cells derived f rom umbilical veins Y u Jihai ,Xu Geliang,W ang J ian,et al A nhui Prouincial H osp ital,H ef ei 230001[Abstract] Objective T o extablish the methods of culturing human endothelial cells (EC)and identifing the cells ac cording to t he antigens expressed and their morpholog ical aspect.Methods A fter digestion w ith t ype collagenase at 37!for 10minutes,the cells were centrifuged,and the cell pellet was resuspended in DEM E medium containing fetal bovine serum (10%vol/vol),seeded on gelatin(0.1%w t/vol)procoated dishes at aconcentr at ion of 10,000per square centimeter.T he medium was changed 1days later when the cells w er e attached and every 2days,until the cells reached confluence.Phase con trast microscopy and flow cy tometry with specific antisera against von willebrand factor and CD31were used to obser ve and i dentify the culturedcells.Results At confuluence (7~9days),the cultured cells had a cobbestone appear ance wit h a strict monolayer grow th and contact inhibition.T he mean fluorescence intensity of the cells was similar w ith both antibodies for the cultured cells vs controls.C onclusion T he cultured cells are endothelial cells,and the method of identification is practical and convenient.[Key words] Endot helial cells;Culture我们采用胶原酶灌流消化法成功培养人脐静脉内皮细胞,根据细胞生长特点、形态特征、细胞表型和分泌蛋白流式细胞术免疫荧光检查对细胞进行鉴定,从而构建体外研究血管内皮细胞的模型,现报告如下。

人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养

人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养张臣;李彤;侯跃龙;严晓晔;高英堂【摘要】目的:建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、鉴定的高效方法.方法:胰酶消化法从脐静脉获得HUVEC,观察其形态并传代培养,检测其摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AcLDL)的情况,传3代流式榆测内皮细胞特异性表达.结果:消化分离的细胞呈小圆形且聚集成团;2h细胞开始贴壁,呈条索状;7d细胞增多呈漩涡样生长;此后细胞继续增多接近融合,呈铺路石样改变.流式检测细胞高表达血管内皮细胞特异性标志CD144、vWF、CD31,部分表达CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达.镜下发现贴壁细胞原代、第5代摄取Dil-AcLDL,胞浆呈现红色荧光,提示为有活性的内皮细胞.结论:利用胰酶消化法能从人脐静脉获得大量内皮细胞,体外培养后能成功增殖传代.【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2010(038)007【总页数】3页(P605-607)【关键词】内皮细胞;脐静脉;细胞培养技术;细胞分离;连续传代【作者】张臣;李彤;侯跃龙;严晓晔;高英堂【作者单位】300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室;300170,天津市第三中心医院,天津市人工细胞重点实验室【正文语种】中文人的内皮细胞是血管壁的主要组成部分，在维持组织稳态、纤溶与凝血、血液组织交换、血管舒缩调节、血管新生、血细胞激活和迁移等生理和病理过程中发挥着重要作用，另外在免疫反应起始过程中也起着决定性的作用[1]。

因此体外获得血管内皮细胞可为阐明许多疾病血管并发症的病理过程提供重要研究模型[2]。

新生儿脐带由于取材经济、来源充足,而成为血管内皮细胞体外获得的主要材料。

人脐静脉内皮细胞体外培养及其相关研究

自然发生的调节性t细胞naturalregulatorycellntregcd4在维持自身耐受方面发挥了重要作用reg在细胞活化阶段以抗原非特异性形式通过下调对自身或非自身抗原免疫反应来维持自身耐受其介导的外周耐受机制异常可能是各种自身免疫性疾病和哮喘等变态反应性疾病发生的重要原因
医学综述 2010 年 2月第 16 卷第 3期 M edical R ecapitu late , Feb 2010 , V o. l 16, N o . 3 287 294. M ik i T, S trom SC. Am n ion derived p lu ripotent /mu lt ipotent stem cells[ J]. S tem C ell R ev, 2006 , 2 ( 2) : 133 142 . Tam agaw a T, Ish iwata I , Saito S. E stab lishm ent and characterization of a p luripoten t stem cell lin e derived from hum an am n iotic m em b ranes and in itiat ion of ger m layers in vitro[ J] . Hum Cel, l 2004 , 17( 3) : 125 130. Saku ragaw a N, Thangavel R, M izugu chi M , et al. Exp ression of m arkers for both n euron al and glial cells in hum an amn iot ic ep ith e lial cells[ J] . N eu rosci Let t , 1996 , 209 ( 1) : 9 12 . Saku ragaw a N, M isaw aH, O h sug iK, e t al. Ev idence for act ive ace ty lchol ine m etabol ism in hum an am n iot ic ep ithelial cells : A ppl ica b le to intracereb ral allograft ing for neuro log ic d isease[ J] . N eu rosci Lett , 1997 , 232 ( 1) : 53 56 . El w an M A, Saku ragaw a N. Ev idence for synthes is and release of catecholam in es by hum an amn iot ic ep ithelial cells [ J ] . N eurore port , 1997 , 8( 16) : 3435 3438 . El w an M A, Thangavel R, O no F, et al. Syn thesis and release of catecholam in es by cu ltu red monk ey am n iotic epithelial cells[ J] . J N eurosci R es , 1998 , 53( 1 ) : 107 113 . K ak ish ita K, E l w an M A, N akao N, et a l . Hu m an amn iotic epithelial cells produce dopam ine and survive after m i p lan tation in to the striatum of a rat model of Park inson s disease : A potent ial source of donor for tran sp lantation th erapy[ J] . Exp N eu ro, l 2000 , 165 ( 1) : 27 34 . K ak ish ita K, N akao N, S akuragaw a N, e t al. I m p lan tat ion of human amn iot ic ep ithelial cell p reven ts the degeneration of n igral dopa m ine neu rons in rats w ith 6 hyd roxydopam ine les ion s [ J] . B rain R es , 2003, 980( 1) : 48 56. Saku ragaw a N, Enosaw a S, Ish ii T, et al. H um an amn iot ic ep ith elial cells are p rom is ing t ransgen e carriers for allogen eic cell tran sp lan tat ion in to l iver[ J] . J H um G enet , 2000 , 45( 3 ): 171 176 . Takash i ma S , IseH, Zh ao P, et al. H um an am n iotic ep ith elial cells possess hep atocyte like characteristics and functions [ J ] . C ell S truct Fun ct , 2004, 29( 3) : 73 84. D avila JC, C ezar G G, Th ied eM, e t a l . U se and app lication of stem cells in tox icology[ J] . Toxicol Sc, i 2004 , 79( 2 ): 214 223 . W ei JP, Zhang TS , K aw a S, et a l . Hum an amn ion isolated cells nor m alize b lood glucose in s treptozotocin indu ced d iabetic m ice [ J] . Cel l Transplant , 2003 , 12 ( 5) : 545 552 . Port m ann Lanz CB , Schoeberlein A, H uber A, et a l . P lacen tal m es enchym al s tem cells as potent ial au tologous graft for pre and per i natal neu roregeneration[ J] . Am J O bstet G yneco, l 2006 , 194( 3) : 664 673. [ 21]

在Transwell小室中分离培养人脐静脉内皮细胞的研究

在Transwell小室中分离培养人脐静脉内皮细胞的研究张又枝;黄琦;任平【摘要】目的建立一种在特殊材料Transwell培养小室中分离培养原代人脐静脉内皮细胞的技术.方法采用酶消化法分离得到人脐静脉内皮细胞(HUVEC),免疫荧光法检测内皮因子Ⅷ予以鉴定,待长满后用不含EDTA的0.25％胰酶传代到Transwell小室中,观察小室中HUVEC的生长情况.结果在脐带长度一定的情况下,HUVEC分离所得到细胞的多少以及细胞的状态与胰酶的用量、时间、温度及是否含EDTA关系密切.本研究胰酶消化时间在室温(25℃左右)情况下要消化30min,用的胰酶是含EDTA和不含EDTA的胰酶1∶1混合;长满之后传代消化的胰酶只能用不含EDTA的胰酶消化,时间以在镜下的细胞状态为准.结论在特殊材料Transwell小室中成功分离培养HUVEC,一定要在比较温和的条件下消化HUVEC,这样才可能得到活力比较好、数量比较多的细胞.【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2015(029)002【总页数】3页(P96-97,103)【关键词】人脐静脉内皮细胞;Transwell小室;胰酶【作者】张又枝;黄琦;任平【作者单位】湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院糖尿病及心脑血管病变湖北省重点实验室;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100;湖北科技学院药学院,湖北咸宁437100【正文语种】中文【中图分类】R329.3人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在医药学的基础研究中应用广泛，主要是其比较易得到，而且又具有内皮细胞的特征，对疾病的发病机制的研究极为重要。

但是该细胞比较脆弱，极易损伤，在研究中不易得到活力比较好的细胞。

Transwell 小室是一种嵌入细胞培养板，其小室底部含有聚碳酸酯膜的材料，亦称为PET 膜，该膜根据孔径不同将其分为不同种的小室，但是共有的特点是其具有通透性，使小室内外培养液的成分相互影响，从而影响细胞的生长、运动等。

人脐静脉内皮细胞的分离培养及鉴定

综上所述，本研究的人脐静脉内皮细胞分离、培养、鉴定的方法简捷易行，成功率较高，能获得大量内皮细胞，能很好地满足实验研究的需要。【参考文献】［１］ Mallika V,Goswami B,Rajappa M.Atherosclerosis patho-
physiology and the role of novel risk factors:a
静脉通道，遇到病情变化可随时用药，为抢救患者生命
2 方法
赢得了宝贵的时间。
2.1 材料选用套管针采用洁瑞公司生产的封闭式套 3.3 套管针的穿刺部位均为静脉远端，近邻无重要脏
管针，型号为２０Ｇ或２２Ｇ；敷料采用３Ｌ公司９ｃｍ×６ｃｍ的无器组织，从而避免了深静脉穿刺的并发症。
菌透明敷贴。
4 使用套管针的注意事项
静脉套管针作为一项新的护理技术已广泛应用于套管，放松止血带，拔出针芯，用无菌透明敷贴固定套管
临床，特别在急危患者的抢救中更为重要，它保持了静针，调节输液速度。
脉管道的持续畅通。在ＣＣＵ的工作中常常遇到以下情 3 使用套管针的优越性
况：急性心肌梗死的患者由于剧烈的胸痛和恶心呕吐导 3.1 套管针针体长，外套管柔软远端圆滑而整齐，留
1 临床资料
体外渗的发生，对急性心肌梗死的患者静脉具有保护作
我院自２００８．１－２００９．４应用静脉套管针技术抢救急用，套管针可以留置５－７ｄ［２］。对于需要反复多次静脉输液
性心肌梗死患者１００例，其中男６８例，女３２例；年龄２９－８６及随时需要输液的患者，套管针的留置等于一条开放的
岁，平均６７．４岁。
·６０·
承德医学院学报ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＣＨＥＮＧＤＥＭＥＤＩＣＡＬＣＯＬＬＥＧＥ

人脐静脉内皮细胞的分离及原代培养体会

人脐静脉内皮细胞的分离及原代培养体会杜利君;蒋兴亮【摘要】目的:建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的人脐静脉内皮细胞的分离、培养方法.方法:采用0.1％ IV型胶原酶灌注消化分离人脐静脉内皮细胞,将其置于含有20％胎牛血清、内皮细胞生长因子及肝素的M199培养基内培养,倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,免疫荧光方法鉴定内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原.结果:细胞呈梭形或椭圆形生长,单层铺路石状排列或呈漩涡状排列.免疫荧光检测结果显示细胞的胞浆内有大量绿色荧光颗粒,Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应.结论:实验建立的人脐静脉内皮细胞分离和培养方法简单、可靠,且能获得足够数量和高纯度的血管内皮细胞,为进一步研究人体大血管内皮细胞的功能奠定了较好的基础.【期刊名称】《川北医学院学报》【年(卷),期】2013(028)001【总页数】4页(P48-51)【关键词】内皮细胞;脐静脉;细胞培养【作者】杜利君;蒋兴亮【作者单位】川北医学院附属医院,四川南充637000【正文语种】中文【中图分类】R329.2体外建立人血管内皮细胞模型是研究人体大血管内皮功能的主要手段之一。

由于内皮细胞株ECV304在形态学、基因学等生物特性上与内皮细胞比较存在明显差异［1］，因此，体外分离和原代培养人脐静脉血管内皮细胞(human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs)已成为国内外学者获取内皮细胞的重要途径。

本实验在借鉴其他学者体外分离、培养HUVECs技术的基础上，通过大量的实验并对此加以改良，旨在建立一种操作简便、且能够获得数量较多及活力良好的HUVECs的分离、培养方法，为进一步研究血管内皮细胞的功能及阐明相关疾病的生理和病理机制奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料M199培养液和胎牛血清分别为Invitrogen公司和Hyclone公司产品，IV型胶原酶、内皮细胞生长因子(ECGS)、肝素钠均为Sigma公司产品，胰蛋白酶为Amresco公司产品，PBS、兔抗人Ⅷ因子抗体及FITC标记的羊抗兔IgG抗体为北京中杉金桥公司产品，青霉素和链霉素为华北制药股份有限公司产品。

人脐静脉血内皮克隆形成细胞的分离培养与鉴定

人脐静脉血内皮克隆形成细胞的分离培养与鉴定周丽;常青;李自成【期刊名称】《中国医学工程》【年(卷),期】2013(021)005【摘要】目的体外建立一种简便的人脐静脉血内皮克隆形成细胞(ECFCs)分离培养方法,并对其进行鉴定.方法无菌条件下收集脐静脉血,以密度梯度离心法分离脐血单个核细胞(MNCs),诱导分化为ECFCs,倒置显微镜下观察其原代及传代培养细胞生长状况并通过流式细胞仪、免疫细胞化学、荧光双染色对ECFCs进行鉴定.结果 ECFCs培养过程可出现边界清楚的类圆形单层鹅卵石样细胞集落,细胞增殖能力强,连续传十几代细胞形态稳定,ECFCs高表达内皮系细胞表面抗原,而不表达造血系表面标记；可吞噬Dil-ac-LDL并结合FITC-UEA-1.结论通过简单、可靠的实验方法获得了ECFCs,为进一步探讨其生物学功能及临床应用提供了基础.【总页数】3页(P7-8,11)【作者】周丽;常青;李自成【作者单位】暨南大学附属第一医院心内科,广东广州510630;暨南大学医学院组织学与胚胎学系,广东广州510632;暨南大学附属第一医院心内科,广东广州510630【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.人脐血来源CD34+内皮祖细胞的分离、培养、鉴定及集落形成特性 [J], 李国强;刘珍珍;孙晟轩;安广宇;周海斌2.人脐静脉血内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 [J], 宋显晶;杨萍;刘斌;姜峰3.人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定★◆ [J], 李欢欢;赵丽静;何旭;王娟;刘亢丁4.人脐血和外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定 [J], 李欢欢;赵丽静;何旭;王娟;刘亢丁;5.人隐静脉血管内皮细胞的分离、培养及鉴定 [J], 李斌;刘宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

2021利用产妇分娩的胎盘脐带分离脐动脉内皮细胞范文3

2021利用产妇分娩的胎盘脐带分离脐动脉内皮细胞范文血管内皮细胞具有产生和分泌多种生物活性物质、调节血管舒缩、抗凝血、维持血管内稳态等多种生理功能。

内皮细胞在血栓与止血、血管新生、炎症及免疫反应等一系列病理过程中也起着关键的作用。

随着人们对心脑血管疾病研究的深入，血管内皮细胞的许多功能被不断发现和重新认识。

由于高血压、动脉粥样硬化、心脑血管梗塞、肿瘤等疾病的增加，引起人们对血管性疾病的病因、发病机制、发生发展过程等给予更多地关注。

血管内皮细胞是研究血管功能和心血管疾病重要的工具之一，而血管内皮细胞的分离和体外培养是研究其功能的基础。

血管内皮细胞通常从其形态学特征、CD31表达等方面进行鉴定。

目前，大多数学者选用脐静脉分离内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)作为研究模型，国内外均未见有分离人动脉内皮细胞方法的报道。

因为具有活性的人源动脉十分稀有、不易获得且取材有一定难度，所以对动脉系统特别是动脉内皮的研究多用大鼠、猪或牛的动脉细胞来替代，也有学者使用人主动脉内皮细胞进行分析研究，多数为购入的商品化细胞，受人体材料来源的限制，价格十分昂贵。

灌流消化法是利用健康产妇正常分娩的胎盘脐带分离脐动脉内皮细胞( human umbilicalarterial endothelial cells，HUAEC) ，取材容易，方法可靠，操作简便，细胞成功传代培养并鉴定。

1材料和方法 1．1 材料 1． 1． 1 主要试剂和仪器 HepG2 人肝癌细胞为北京大学生命科学学院顾军教授惠赠，人胚肾 293A 细胞系为北京大学分子医学研究所朱晓君老师惠赠，M199 培养基、胎牛血清购自 Gibco 公司，1 型胶原酶购自 Worthington 公司，成纤维细胞生长因子购自 Peprotech 公司，肝素钠、青霉素、链霉素和化学试剂购自Sigma 公司，鼠尾胶原、Matrigel 胶、小鼠抗人CD31 抗体购自 BD 公司，小鼠IgG、荧光标记的山羊抗小鼠IgG 抗体购自中山金桥公司，S100 倒置相差显微镜购自日本Nikon 公司，IX2-SP 荧光显微镜购自日本 Olympus 公司，小鼠灌胃针头购自苏州市苏杭实验动物设备厂。

人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定

人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定【摘要】目的探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法，提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。

建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。

方法取2根脐带（至少20 cm）冲净淤血，采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液，一根用0.2％胶原酶Ⅱ，另一根用0.1％胶原酶Ⅰ和0.25％胰酶等比混合消化液，比较两种酶的消化效果。

收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养，观察细胞的生长及传代。

并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。

用流式细胞术观察细胞周期。

结果两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞，胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶，且比较理想的消化时间均为13 min，细胞接种后4～5 h开始贴壁生长，1周左右可生长成单层，光镜下呈多角形，“铺路石”样排列，免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。

细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。

结论胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，成功率高，可靠性大，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。

【关键词】人脐静脉内皮细胞；细胞培养；流式细胞术；细胞周期；分离；鉴定血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞，通过产生和分泌许多血管活性物质，在维持血管舒缩、抗凝血及血管构建等方面起重要作用，同时由于其特殊的解剖学部位使内皮细胞能敏感地感知血流、压力、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化，通过一系列的信号转导过程与邻近及远处的细胞相互联系，对各种刺激作出反应，维持机体内外环境的稳定。

内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法。

新生儿脐带由于取材方便，来源充足，而成为血管内皮细胞体外实验的主要材料。

人脐静脉内皮细胞分离培养方法的建立及优化

人脐静脉内皮细胞分离培养方法的建立及优化马振华;张连杰;马艳琴【摘要】为优化人脐静脉内皮细胞(HUVEC)原代及传代的培养方法,建立一种简便且能够获得数量较多及活力良好的HUVEC培养体系.分离脐静脉并插管,用0.1％的Ⅱ型胶原酶灌注消化分离内皮细胞.M199完全培养基悬浮并接种于细胞培养瓶,37℃,5％CO2培养.待细胞铺满80％时,0.25％胰酶-EDTA消化传代培养.倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,姬姆萨染色法鉴定内皮细胞的形态,vWF因子相关抗原免疫荧光法鉴定内皮细胞.比较不同胶原酶消化时间、不同接种密度、不同胰酶消化时间、不同培养基组分对细胞得率、形态和纯度的影响.结果表明,原代培养时,Ⅱ型胶原酶最佳消化时间为15 min,最佳接神密度为1×106 mL-1;传代培养时,胰酶最佳消化时间为2min.倒置显微镜下观察和姬姆萨染色结果显示,贴壁内皮细胞呈长梭形,且呈单层铺路石状排列.免疫荧光检测结果表明,细胞胞浆呈绿色荧光,为vWF因子阳性细胞,DAPI衬染细胞核呈蓝色,显示内皮细胞纯度接近100％.本实验成功建立了HUVEC原代分离培养的优化体系,纯度高、活力好,为后续研究做好了准备.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(035)003【总页数】5页(P285-289)【关键词】人脐静脉血管内皮细胞;胶原酶消化法;姬姆萨染色;免疫荧光技术【作者】马振华;张连杰;马艳琴【作者单位】山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801;山西农业大学山西省环境兽医学重点实验室,山西太谷030801;山西农业大学生命科学学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q813.1血管内皮细胞(endothelial cells,EC)是一种多功能细胞，其在多种疾病中所起的重要作用已越来越受到重视，已成为当今医学、生物学领域的重要研究对象[1]。

人脐静脉 (human umbilical vein，HUV)是培养血管内皮细胞的常用来源之一，与动物血管内皮细胞相比，人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vascular endothelial cells,HUVEC)使实验条件更符合人体情况，结果更有意义[2]。

人脐静脉内皮细胞培养技术的研究进展

１细胞获取方式
１１非酶法：非酶法主要包括机械刮取、组织块移植两种。
但是机械刮取方法易损伤细胞，组织块移植易混杂其他血管壁细胞，近几年来这两种方法已较少使用。
１２酶消化法：这种方法的主要步骤是用酶灌注脐静脉，收
集内皮细胞后接种培养。每一个过程都影响着ＨＵＶＥＣｓ的纯度和活力。消化时间是关系到内皮细胞活力和纯度的重要步骤，消化时间过长，易混入其他杂细胞，导致内皮细胞自脐静脉脱离后在培养液中较难存活，使细胞纯度和细胞活力都下降；反之，消化时间过短，则获取的细胞较少，经过大量研究，消化时间为１０～１５ｍｉｎ较为理想［５］。而酶是成功的关键步骤，早期探索了三种酶处理脐静脉、分离内皮细胞的方法，不同实验研究表明，不同的酶有不同的优势，用胶原酶消化的细胞数最多，平均每根脐带可获取（２～５）×１０６个细胞，但有时混杂少量成纤维细胞；链丝菌蛋白酶消化获取的细胞数略少于胶原酶，但很少混杂成纤维细胞；胰蛋白酶对细胞有毒性作
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吉林医学２０１８年５月第脉内皮细胞培养技术的研究进展
白雪晶１，冯磊１，徐文波１，罗旋１，鄢东海２（１昆明医科大学第六附属医院，云南省玉溪市人民医院，云南玉溪６５３１００；２昆明医科大学，云南昆明６５０５００）
［关键词］人脐静脉；内皮细胞；培养；进展血管内皮细胞连续覆在血管内膜，其具有重要的生理功能，广泛参与了炎性反应、血管新生、免疫应答、动脉粥样硬化、血管张力调节等生理及病理过程［１］。血管内皮细胞功能失调与许多心血管疾病的发生有关，冠心病的发生与血管内皮细胞的损伤与其功能异常有密切的关系［２］。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法，是目前最简单可靠的被广泛运用于生理研究的人类血管细胞。随着细胞培养技术不断进步，文献报道了一种仪器，使用这种仪器内，皮细胞可以从人类的脐静脉中分离出来而不受污染［３］。但是作为基础实验，笔者仍然需要探索一种适用于科研工作者的分离纯化ＨＵＶＥＣｓ的方法。１９７３年Ｊａｆｆｅ等首先报道了内皮细胞体外培养的方法［４］，以后人们在此基础上不断完善和改进，以获得性状稳定、纯度较高的血管内皮细胞，并可较长时间培养（可传６～１０代），内皮细胞的体外培养关键在于获取、纯化。作为ＨＵＶＥＣｓ培养的第一步，细胞的获取方法对细胞纯度及含量至关重要，在培养细胞的获取方法上，有酶法和非酶法两种。

体外共培养模式下小胶质细胞影响内皮细胞紧密连接

体外共培养模式下小胶质细胞影响内皮细胞紧密连接廖宇洁;于晓彦;金轶平;朱皓皓【摘要】目的探讨体外共培养模式下活化的小胶质细胞对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)紧密连接的影响.方法原代培养大鼠视网膜小胶质细胞分成4组,分别用不同浓度的脂多糖(LPS)(0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL和1000 ng/mL)激活小胶质细胞24 h,通过ELISA检测LPS激活后小胶质细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平.小胶质细胞接种于Transwell的上室,用含100 ng/mL LPS的DMEM/F12培养24 h后用于实验.共培养体系作如下分组:A组,上室空白,下室HUVECs;B组,上室为未激活的小胶质细胞,下室HUVECs;C组,上室为用100ng/mL LPS激活24 h的小胶质细胞,下室HUVECs.三组培养体系共培养24 h后,将HUVECs行细胞免疫荧光染色,观察claudin 1的表达,并行Western Blot检测claudin 1和occludin蛋白表达变化.结果四组不同浓度的LPS(0 ng/mL、10ng/mL、100 ng/mL和1000 ng/mL)激活小胶质细胞24 h后,小胶质细胞分泌TNF-α的水平不同,分别为(16.36±3.90)pg/mL、(378.46±11.46)pg/mL、(507.11±11.20)pg/mL、(754.55±53.43)pg/mL,组间比较差异有统计学意义(P<0.05);小胶质细胞和HUVECs共培养24 h后,细胞免疫荧光染色显示C组HUVECs的claudin 1的表达较A组和B组减弱;Western Blot检测共培养体系A 组、B组和C组的claudin 1和occludin相对蛋白量,claudin 1蛋白相对表达量在A组、B组和C组分别为0.233±0.010、0.244±0.010、0.171±0.001,occludin蛋白相对表达量在A组、B组和C组分别为0.474±0.045、0.323±0.029、0.139±0.017,三组间比较,claudin 1和occludin的相对蛋白量差异均有统计学意义(P<0.05),C组的claudin 1和occludin相对蛋白量下调.A组和B组claudin 1的表达差异无统计学意义(P>0.05).结论活化的小胶质细胞能产生大量的TNF-α,可能通过上调TNF-α的表达使HUVECs紧密连接蛋白的表达下调.【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2019(030)005【总页数】4页(P548-551)【关键词】小胶质细胞;内皮细胞;紧密连接;血-视网膜屏障;肿瘤坏死因子-α【作者】廖宇洁;于晓彦;金轶平;朱皓皓【作者单位】复旦大学附属上海市第五人民医院眼科,上海 200240;复旦大学附属上海市第五人民医院眼科,上海 200240;复旦大学附属上海市第五人民医院眼科,上海 200240;复旦大学附属上海市第五人民医院眼科,上海 200240【正文语种】中文【中图分类】R-332在视网膜微环境的调节方面，血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB）的作用非常重要，同时它还能够影响视网膜稳态的维持效果[1]。

人脐静脉内皮细胞的研究和应用. 看过的综述pdf

约，绝大部分对于人血管内皮的研究不能直接通过角形，有一个卵圆形的核位于细胞中央，相差显微镜真看
在体实验来进行，更多情况下，都是建立在体外培养下，细胞边界清晰，细胞之间可见交错结合。而且经
的工具细胞的基础上来实施的。长期以来，对于人自体血管内皮细胞的各项研究决大多数是基于人脐
92 h。在培养 3 个月的时候，经过光镜、电镜、免疫组啊但是可
信吗
化的重新检测，细胞与取材初期相比没有变化。Jaffe
医学综述 2011 年 4 月第 17 卷第 7 期 Medical Recapitulate，Apr 2011，Vol． 17，No． 7
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等［3］的这种方法由于其令人满意的细胞获得量和纯度得到了后人的纷纷效仿，此后关于获取原代 HUVEC 的方法绝大多数是沿用该办法或略加改进而成［5，6］。
免疫组化提示培养的内皮细胞具有平滑肌表型的肌球蛋白；并且具备红细胞表面抗原（ ABH 抗原系统），其中 H 型抗原高表达，A 和 B 型抗原也存在，但是表达较弱。通过这些结果，一方面与在体的脐静脉内皮细胞进行了呼应，另一方面也与同时培养的平滑肌细胞或成纤维细胞进行了区分。
内皮细胞所有在体功能都可以通过体外培养来得以实现，这也使研究内皮细胞在不同的刺激和培养条件下的反应成为一种可能［7］。如内皮在血管收缩中发挥的作用，应力、缺氧条件下的细胞反应，血管重塑和血管形成，凝血和纤溶，与其他细胞（平滑肌细胞、血细胞、肿瘤细胞等）的相互作用。原代内皮细胞由于最接近本体细胞，因此，在这些研究领域具有重大意义。