最新05第六章分子生物学研究法下

05第六章分子生物学研究法下
PCR的基本原理二
PCR的基 本原理
PCR Flash
PCR反应的体系
1 DNA模板 2 一对引物 3 耐热的DNA聚合酶 4 4×dNTP 5 缓冲液 6 Mg2+、K+离子 7 酶活性保护剂
PCR仪
PCR仪实际上就是一种温度循环仪，它 能够快速地升降温和保持恒温，全部由电脑 控 制 。 常 用 的 反 应 容 器 有 0.2ml 的 薄 壁 Eppendorf管和毛细玻璃管。
引物5’端外加BamHⅠ酶切 位点掺入产物的两端
引物
4 为了方便PCR产物的检测和分析，可以在引 物的5’端以同位素或非同位素修饰（32P、荧 光素、生物素等）。
5 当要扩增的DNA序列不知，但知其编码的氨 基酸序列，可反推出DNA序列，为设计引物 提供依据。因简并密码的存在，反推出的 DNA序列是不唯一的，这时应采用简并引物。
在循环温度的设定中，最重要的是退火温度。 退火温度较低可提高扩增效率，但产物的特异性较差； 退火温度较高可提高产物的特异性，但扩增效率较低。
嵌套PCR
( nested PCR)
嵌套PCR主要是为了提 高扩增产物的特异性。
嵌套PCR提高产物特异性的原理
单用第一对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的Βιβλιοθήκη 特异性产物。循环条件的设定
变性---------→退火----------→链延伸
循环条件举例
循环 首轮循环 中间循环 末轮循环
变性 94℃ 5 min 94℃ 1 min 94℃ 1 min
退火 50℃ 2 min 50℃ 2 min 50℃ 2 min
链延伸 72℃ 3 min 72℃ 3 min 72℃10min
Taq DNA聚合酶
Taq酶有5’→3’的聚合活性和5’→3’的外切活性， 但缺少3’→5’的外切活性，所以没有校正功能，有 时会发生错误合成。使用Taq酶还往往在所有扩增 产物的3’端增加一个非模板依赖的A。现在作为商 品供应的Taq酶有从嗜热水生菌中提纯的天然酶和 利用大肠杆菌生产的基因工程酶。
不对称PCR
( asymmetric PCR)
不对称PCR 大量扩增模 板的一条链。
定量PCR
( quantitative PCR )
定量PCR测定痕量模板的量。
严格地掌握实验条件，使PCR扩增产物量与 模板量成正比。这样可将不便于直接测定的痕量 的模板扩增后检测，按比例得到原模板的量。
此 法 常 用 于 低 丰 度 mRNA 的 检 测 。 先 将 mRNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板扩增出 产物，检测产物的量从而推算出低丰度mRNA的 量。这种方法称为反转录PCR（RT－PCR）。
特异性产物
非特异性产物
单用第二对引物扩增，得一特异性产物和可能存在的非特异性产物。
非特异性产物
特异性产物
以第一对引物扩增的产物为模板，用第二对引物再次扩增，只得到特 异性产物。
反向PCR
( inverted PCR)
反向PCR扩增已知序 列两侧的未知序列。
锚式PCR
( anchored PCR)
引物 5’ 端修饰技术
修饰法
用途
修饰法
用途
1.附加核酸序列
2.功能基因修饰
酶切位点
便于克隆等
同位素(35S, 32P)
噬菌体启动子
测序，合成 RNA探针等
生物素
蛋白质结合序列 产物纯化，检测 荧光素
检测，定量 检测，纯化，定量 检测，纯化
酶
检测
Taq DNA聚合酶
现 在 常 用 的 Taq 酶 ， 在 95℃ 的 变 性 温 度 下 （20秒），经过50次循环仍保持65 %的酶活性。 对于Taq酶的聚合酶活性来说，最佳作用温度为 75~80℃ ， 60℃ 时 聚 合 酶 活 性 仅 剩 1/2 ， 37℃ 时 聚合酶活性仅剩1/10。但在许多情况下，需要 在低于最适温度条件下进行聚合反应，以免引 物从模板上解离下来。
RNA模板应先逆转录成cDNA再进行PCR扩增。
引物
1 长度一般为15~30个核苷酸。引物太短与模 板结合的位点特异性差，引物太长与模板结 合的速率下降，影响PCR的效率。
2 不应有超过3个连续的C或G。引物自身不存 在互补序列，两个引物之间也不能有超过4 个连续碱基互补的情况。
3 当引物的3’端有足够长与模板互补的序列时， 引物的5’端可以不与模板互补，利用这点可 在PCR产物的两端加上特殊序列（如限制性 内切酶位点）。
PCR的反应体系
Taq酶的用量必须适当，一般典型的扩增反应 加2单位的酶，太高非特异扩增增加，太低时扩增 效 率 下 降 。 4 种 dNTP 的 浓 度 应 相 等 ， 浓 度 在 20 ～ 200μmol/L之间。反应体系中加入BSA或明胶可以 保护Taq酶活性。在无热盖的PCR仪上，反应液表 面应加矿物油以阻止蒸发。
PCR的反应体系
PCR中常用的缓冲液是10～50 mmol / L的 Tris-HCl缓冲液，pH8.3～8.9，还需要合适的Mg2+ 浓度（约1.5 mmol / L）和K+浓度（50 mmol / L）， 其中Mg2+浓度须经过预备实验确定合适的值，在 0.05 mmol / L和5 mmol / L之间试验，按每0.5 mmol / L增加。Mg2+浓度太高时非特异扩增增加， 太低时产物减少。
锚式PCR扩增已知 序列一侧的序列。
锚式PCR扩增已知序列3’侧序列
Rapid Amplification of cDNA Ends
扩 增 mRNA3’ 端 或 5’ 端 的序列称为RACE。
锚式PCR扩增已知序列5’侧序列
扩增全长的mRNA序列
要 扩 增 全 长 的 mRNA ， 先 用 oligo(dT) 作引物逆转录该mRNA成全长的cDNA第一 链，再给cDNA第一链的3’端进行同聚物加 尾 （ 如 GGGGG ） ， 最 后 用 oligo(dT) 和 oligo(dC)进行扩增。
对DNA模板的要求
对 DNA模板 纯度的 要求不 很高 ， 但必须 除去 DNA聚合酶抑制剂。理论上有一个DNA模板分子就 可以扩增出大量的产物，实际上使用pg~ng级的模板 量。模板一般是双链分子，也可以是单链分子。模 板DNA分子不宜太长，可用切点稀少的限制酶切成 较短的片段。由于环状DNA模板的扩增效率较线状 DNA模板低，所以最好先将环状DNA用限制酶切成 线状再行扩增。