分子生物学研究方法2013

分子生物学研究方法——其他分子生物学研究方法
李崇奇
1.凝胶滞缓实验
●凝胶滞缓实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA);又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）;又叫做凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。

●它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。

应用
This procedure can determine if a protein or mixture of proteins is capable of binding to a given DNA or RNA sequence, and can sometimes indicate if more than one protein molecule is involved in the binding complex. Gel shift assays are often performed in vitro concurrently with DNase footprinting, primer extension, and promoter-probe experiments when studying transcription initiation, DNA replication, DNA repair or RNA processing and maturation.
凝胶阻滞实验原理
凝胶阻滞实验
●蛋白质与DNA结合后将大大增加相对分子质量，而凝胶电泳中裸露的DNA朝正电极移动的距离与其相对分子质量的对数成正比。

因此，没有结合蛋白质的DNA片段移动速度快，而与蛋白质形成复合物的DNA由于受到阻滞而移动的慢。

于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带。

●DNA与蛋白的结合导致了电泳迁移率的降低
可以间接的阐明体内发生DNA与蛋白质之间的相互作用。

1. 用具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，可检测某种蛋白是否属于此类转录因子
2. 在竞争DNA的已知转录因子结合位点上，引入突变可评估突变对竞争DNA性能及其转录因子结合的影响。

拟南芥转录因子at5g11590对不同DNA元件有不同的亲和力
EMSA-化学发光
●1、凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的DNA（含有转录因子位点）结合的转录因子蛋白质；
●2、DNA结合竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位；
●3、通过竞争DNA中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的影响；
●4、也可以利用DNA同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子；
●5、该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。

噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体
的重新组装而展示在噬菌体表面。

二者的区别
●pVIII展示的多肽比较小，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组装。

●pIII只要不影响感染，可以展示300 aa的多肽。

●噬菌质粒能展示的蛋白已经达到86 kDa。

启动子外壳蛋白噬菌体载体融合基因转化E.coli 产生融合噬菌体融合蛋白与目的
蛋白互作洗脱后，重新感染互作，结合不互作，不结合
被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。

肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。

所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。

蛋白质磷酸化分析技术
蛋白激酶催化ATP或GTP的γ磷酸基团转移到底物蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上，促使底物蛋白发生磷酸化，而蛋白质磷酸酯酶则能催化底物蛋白发生去磷酸化。

此外，底物蛋白的组氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸残基上也能发生可逆磷酸化。

泳道1、4和5中的蛋白
质具有使蛋白质磷酸化
和6中的蛋白质不能使
MBP (myelin basic
protein) 磷酸化。

蛋白质免疫印迹技术与抗体制备•印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

•1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。

•而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

Western Blot 基本原理
Western Blot 优点
☐高分辨率的电泳技术
☐特异敏感的抗原-抗体反应☐1-5ng中等大小的靶蛋白
图5－28免疫印迹法示意图
•优点：
–1. 免疫特异性不受标记影响
–2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）–3. 多种标记的二抗可供选择
–4. 可选择不同的Marker
•缺点：
–1. 交叉反应引起的非特异性条带
–2. 额外的二抗孵育以及条件优化
Western Blotting : 直接法
•优点：
–1.快速（一种抗体）
–2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带•缺点：
–1.免疫反应性降低
–2.无信号二级放大
–3.抗体标记费时昂贵,使用不方便
抗体
单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAb）：由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。

高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。

多克隆抗体（p olyclonal a ntibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。

所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。

多克隆抗体制备流程
•（一）免疫原的制备
•（二）免疫动物
•（三）免疫血清的收集
•（四）免疫血清的鉴定
•（五）免疫血清的保存
抗原制备
免疫原—天然抗原、人工合成抗原；
蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；蛋白质:
特异性偶联多肽、
重组表达该蛋白全长或部分片段、
重组表达融合蛋白
特异性偶联多肽
•化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白耦联是很重要的。

•载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T－帮助细胞，进而诱导B－细胞反应。

•载体蛋白
•keyhole limpet hemacyanin(KLH),
•牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）, •卵清蛋白（ovalbumin，OVA）
•牛甲状腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY)。

•KLH具有更高的抗原性，是最为常用的多肽耦联载体。

免疫动物的选择
•①抗原来源与动物种属的关系。

抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。

•②动物个体的选择。

适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。

•③抗原性质与动物种类
常用的免疫动物
•兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。

（新西兰,大耳白）•小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。

（BALB/C,昆明鼠）•大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过
程要麻醉动物。

（Wistar大鼠）
•羊（sheep、goat）：常用于较大批量地
生产抗体（商品）。

•马（horse）：常用于大批量生产治疗用
抗体（商品）。

•豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。

动物免疫
•抗原的免疫剂量是依照给予动物的种类、免疫周期以及所要求的抗体特性等不同而不同。

剂量过低，不能引起足够强的免疫刺激，免疫剂量过多，有可能引起免疫耐受。

在一定的范围内，抗体的效价是随注射剂量的增加而增高。

蛋白质抗原的免疫剂量比多糖类抗原宽。

•一般而言，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/ 次，大鼠为100μg～1 000μg／次，兔为200μg～1 000μg/次。

•两次注射的间隔时间应长短适宜,太短起不到再次反应的效果，太长则失去了前一次激发的敏感作用。

一般间隔时间应为5~7天。