高三生物选修三《基因工程》复习课件

genes
D: Plant cell
E: Mitochondria
F: Chloroplast G: Nucleus
T-DNA通过一种尚不清楚的机制整合到宿主基因组中
马铃薯RNAi沉默系的StBRI1表达量检测
以马铃薯β-tubulin 为内参基因，采用半定量RT-PCR 的方法分别检 测St BRI1在RNAi沉默系叶片和块茎中的表达量水平。结果显示全 株沉默系叶片和块茎中St BRI1的表达量都明显下降。
基因工程的诞生及所需工具
基因工程诞生的理论基础：DNA是遗传物质的 发现、DNA双螺旋结构和中心法则的确立、遗 传密码的破译 基因工程诞生的技术保障：限制性核酸内切酶 （分离）、DNA连接酶（重组）、载体（运载）
基因工程是在DNA分子水平上进行操作的，需 专门的工具。
构建基因表达载体pBI121-35S-StBRI1-GFP 1、StBRI1扩增（目的基因获取）：
微生物细胞
左边为 突变体，右边为 突变体转空载体恢复表型 由于 35S启动子的增强与沉默造成
（2）基因表达产物的检测
用Thr 磷酸化抗体（Anti-Thr-P）进行检测的结果显示：含 StBRI1的蛋白和含 AtBRI1 的蛋白均能检测到目标蛋白磷酸化。
亚细胞定位
由于马铃薯StBRI1 中间具有一个跨膜区，所以推测该蛋白定位于 膜上。通过瞬时转化本氏烟草，在烟草叶表皮细胞中表达带有绿 色荧光蛋白（GFP）标签的马铃薯StBRI1蛋白，可以看到马铃薯 StBRI1 主要定位于细胞膜上，而不是细胞核或者细胞质。
农杆菌介导的StBRI1 RNAi载体转化马铃薯
1、将重组质粒电击转化到农杆菌GV3101中。 ①含重组质粒 pBI121-B33-StBRI1RNAi 的农杆菌具有卡那霉素 抗性； ②含重组质粒 pART27-35S-StBRI1RNAi 的农杆菌具有壮观霉素 抗性。 2、马铃薯遗传转化 （1）侵染当天，把制备好的含重组质粒的农杆菌菌液转移到无菌 培养皿中。用镊子把预培养的无菌茎段转移到菌液中侵染12 分钟， 期间摇晃培养皿几次。
块茎特异性沉默系块茎中 St BRI1 的表达量明显下降，而在叶片 中的表达量与野生型相比没有明显差异，这说明利用B33 启动子 实现了St BRI1在块茎中的特异沉默。
蛋白质工程
蛋白质的改造可分为三类：
大改：制造出自然界中不存在的全新蛋白质 中改：在蛋白质分子中替代某一个肽段或一个特定的
结构域 小改：改造蛋白质分子中的几个氨基酸残基
3、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞并鉴定
（1）目的基因导入受体细胞及目的基因检测
a. 取50μl 感受态大肠杆菌细胞加入5μl重组质粒，轻柔混匀。 b.将菌液涂布于LB 固体培养基上（含50mg/L卡那霉素），37℃ 倒置过夜培养。 c. 挑取单菌落用PCR 检测重组质粒是否导入感受态细胞。
PCR扩增St动子
无
有
基因中内含子
无
有
基因多少
某种生物的部 某种生物的全
分基因
部基因
物种间基因交流 可以 真核生物间可以，
原核与真核生物间不可以
crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此 复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切 双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引 导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。
37℃，反应30 分钟。
启动子：位于基因的首端 的一段特殊的DNA片断， 它是RNA聚合酶识别和结 合的部位，有了它才能驱 动基因转录出mRNA，最 终获得蛋白质。
终止子：位于基因的尾 端的一段特殊的DNA片 断，能终止转录。
标记基因：用于鉴别受体细胞中是 否含有目的基因，从而将有目的基 因的细胞筛选出来
高三生物选修三基因工程复习指导
基因工程
概念5 基因工程赋予生物新的遗传特性
5.1基因工程是一种重组DNA技术 5.1.1概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物 学等学科基础上发展而来的 5.1.2阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、 DNA连接酶和载体三种基本工具 5.1.3阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基 因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产 物的检测鉴定等步骤 5.1.4举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改 善了人类的生活品质 5.2蛋白质工程是基因工程的延伸 5.2.1概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以 获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质 5.2.2举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生 产目标蛋白的过程
以反转录得到的叶片cDNA为模板，扩增St BRI1编码区片段。
PCR 扩增体系
缓冲液 耐热的DNA聚合酶
引物1 引物2
PCR 反应程序为95℃4min，33 cycles（98℃15sec，60℃15sec， 68℃2认为，基因工程 技术对人体健康和动物健康具有危害性，影响农业的发展， 破坏生物的多样性，他甚至反对基因工程技术的研究和应 用。
那斐尔生命伦理学委员会的研究报告《转基因作物， 伦理和社会问题》认为，转基因作物能给环境带来利益但 同时又有可能引起“基因污染”而给环境带来灾难。
1972年美国遗传学家伯格(Berg)第一次把两种不同 生物的DNA（猴病毒sV40和人噬菌体的DNA）人工地重 组在一起，首次获得人工合成的杂种分子，从而建立了 基因（DNA）重组技术。
DNA重组技术的诞生标志着人类从此掌握了一项可 以按自己意愿设计和构建生物体的关键技术，它使人类 无需等待大自然缓慢的自然选择就能改变生物遗传性状、 创造新物种。这不仅大大加快生物进化速度，改变生物 进化方向，而且也带来了社会生产领域中的技术变革， 为现代农业的发展开创了新的广阔前景。
菌落PCR鉴定重组质粒
以马铃薯叶片cDNA 为模板，成功扩增得到大小为3621bp的StBRI1编码区片段。 重组质粒转化大肠杆菌后，菌落PCR鉴定获得预期大小的扩增条带。
将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
将目的基因导 入
基因枪法
植物细胞 花粉管通道法
方法
将目的基因导
入
——显微注射法
动ห้องสมุดไป่ตู้细胞
将目的基因 导入 ——感受态细胞
概念6 生物技术在造福人类社会的同时也可能 会带来安全与伦理问题
转基因生物对人类有害吗？
1975年2月24-27日在美国加利福尼亚州举行的阿西罗 玛会议，是一次对生物安全极为重要的国际会议，是世界 上第一次正式提出转基因生物安全性问题的会议。它标志 着人类开始正式关注转基因生物的生物安全性。
（2）弃去菌液，用无菌滤纸吸干菌液，把茎段转移到覆有滤纸的 新的预培养基上。22℃，黑暗条件下培养3 天。 （3）把茎段转移到筛选培养基上，置于22℃，16小时光照环境下， 每7-10天继代一次，直到茎段一端发生出抗性小苗。
（4）当小苗长到至少 0.5cm 长时，把小苗从外植体上切下来，转 移到生根培养基中。
以基因工程技术为核心的现代生物技术代表着最有前途的 技术方向，是本世纪最具有影响的高新技术新兴产业带， 是最有生命力的经济增长链，是未来前景最有竞争力的产 业群。
发展和应用基因工程技术对人类有利的巨大潜力，防 范其不利于社会可持续发展的动向。
在加强对转基因技术研究、管理和安全性评价的基础上， 基因工程技术在21世纪必将合理应用和健康发展，为社 会生产和经济健康发展作出更大贡献，达到经济、社会 和环境之间的协同发展，实现人类社会的可持续发展。
2、基因表达载体的构建 （1）酶切载体 pBI121-35S-GFP和目的基因
酶切 pBI121-35S-GFP 体系
37℃，酶切30分钟
（2）拼接：将StBRI1片段与表达载体pBI121-35S-GFP 连接即获 得基因表达载体 pBI121-35S-StBRI1-GFP。
反应体系如下：
DNA连接酶
（5）在生根培养基中生长3 周左右生根，4周还不生根的植株可判 断为假阳性。待根系发达后，转移到潮湿的蛭石中炼苗 1 周，之后 移栽到温室中生长。
A: Agrobacterium tumefaciens
B: Agrobacterium genome
C: Ti Plasmid : a: T-DNA , b: Vir genes , c: Replication origin , d: Opines catabolism