土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定
产淀粉酶菌株的分离与纯化
产淀粉酶菌株的分离与纯化一、实验目的和内容目的：掌握用平板稀释法分离得到微生物纯种的方法内容：分离产淀粉酶的芽孢杆菌二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，因此可以从土壤中分离、纯化有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板分离法是常用的方法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两个方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等条件，或加入某种底物、抑制剂造成只利于该微生物生长而一直其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落儿获得一种纯培养，获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板技术来完成。
（3）纯化方法：平板划线法，即将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线，第一区（A区）面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区（B、C 区）是逐级稀释的过渡区，第四区（D区），则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。
为了得到较多的典型单菌落，平板上四区面积的分配应是D﹥C﹥B﹥A。
三、实验材料1.土样2. 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏1.5g、蛋白胨15g、NaCl 2.5g、琼脂10g、2%可溶性淀粉10g、无菌水1000ml、PH7.4-7.63.试剂与材料用具：无菌水烧杯、玻璃管、涂布棒、无菌吸管、移液枪、玻璃棒、接种环、无菌培养皿、三角烧瓶、量筒、培养基分装器、天平、药匙、PH试纸、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、棉花、牛皮纸、记号笔，橡皮筋等。
四、实验步骤（一）稀释涂布平板法1.制备培养基2.倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，待冷至55~60℃时，倒平板。
3.制备土壤菌悬液称取土样10g放入盛有90ml无菌水的烧杯中，搅拌均匀。
用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从中吸取1ml加入另一支盛有9ml无菌水的试管中，充分混匀，以此类推制成10ˉ1,10ˉ2,10ˉ3,10ˉ4,10ˉ5,10ˉ6不同稀释度的土壤溶液。
《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计
产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。
因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。
主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。
淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。
产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。
三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。
淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。
牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。
4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。
四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。
（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。
用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。
土壤中产淀粉酶菌株的分离与鉴定及高活力淀粉酶的筛选
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选组数：第一组组员：王臣东李长花张晓晶杨明明1 实验目的1.1掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
1.2进一步掌握和熟练无菌操作技术。
1.3掌握分离纯化微生物的方法。
1.4掌握从环境中采集样品并从中分离纯化某种微生物的完整操作步骤。
1.5巩固以前学的微生物学实验技术。
1.6学习淀粉酶活性的测定方法。
2 实验原理α-淀粉酶是一种液化型淀粉酶，它的产生菌芽孢杆菌，广泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉类物质的土壤等样品中。
淀粉酶是能够催化淀粉水解，转化成葡萄糖的、麦芽糖及其他低聚糖的一类酶的总称。
从淀粉厂周围采集土壤样品，采用稀释法制备土壤稀释液，涂布于营养琼脂培养基平板上培养1天，在平板上滴加碘液，可产生淀粉酶的菌株水解淀粉遇碘不变蓝，在培养基表面形成透明圈。
然后挑取可产生透明圈的菌株在平板划线培养2-3次，得到纯化的菌株，再测其酶活力大小。
分离得到纯种这只是选种工作的第一步。
所分得的纯种是否具有生产上所要求的性能，还必须要进行性能测定后才能决定取舍。
性能测定的方法分初筛和复筛两种。
初筛一般在培养皿上根据选择性培养基的原理进行。
例如要测定淀粉酶的活力可以把斜面上各个菌株一一点种在含有淀粉的培养基表面，经过培养后测定透明圈与菌落直径的比值大小来衡量淀粉酶活力的高低。
复筛是在初筛的基础上做比较精细的测定。
一般是将微生物培养在三角瓶中作摇瓶培养，然后对培养液进行分析测定。
在摇瓶培养中，微生物得到充分的空气，在培养液中分布均匀，因此和发酵罐的条件比较接近，这样，测得的结果更具有实际的意义。
3 实验器材3.1样品：土样（甘肃昆仑生化公司周围采集的土样若干）3.2培养基3.2.1平板培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、可溶性淀粉2g、琼脂15-20g、自来水1000ml3.2.2斜面培养基：同3.2.13.2.3液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、自来水1000ml3.3 器材：30个90培养皿、酒精灯、接种环、14个试管、5个三角瓶（250ml）、涂布棒、移液管、恒温水浴锅、恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台3.4试剂3.4.1 淀粉酶活力测定：碘液3.4.2革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇3.4.3 2%淀粉溶液：2克淀粉加入少量热水使其溶解，再加入热水至100ml4 实验步骤4.1 培养基的制备及其仪器的灭菌4.1.1按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案一、综述：淀粉酶是淀粉降解酶。
它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。
它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。
淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。
从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。
常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。
其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌【2】、凝结芽孢【3】。
由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体表面及水体中【4】。
所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。
二、实验目的要求1．了解生物分离提纯的原理和方法技术2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
三、实验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。
土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。
土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少【5】。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物实验--土壤中分离产生α-淀粉酶
土壤中分离产生α-淀粉酶的菌种XXXXXXXX（XXXXX大学生命科学学院，浙江杭州310018）摘要：采集浙江理工大学校园内的土壤，用淀粉牛肉膏蛋白胨培养。
长出菌落后滴加碘液，筛选可以产生淀粉酶的细菌菌株。
对这些菌株分别加以划线分离纯化。
后对新长处单菌落生理生化特征测定，结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。
关键词：α-淀粉酶、分离鉴定、纯化培养、枯草芽孢杆菌1.前言淀粉酶(Amylase)是水解淀粉和糖原的酶类的总称，广泛存在于动植物和微生物中，是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种[1] 。
特别是20世纪60年代以来，由于酶法生产葡萄糖，以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化。
淀粉酶的需要量越来越大，占整个酶制剂总产量的50%以上[2]。
淀粉酶根据其作用方式可分为α- 淀粉酶(EC3.2. 1. 1) 与β- 淀粉酶(EC3.2.1. 2)、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶四类。
α- 淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物中[3]。
微生物的许多种类都能产生淀粉酶，Buchanan和Tamuri等人描述了数百种嗜热真菌和上千种细菌可产生淀粉酶，仅Bacillus 属48个种中就有32个种能产生α-淀粉酶[4]。
淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域[5]。
因为淀粉酶的用途广泛，各国在对淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研究工作[6-8]，目前所得淀粉酶活力最高可达到260 U /mL左右。
虽然不少微生物能产生淀粉酶,但适合商业生产需要的菌株仍然很少，在淀粉酶生产过程中选择适合的菌株是最重要的前提条件。
本文以土壤作为原料, 从中筛选出具有产淀粉酶能力的出发菌株, 并对所得的出发菌株进行分离纯化培养，并对其结构形态进行检测观察，参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步鉴定为枯草芽孢杆菌。
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案报告
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案报告实验方案报告：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌一、实验目的：本实验旨在从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，为进一步研究淀粉酶的性质和应用提供材料基础。
二、实验原理：产淀粉酶的芽孢杆菌主要存在于土壤中，它们具有高效分解淀粉的能力。
本实验通过稀释土壤样品，制备土壤悬浮液，然后采用平板和液体培养基法进行分离纯化。
三、实验步骤：1.土壤样品的采集2.土壤样品制备将土壤样品采样袋中的土壤倒入无菌的研钵中，使用无菌铁锹将土壤表面的杂质去除，然后将土壤样品与等量无菌蒸馏水混合浸泡2小时。
使用无菌玻璃棒搅拌1分钟，然后过滤土壤悬浮液，得到土壤样品的0.1倍稀释液。
3.平板培养基分离将制备好的土壤样品0.1倍稀释液分别取0.1mL均匀涂布在含有淀粉的固体培养基平板上，用无菌的铁锹均匀摊开。
将培养皿倒立放置在培养箱中，以30℃恒温培养。
4.鉴定单菌菌落在培养平板上观察菌落生长情况，挑选形态不同的菌落，并进行分离培养。
将单个菌落挑选到含有淀粉的液体培养基中，用无菌胶头移液管进行吸取和移植。
5.验证淀粉酶活性将挑选分离得到的菌株分别接种在含淀粉的液体培养基中，并进行培养。
通过观察培养基颜色的变化、液体浑浊度的变化以及淀粉浓度的定量检测，判断菌株产淀粉酶的能力。
四、实验结果：根据实验步骤所述，从土壤中成功分离得到了产淀粉酶的芽孢杆菌。
通过观察培养基的颜色变化和液体浑浊度的变化，可以初步判断杆菌产淀粉酶的能力。
五、实验讨论与结论：通过本实验的步骤操作，成功分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。
该实验为进一步研究淀粉酶的性质和应用提供了材料基础。
此外，实验中还可以对分离得到的菌株进行基于16SrRNA基因的鉴定，对其进行淀粉酶的基本特性、产酶条件和产酶规律等方面的研究。
这对于我们深入了解淀粉酶功能机制，以及在饲料、食品、生物工程等领域的应用具有重要意义。
六、实验心得：通过本次从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌的实验，我学会了土壤样品的制备和分离培养的方法，掌握了菌株的挑选和鉴定技巧，对淀粉酶产生的条件和酶活性的检测有了初步了解。
土壤中含淀粉酶细菌的分离实验报告
土壤中含淀粉酶细菌的分离摘要：本实验通过培养基的配制，常用器皿的准备及无菌水的配制为从土壤中分离出产淀粉酶细菌做了准备。
又通过加热和不加热分组来观察两组相同的分密度梯次的细菌的生长情况和菌落数。
还利用含淀粉酶细菌能够分泌淀粉酶，淀粉酶能够分解淀粉，淀粉能与碘试剂发生显色反应，含淀粉酶细菌菌落生长的地方不能放生显色反应而呈现透明圈，通过统计透明圈数来分析培养基浓度和温度对土壤中细菌菌落的形成的影响及土壤中有淀粉酶活性细菌占总细菌的比例。
关键词：培养基土壤微生物菌种分离含淀粉酶细菌1、前言土壤中生活着许许多多的不同种类的、数量庞大的微生物，是微生物多样性的重要场所，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业和环境保护有着不可忽视的影响。
早在十九世纪中期，农业化学和细菌学的形成和发展为研究土壤中物质转化的微生物学过程开辟了道路。
二十世纪五十年代，人们对土壤只能够诸营养元素循环的各个环节的微生物学过程进行了深入的研究，论证了土壤微生物对增强土壤肥力的作用。
新中国成立后，国家开展了对土壤微生物的教学和科学研究，文革后国家给予力支持，二十年来的奋力研究取得骄人的成绩。
现如今，生物技术迅猛发展，一些仅在实验室里制备用于研究的细菌已经可以工业化大规模生产，可以利用该生物的有机体或其产物，将物料转化为商业性产品，在食品、轻工、医药及农林等方面广泛应用。
本实验是从土壤中筛选可以生产淀粉酶细菌为目的，利用物理和化学方法探究稀释度对细菌菌落形成的影响，以及用不同的处理方式反映出高温加热对含有高活性淀粉酶细菌的比例产生影响。
2、材料与方法2.1 材料2.1.1 培养基配制的材料与试剂材料：土豆200g ，葡萄糖20g ，琼脂粉2% 6g ，淀粉1% 3g ，废报纸，棉花，纱布，棉绳试剂：无菌水2.1.2 玻璃器皿无菌培养皿，无菌吸管，试管十支，移液管两支2ml，圆底培养皿十个，玻璃珠20颗，三角瓶50ml，具塞三角瓶2.1.3 样品新鲜土壤2.2 方法2.2.1 PDA溶粉的培养基制备把土豆削皮，切成边长1-2cm，称取60g倒入大三角瓶中，加600ml水并在电炉上煮沸20min，边加热边振荡以免烧糊，趁热在纱布上过滤，在滤液中添加6g葡萄糖，再加入3g1%的淀粉和6g2%的琼脂粉，加热熔化，定容至250ml，然后用制作好的棉塞塞住瓶口，再用旧报纸包一层包扎好，在灭菌后把培养基放入养箱中培养24小时。
淀粉酶产生菌株细菌的分离纯化及检测
1%豆粕粉浸出液的制备
称取1%豆粕粉，加入适量水； 加热煮沸20min，过滤后定溶至1Hale Waihona Puke 的体 积备用； 加热过程注意补水。
实验中器材的准备（需要包扎灭菌）
1ml无菌吸管 6支 99ml无菌水 1瓶（带玻珠，装于 250ml三角瓶中） 9ml无菌水 4支（装于18×180mm试 管） 不锈钢涂布器 3支
实验步骤及安排
今天完成稀释平板分离培养——倒平板、 样品稀释、加样、涂布、恒温倒置培养 （37℃ 48hr）； 2天后晚上，挑菌保存，点植平板培养 24hr； 点植后24hr内检测淀粉酶产生量——测量 平板上透明圈、菌落直径，并计算出比值。
实验结果
记录稀释平板分离的结果——细菌数、产 淀粉的菌数及所点比例； 记录点植结果——挑取菌株编号、透明圈 直径、菌落直径，并计算出透明圈、菌落 直径比； 根据以上结果完成实验报告； 确定相关菌株（5~10株）保存好，准备 进行下周摇瓶初筛试验。
目的要求
了解利用选择培养基进行α-淀粉酶产生菌 株分离的要求。 掌握α-淀粉酶产生菌株相关分离纯化的方 法步骤——稀释平板菌落分离、挑菌保存、 平板点植、观察测定透明圈等。 学习在平板上进行α-淀粉酶产生菌株的检 测及产酶高低的判断。
平板分离用选择培养基
可溶性淀粉 10g； 1%豆粕粉浸出液 1000mL； Na2HPO4 .12H2O 2g； （NH4）2SO4 1g； CaCl2 0.5g； KCl 0.15g； 琼脂 20g pH 7.0~7.6 121.3℃灭菌20分钟
实验一土壤中淀粉酶产生菌的分离和纯化
1.样品：草坪采集的新鲜土壤
2.培养基
2.1 平板筛选培养基牛肉膏5g 蛋白胨10g NaCl 5g 可溶性淀粉 2g蒸馏水 1000ml，调节PH为7.0，121℃灭菌20min（固体培养基，则每升培养基中加20g琼脂）。
2.2 斜面培养基牛肉膏5g 蛋白胨10g NaCl 5g 可溶性淀粉 2g蒸馏水 1000ml，调节PH为7.0，121℃灭菌20min（固体培养基，则每升培养基中加20g琼脂）。
2.3涂布平板取9个筛选培养基，用记号笔在培养皿底部贴上标签，分别注明稀释度（10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）、组别和班级，然后用无菌吸管分别由10-2、10-3、10-4、10-5、10-65管土壤稀释液中各吸取0.1ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置，右手拿无菌玻璃涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5～l0min，使菌液浸入培养基。
1.2 溶化在烧杯中先加入4/5总体积蒸馏水。将药品完成溶解后，倒入锅中加热至煮沸时加入琼脂，边夹边搅拌直到琼脂完全溶解。
1.3调Ph 根据培养基对pH的要求，用1M/L NaOH或1M/LHC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等,最后补充水到所需总体积。
1.4分装过滤后立即用漏斗进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜，固体分装量为管高的1/5，灭菌后制斜面；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等方法分离、纯化出该微生物，直至得到纯菌株。
一种从土壤中分离产淀粉酶的微生物的方法
一种从土壤中分离产淀粉酶的微生物的方法
淀粉酶是一种重要的酶类，在食品、制浆造纸等工业中广泛应用。
为了提取淀粉酶，我们需要寻找土壤中的微生物作为产酶菌株，并开发一种高效的分离方法。
下面介绍一种用于分离产淀粉酶微生物的方法。
首先，我们需要采集土壤样品，最佳采集时间一般在较潮湿的季节，例如春季或秋季。
将土壤样品放入无菌容器中，避免外界污染。
接下来，将土壤样品进行稀释处理。
取适量的土壤样品，加入适量的浸润液（如无菌盐水溶液），进行充分的搅拌混合。
然后，进行一系列的稀释，以获得适合于微生物生长的平衡菌落计数。
然后，将样品进行涂布。
取一定稀释倍数的土壤样品，均匀涂布在含有淀粉基质的琼脂平板上。
淀粉基质可以提供微生物产酶的营养来源。
在涂布后，将琼脂平板进行孵育，一般在适宜温度下培养24-48小时。
在孵育结束后，观察琼脂平板上是否出现透明环或透明区域。
这些透明环或区域代表微生物分泌产生的淀粉酶对淀粉基质进行降解的结果。
选择直径适当、透明区域清晰的菌落进行分离。
分离后，我们可以进行产淀粉酶微生物的纯化和鉴定。
对分离的菌株进行单菌落传代培养，将单一菌落的微生物培养至纯化。
然后，通过形态学观察、生理生化特性测试和16S rRNA基因测序等手段，对微生物进行鉴定确认。
通过这种方法，我们可以从土壤中分离并鉴定出产淀粉酶的微生物菌株。
这对于淀粉酶的生产和应用具有重要的意义，为相关工业提供了有益的资源。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定及提高产酶能力的研究
化蛋 白胨 １／， 母浸 膏 ０ ５ ， Ｃ ． ， ６酵 ９ ． Ｎａ １ ５ 可溶 性 ０ 淀粉 ２ ， Ｈ 值 为 ７ ０ 验 证 有 无 组 成 型 突变 菌 株 ｐ ．；
培养 基 配 方 为 胰 化 蛋 白 胨 １ ， 母 浸 膏 ０ ５ ， 酵 ．
２ ２ １ 筛选 产酶 茵株 的 土壤 处理 ． ． 从 丽 水职业 技 术学 院 的 花坛 地 下 ５ ０ ｍ 处 ， ～２ ｃ
获 取 熟 化 、 机 质 含 量 高 的 肥 沃 土 壤 ， 离 菌 株 。 对 有 分
的首 位 。 自然 界 中具有 十 分丰 富 的产淀 粉酶 菌种 资 源 ， 实 验从 土壤 中分 离 出高产 淀 粉酶 能力 的菌 株 ， 本 通 过 常 规 方 法 结 合 １ Ｓ ｒ ＮＡ 序 列 分 析 鉴 定 该 菌 ８ Ｄ
２１ 年 ３ Ｏ２ 月
Ｊｕｎ ｆ ｒ ｎＳｉｃ ａｄ ｅ ｎｌ ｙ ｏｒａｏ Ｇｅ ｃｎｅ ｎ ｃ ｏ ｇ ｌ ｅ ｅ Ｔｈ ｏ
绦 色科 技
第 ３ 期
土壤 中产淀粉 酶菌株 的分离 、 鉴定及 提高产 酶
能力 的研究
傅 冰， 王东明
（ 水职 业技 术 学院 环境 工程 分 院 ， 江 丽 水 ３ ３０ ） 丽 浙 ２ Ｏ Ｏ
摘 要 ： 用 形 态分 析 结 合 １ Ｓ ｒ ＮＡ 序 列 分 析 鉴 定 菌株 ， 用 物 理 诱 变 、 学 诱 变及 复 合 诱 变等 方 法 诱 利 ８ Ｄ 采 化 变 菌株 ， 一 步 筛选 获 得 了具 有 更 高 产 淀 粉 酶 能 力的 菌株 。研 究表 明 ： 过 筛选 获得 具 有 高产 淀 粉 酶 能 进 通 力的 真 菌 菌株 ｆ — ｌ 鉴 定 为 黑 曲霉 ， 名 为 黑 曲 霉 Ａｎ ｕ ， 命 。Ａｎ进 一 步 经 紫 外 诱 变 、 学诱 变 筛 、 合 诱 变 化 复 筛选 出产 酶 活 力 最 大 的 菌 株 。成 功 得 到 了 高产 淀粉 酶 活 力 的 菌 株 Ａｎ ７ 一 ２ 。 一 ｃ ｕ
土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定
土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。
2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。
3．掌握分离纯化微生物的方法。
4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。
二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。
在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。
24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。
然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。
枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。
三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。
高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。
3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。
2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。
产淀粉酶菌株的分离与纯化
产淀粉酶菌株的分离与纯化淀粉酶是一种非常重要的酶，能够分解淀粉成为可溶性糖，因而在食品、医药、酿酒等行业得到广泛应用。
因此，分离和纯化产淀粉酶菌株是具有重要意义的。
下文将介绍产淀粉酶菌株的分离与纯化方法。
1. 采集样品：淀粉酶通常存在于地下、水中、土壤等环境中。
样品的选择应根据所需的淀粉酶的类型和应用场景来决定。
2. 感染培养基：将样品置于适宜的环境中，如适温、适湿度、适pH值的培养基中，让细菌在培养基中生长和繁殖。
比较常用的培养基有TSA、PDA、LB、NB等。
3. 分离单菌：通过分离单菌，可以确定产淀粉酶的细菌，操作方法较为简单。
将样品分别在加了32g/L的琼脂和未加琼脂的培养基上涂布，按舞台上单菌生长的特点，通过肉眼观察或显微镜观察，挑选纯化细菌。
采用串联稀释法和滤膜法也可以分离单菌。
4. 鉴定菌株：通过对不同细菌的营养代谢特性，生化特性和形态特征等鉴定菌株，找出含有产淀粉酶的菌株。
1. 生长条件的调节：影响淀粉酶生长和产酶能力的因素有很多，如温度、pH、营养物质等。
应该根据菌株特性，适当调整这些因素，以提高淀粉酶的产量。
2. 分离淀粉酶：淀粉酶通常存在于细菌的胞外，利用超声波破碎、离心、超滤等方法可以将淀粉酶从菌体的胞外获得。
离心法是最常用的方法，将菌液离心后，分离出淀粉酶液，可以去除不溶性的杂质。
3. 纯化淀粉酶：淀粉酶纯化的方法有许多种，如酒精沉淀法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等。
其中，离子交换层析法是常用的一种方法，先将淀粉酶溶液加到离子交换树脂中，随后用缓冲溶液洗脱离子交换树脂，分离出淀粉酶。
以上介绍了产淀粉酶菌株的分离与纯化方法，这些方法可以得到高产量和纯度的淀粉酶，为利用淀粉酶提供了重要的技术支持。
实验2土壤中产淀粉酶细菌的分离
实验二土壤中产淀粉酶细菌的分离一、实验目的从土壤中分离出产淀粉酶的细菌。
二、实验原理微生物的分离和纯化就是从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。
选择适合于待分离微生物的生长条件，如温度、营养、PH和O2等条件。
或加入特定底物、抑制剂淘汰一些不需要的微生物。
通过稀释涂布平板法培养后，挑取在固体培养基生长的单菌落纯培养。
平板分离法是微生物分离和纯化常用的方法之一，该方法操作简便。
三、实验器材与试剂材料与试剂：淀粉培养基、碘液、土样1g仪器：恒温培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、移液枪、培养皿、试管、三角瓶、量筒、玻璃涂棒、酒精灯、记号笔等四、实验步骤1.培养基与器皿的准备和灭菌（1）培养基的配制实验一已制备（2）无菌水的制备取250ml三角瓶中并加入玻璃珠和100ml蒸馏水加塞后用牛皮纸包扎，然后取5支试管均加入9ml蒸馏水，加塞后用牛皮纸包扎捆绑，将三角瓶和5支试管放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。
（3）器皿的准备将盒装移液枪枪头、培养皿用牛皮纸包扎，放入高温灭菌箱灭菌备用。
2.菌悬液的制备和梯度稀释（1）取1g土壤样品加入灭菌后100ml无菌水三角瓶中摇匀震荡约20min, 然后静置分层，上清即菌悬液。
（2）取5只加入9ml无菌水试管分别编号1—5，用移液枪从菌悬液中取1ml 上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作5个试管，得到10-3、10-4、10-5、10-6和10-7五个稀释度的菌悬液。
3．制备空白平板（1）将已灭菌淀粉培养基加热熔化稍冷却，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手无菌培养皿，左手拔出棉塞。
（2）右手拿锥形瓶，瓶口迅速通过火焰；用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中培养基倒入培养基，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀，冷却凝固，倒6皿。
4.涂布平板（1）将冷却的平板分三组，用记号笔在皿底分别标注10-5、10-6和10-7。
土壤中产淀粉酶微生物分离纯化的研究
土壤中产淀粉酶微生物分离纯化的研究土壤是微生物的自然栖息地，其中存在着大量的微生物群体。
其中，淀粉酶微生物是土壤中的一种重要群体。
淀粉酶微生物可以利用土壤中的淀粉为能源，将淀粉水解成葡萄糖等单糖，为土壤中的其他微生物提供了能量。
此外，淀粉酶微生物还能够分解淀粉质的残留物，促进土壤的有机质分解，有助于土壤肥力的提高。
因此，分离纯化土壤中的淀粉酶微生物对于了解土壤微生物群体的结构和功能，以及发掘土壤微生物资源具有重要意义。
本文将从土壤中分离淀粉酶微生物的方法、淀粉酶微生物的特性以及淀粉酶微生物的应用等方面进行探讨。
一、土壤中分离淀粉酶微生物的方法土壤中淀粉酶微生物的分离是一个相对复杂的过程。
一般来说，可以采用筛选法、培养法、分子生物学技术等方法。
筛选法是一种最常用的土壤淀粉酶微生物分离方法。
其原理是利用淀粉为唯一碳源，在含有淀粉的培养基上筛选出淀粉酶微生物。
具体操作步骤为：将土壤样品通过筛网筛选后，制备不同浓度的稀释液，分别接种到含有淀粉的培养基上，进行培养。
待出现淀粉水解圈后，将圈内菌落进行分离、筛选，最终获得淀粉酶微生物。
培养法是通过将土壤样品接种到含有淀粉的液体或固体培养基中，利用淀粉为唯一碳源，诱导淀粉酶微生物生长和繁殖。
培养法的优点是可以获得纯种菌株，但是其缺点是存在一定的选择性，不能完全反映土壤微生物群体的整体结构。
分子生物学技术是一种新型的土壤微生物分离方法。
其原理是通过对土壤样品中微生物的DNA序列进行分析，筛选出含有淀粉酶基因的微生物。
该方法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优点，但其操作难度较大，需要专业技术支持。
二、淀粉酶微生物的特性淀粉酶微生物是一类能够分解淀粉的微生物群体。
淀粉酶微生物广泛存在于土壤中，并具有以下特性：1.多样性。
淀粉酶微生物包括细菌、真菌、放线菌等多种微生物群体，具有较高的多样性。
2.分解效率高。
淀粉酶微生物能够高效地将淀粉水解为葡萄糖等单糖，其分解效率高于一般的微生物群体。
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案实验方案：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验目的：分离产淀粉酶的芽孢杆菌，用于后续淀粉酶相关研究。
实验步骤：1.样品采集：选择含有潜在产淀粉酶的土壤样品，如农田土壤或果园土壤。
2.稀释培养：将采集的土壤样品用无菌PBS缓冲溶液稀释，并进行均匀悬浮。
3.接种装置：将土壤悬浮液均匀涂布在含有淀粉的固体培养基上，使用毛细管或平面接种棒操作，确保样品均匀地接种在培养基上。
4.培养条件：将接种好的培养基培养皿在适宜的培养条件下培养。
适宜的培养条件包括温度、湿度和氧气供应等。
一般来说，菌株生长的适宜温度为30-37摄氏度，湿度为60-70%。
5.纯化分离：通过制备出来的细菌菌落将产酶菌株分离出来。
可以使用毛细管、骨牌、环针等工具，分别挑取单个菌落并将其转移到含有淀粉的培养基上。
6.传代培养：将分离出来的产酶菌株进行传代培养，以确保其菌落的特性稳定。
7.筛选鉴定：通过淀粉酶活性分析等方法，对分离出来的菌株进行筛选鉴定。
一般来说，可采用滴定法或I2-KI法测定淀粉酶活性。
根据颜色变化或者酶活性指标的变化，筛选出淀粉酶产量较高的菌株。
8.鉴定菌株：对产淀粉酶的菌株进行鉴定，确定其属于芽孢杆菌的种属。
可以采用传统的形态学和生理生化特性鉴定方法，如菌落形态观察、革兰染色、氧需气性、形状和运动情况等。
9.鉴定纯化：最后，对鉴定出来的菌株进行纯化培养，以获得纯种淀粉酶产生菌。
实验注意事项：1.采集样品时要避免采集过于含油的土壤，以免对实验造成干扰。
2.在操作过程中要做好防护，戴手套，避免污染样品。
3.在培养过程中注意严格无菌操作，以避免外源菌的污染。
4.在菌株的鉴定过程中，要仔细观察菌株的形态特征，并结合多种鉴定方法综合分析。
5.实验过程中要注意做好记录，包括实验步骤、结果、观察和记录等。
总结：通过上述实验方案，我们可以从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。
这有助于开展后续淀粉酶相关的研究，包括酶的生物化学性质、作用机制等。
土壤中含淀粉酶细菌的分离
土壤中含淀粉酶细菌的分离摘要本文研究了从土壤中分离含淀粉酶的细菌，并对细菌的生长进行了探究。
首先制备两组土壤稀释液，其稀释度从10-2 —10-6，其中一组经过高温灭菌。
然后，利用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离纯化该细菌于相应变好的无菌培养皿内，同时倾倒含有淀粉的琼脂培养基约3-5mm。
待平板冷凝后，倒置于恒温箱中培养。
实验发现不同菌悬液稀释度对细菌菌落的形成没有严格的比例关系。
但是，加热处理可显著提高菌悬液中淀粉酶活性细菌的比例。
最后经过微生物的分离，纯化及鉴定，选定透明圈较大的细菌菌落为淀粉酶活性较高的菌株。
[关键词]：土壤微生物；稀释液；菌种分离；高温灭菌；淀粉酶；前言土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此，土壤是微生物多样性的的重要场所，也是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化出许多有价值的微生物。
近几十年来，研究工作者对土壤微生物开展多方面的研究，取得了许多可喜的成就，并被广泛用于生产和生活中。
本研究是从土壤中筛选可产生淀粉酶细菌为目的，利用物理和化学方法探究稀释度对细菌菌落形成的影响，以及用不同的处理方式反映出高温加热对含有高活性淀粉酶细菌的比例产生的影响。
从实验研究的结果可以为工业化大规模生产含淀粉酶微生物及制备酶制剂等领域提供重要的帮助。
2、材料与方法2.1 材料称量纸，棉塞，搪瓷缸（1000ml），电炉2.1.1 培养基配制的材料与试剂土豆60克、葡萄糖6克、淀粉3克、琼脂粉6克2.1.2 玻璃器皿圆底培养皿（10个）、量筒（100ml）、移液管两支（1ml）、试管（10支）、大三角瓶（500ml）、小三角瓶（250ml）、玻璃珠（20粒）、大烧杯。
2.1.3样品实验室预先准备好土壤25克2.2 方法2.2.1 培养基制备（一）称量根据用量按比例向滤液中加葡萄糖6克，加淀粉3克，加琼脂粉6克（边加边搅拌）。
然后将滤液置于电炉上熔化，熔化过程中需不断搅拌，当滤液熔化完全后，补足所需水分，定容至300ml。
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化
土壤中产淀粉酶菌株的分离、鉴定与纯化土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同。
但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所需的C源、N源、无机盐、生长因子以及水等。
从混杂微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离纯化。
平板分离法普遍适用于微生物的分离与纯化，其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
稀释涂布法或平板法时常用的分离与纯化的方法，以淀粉作为惟一碳源的培养基培养未分离细菌，能产淀粉酶的细菌能生长，且菌落周围出现透明圈（淀粉不透明，被消化后变透明），则产淀粉酶微生物被分离出来。
本实验采用透明圈检验法检测培养物中是否有产淀粉酶微生物的生长。
二、分离及纯化1、材料试剂:营养琼脂、淀粉、土壤、碘液等器皿：移液管、培养皿、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、接种环等仪器：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱其他：报纸、纱布、棉花、面线绳2、方法2.1培养基与器皿的准备和灭菌（1）培养基的配制称量1.2克淀粉。
加少量水加热溶化，然后加入6.8克营养琼脂，加水至150毫升，煮沸后倒入250ml容量的三角瓶中，加棉塞后放入高温蒸汽灭菌锅内灭菌备用。
（2）无菌水的制备分别取9ml蒸馏水加入5支试管中，加塞后用报纸包扎捆绑，放入高压蒸汽灭菌锅灭菌备用。
取90ml蒸馏水加入250ml三角瓶中，同样的操作，灭菌备用。
（3）器皿的准备将刻度吸管用报纸包扎，培养皿装入专用灭菌杯分别放入高温灭菌箱灭菌备用。
2.2菌悬液的制备和梯度稀释取10g土壤样品加入90ml无菌水中震荡, 然后静置2分钟。
取六只试管编号1—6分别加入9ml无菌水，从菌悬液中取1ml 上清液加入1号管后震荡摇匀，然后再从1号管中取1ml加入2号管震荡摇匀，依次操作六个试管，得到10ˉ1—10ˉ6六个稀释度的菌悬液。
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土壤淀粉酶产生菌的分离纯化及相关性质测定摘要：为了了解土壤中微生物的种类和特征并从中分离出淀粉酶产生菌，对其进行纯化和培养，并测定其产生的淀粉酶的活性以及对其进行生理生化试验，了解其代谢特征，需要进行一系列的实验，并在此过程中掌握分离纯化微生物、微生物液体培养法、透明圈法测定淀粉酶活力以及生理生化试验的操作方法和原理。
主要实验过程如下：从土壤中筛选淀粉酶产生菌后进行复筛，接着进行种子培养，所得发酵液用于淀粉酶活力的测定以及生理生化反应。
关键词：土壤淀粉酶产生菌分离纯化发酵培养透明圈法生理生化试验正文：1、土壤淀粉酶产生菌的分离与纯化1.1 实验原理在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。
为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。
获得纯培养的方法称为微生物的纯种分离法，也即是从含有多种杂居在一起的微生物材料中，通过稀释分离、划线分离、单孢子分离等方法，使它们分离成为单个个体并在固定培养基的固定地方繁殖成为单个菌落，从单个菌落中挑选所需纯种。
不同微生物可用不同培养基和不同培养条件进行单菌分离获得纯种，纯种再经繁殖培养后，可用于进一步研究形态、生理等欲从含有多种微生物的样品中直接辨认出，并且取得某种所需微生物的个体进行纯培养，那是困难的。
由于微生物可以形成菌落，而每个单一菌落常常是由一种个体繁殖而成。
不同微生物的菌落是可以识别和加以鉴定的。
因此将样品中不同微生物个体在特定的培养基上培养出不同的单一菌落，再从选定的某一所需菌落中取样，移植到新的培养基中去，就可以达到分离纯种的目的。
这就是纯种分离法的原理。
在微生物的分离和纯种培养过程中，必须使用无菌操作技术。
所谓无菌操作，就是在分离、接种、移植等各个操作环节中，必须保证在操作过程中杜绝外界环境中的杂菌进入培养的容器。
淀粉是有葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的直链淀粉组成的。
按照水解方式的不同，主要的淀粉酶可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和异淀粉酶4大类。
产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母等。
利用淀粉遇碘变为蓝色的特性，将分离的微生物接种在含有淀粉的固体培养基表面进行培养，利用滴加碘液后菌落周围出现透明圈，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色，判断是否产生淀粉酶及初步判断淀粉酶活力的高低。
从微生物群体中经分离、生长，在平板上形成的肉眼可见的菌落，不一定是单个细胞生长繁殖而成的，有的可能来自2个或者多个细胞。
因此，纯培养的确定观察菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。
甚至有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
1.2 实验器材1.2.1 材料土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、淀粉培养基、PDA培养基、99ml 无菌水1瓶（带玻璃珠）、5支9ml无菌水/试管等。
1.2.2 用具无菌培养基、无菌吸管、无菌水、酒精灯、无菌涂布棒（又名扩散棒、三角棒）、接种环、生物洁净工作台、生化培养箱、人工智能培养箱、手动菌落计数器（SC6）、移液器、移液枪、试管、三角瓶、显微镜等。
1.3 实验过程1.3.1土壤稀释液的制备称取土壤，制备稀释度分别为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。
1.3.2 稀释平板法从土样中分离真菌先在无菌培养皿中加入稀释度为10-7的土壤稀释液0.2mL，再加入马铃薯培养基，充分混匀铺平并凝固后倒置于28~30℃恒温培养5~6d，培养完成后观察真菌菌落形态。
结果如图1所示，培养基上分布有多个菌落，根据颜色判断为有两种真菌，一种正面为青色，背面为肉色，有9个菌落，另一种正面为墨绿色，背面为黑色，有霉味，有3个菌落。
图1 稀释平板法分离真菌结果1.3.3 平板涂抹法分离土壤中的放线菌先在无菌培养皿中倒入适量淀粉培养基，铺成平板，凝固后，再加入稀释度为10-7的土壤稀释液0.2mL，用无菌三角玻棒在平板表面涂抹均匀，倒置于28~30℃条件下培养3~4d，观察放线菌菌落形态。
结果如图2所示，并没有分离得到单菌落，而只有菌苔，颜色为黄色，有泥腥味。
没有出现单菌落可能是操作出现差错，因为稀释度为10-7，并没有偏大，所以可能是操作的问题。
图2 平板涂抹法分离放线菌结果1.3.4 平板划线法分离土壤中的细菌先在无菌培养皿中倒入牛肉膏蛋白胨培养基，制成平板，再用分区划线法挑取稀释度为10-2的土壤稀释液一环在平板上划线。
划线完毕，盖上皿盖，倒置于28~30℃培养。
观察细菌菌落形态，结果如图3所示，有肉眼可见的单菌落，直径约为3mm，颜色为肉色，有臭味。
图3 平板划线法分离细菌结果1.3.5 用划线分离法对淀粉酶产生菌进行分离纯化1.3.5.1在分离出真菌的马铃薯培养基的平板上滴加碘液，如图4所示，可以看出仅有一个菌落的水解圈较大符合要求，挑取该菌落，在淀粉培养基上进行划线分离，倒置30℃培养。
结果如图5所示。
图4 滴加碘液后的马铃薯培养基图5 淀粉培养基上分离纯化得到的真菌1.3.5.2在分离出细菌的牛肉膏蛋白胨培养基上挑取单菌落，在淀粉培养基上进行划线分离，倒置30℃培养，结果如图6所示，有单菌落。
图6 淀粉培养基上分离纯化得到的细菌1.3.5.3 将淀粉培养基上分离纯化得到的单菌落接种到斜面培养基上，培养至成熟，待用。
1.4 结果与分析1.4.1由图1观察可得真菌的菌落特征，本实验中分离得到的为霉菌，有两种，一种正面为青色，背面为肉色，另一种正面为墨绿色，背面为黑色，有霉味，菌落较大且疏松，菌落比较干燥，用接种环挑取菌落时较难，说明与培养基结合牢固。
1.4.2 由图2观察可得放线菌的菌落特征，本实验中没有得到单菌落，为菌苔，比较干燥，颜色为黄色，菌落较小，分布紧密，带有泥腥味。
1.4.3由图3观察可得细菌的菌落特征，菌落小且突起，直径约为3mm，较湿，颜色为肉色，有臭味，用用接种环挑取单菌落时较容易，说明不与培养基结合。
1.4.4 由图4观察知有一个菌落的水解圈直径较大，为淀粉酶产生菌。
1.5 结论1.5.1 对土壤中微生物进行分离筛选，观察各种微生物的菌落形态，本次实验结果如表1-1所示。
表1-1 土壤中微生物菌落特征微生物类别霉菌放线菌细菌菌落特征含水状态干燥较干燥较湿外观形态大而疏松小而紧密小而突起菌落透明度不透明不透明稍透明菌落与培养基结合程度结合较牢固结合牢固不结合菌落颜色青色和墨绿色黄色肉色气味霉味泥腥味臭味1.5.2 在淀粉培养基上分离得到的单菌落，为淀粉酶产生菌，再接种到斜面上进行培养，作为后续实验的材料。
2、淀粉酶产生菌的发酵培养2.1 实验原理微生物发酵是生物工程的重要组成和基础。
它主要是利用微生物的特定性状，通过现代工程技术进行工业化生产有用物质的技术体系。
微生物发酵既是开发生物资源的关键技术，又是生物技术产业化的重要环节。
根据微生物发酵方式的不同，可以将发酵分为固态发酵和液态发酵。
固态发酵又称固体发酵，是一种传统的发酵方法，即将发酵的固体原料按一定的比例与一定量水分混合后进行灭菌，然后接种菌种。
液态发酵又称为液体发酵，将所用原料配成液体状态，接种菌种进行发酵。
液态发酵又可分为浅盘发酵和液体深层发酵。
液体深层发酵采用密闭的发酵罐，在罐中进行发酵。
液体发酵大致分为三大工序：种子培养，发酵，提取。
2.2 实验器材2.2.1 菌种：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，前期实验分离得到的菌种。
2.2.2 仪器：超净工作台、恒温培养箱、摇床、发酵罐、发酵尾气分析仪、移液器、接种环、酒精灯、记号笔等。
2.2.3 培养基：液体发酵培养基2.3 实验过程2.3.1 摇瓶发酵2.3.1.1 种子培养：取活化好的菌种由斜面培养基转接入盛有30mL种子培养基的250mL锥形瓶内，与转速180-220r/min旋转式摇床上30℃培养1-2天。
2.3.1.2 发酵：吸取培养好的种子液3mL，接入多个盛有30mL发酵培养基的的锥形瓶内，于180-220r/min恒温摇床上30℃培养2-3天。
2.3.1.3 提取：取发酵液20mL，平均分配到两个离心管中，12000r/min离心10min，分别收取上清液和菌体，分别保存在冰箱中。
2.3.2 全自动发酵罐的基本了解全班同学分为两批由老师介绍全自动发酵罐的基本构造和基本操作方法。
2.4 结果与分析本次实验得到的上清液为黄色，菌体为淡黄色。
保留，作为后续试验淀粉酶活性测定及微生物生理化反应的材料。
3、淀粉酶的活性测定3.1 实验原理淀粉酶包括几种催化特点不同的成员，其中α-淀粉酶随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶；β-淀粉酶每次从淀粉的非还原端切下一份子麦芽糖，又被称为糖化酶。
产淀粉酶的微生物在以可溶性淀粉为底物配置的固体培养基生长，其菌落周围的培养基会由白色变成灰色且透明，形成透明圈。
在一定浓度范围内，透明圈的直径d与淀粉酶活力的大小（对数值）成正比。
以已知浓度的淀粉酶为对照，制作透明圈与淀粉酶活力标准曲线。
从样品的透明圈直径大小可在标准曲线上求得其淀粉酶活性大小。
由于本方法是直接测定方法，而且灵敏度高，不需要特殊设备，故被广泛采用。
3.2 实验器材3.2.1 菌种：产淀粉酶微生物3.2.2 培养基：培养基Ⅱ：培养基Ⅰ加2g/L的可溶性淀粉和2g/L的琼脂，透明圈测定使用。
3.2.3 仪器和其他用具：摇床、恒温培养箱、纸片、移液枪、镊子、淀粉酶标准品、尺子、小试管、容量瓶、离心机。
3.3 实验过程3.3.1取取浓度为1mg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，5mg/mL，6mg/mL的淀粉标准溶液和样品，滴于纸片上，使用6个培养基，每副培养皿放置4张纸片，置于培养基的方式简单表示如下：1 2 3 4 5 6 1 x 5 x 6 x2 1 43 6 5 x 1 x 5 x 6置放完成之后，在37℃恒温培养箱中培养18-20h。
3.3.2 透明圈直径的测定培养完成后取出，在培养基上滴加碘液，一段时间后，测定透明圈直径（cm），结果如表3-1所示：表3-1 标准淀粉酶溶液及样品透明圈直径（cm）记录表1mg/mL 2.55 2.72mg/mL 2.75 33mg/mL 3 3.054mg/mL 3.2 3.35mg/mL 3.25 3.36mg/mL 3.25 3.32样品 3.1 3.1 2.75 3.35样品的透明圈直径第3组实验数据与前两组相差较大（分别为2.6cm和2.55cm），故舍去。
3.4 结果与分析3.4.1 标准曲线测得的透明圈直径取平均值，淀粉酶溶液浓度换算为酶活力，制得表3-2如下：表3-2 标准淀粉酶溶液数据处理结果表序号透明圈直径（cm）淀粉酶活力（U/g）淀粉酶活力对数值1 2.625 3700 3.5682 2.875 7400 3.8693 3.025 11100 4.0454 3.250 14800 4.1705 3.275 18500 4.2676 3.285 22200 4.346 根据数据处理结果作标准曲线，如图1所示图1 标准曲线3.4.2 样品酶活力计算实验测得样品的透明圈直径平均值为3.067cm，根据标准曲线所得线性方程y=0.916x-0.6487，计算得样品的淀粉酶活力对数值为4.056，从而得出样品的淀粉酶活力为11376.3U/g。