高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性
植物固氮菌的筛选和鉴定技术
植物固氮菌的筛选和鉴定技术植物固氮菌是一种能够将空气中的氮气转化为可供植物使用的氨的微生物。
它们是农业生产和生态环境中的重要成分，能够大幅度减少化肥的使用，提高作物产量，改善土壤环境。
因此，对植物固氮菌的筛选和鉴定技术的研究非常重要。
一、植物固氮菌的筛选植物固氮菌的筛选技术可以分为两类：直接筛选和间接筛选。
直接筛选是指根据植物中常见的固氮菌的特征(如罗德菌、艰难菌等)，利用分离富集技术，直接从土壤或根际中分离和筛选固氮菌。
这种方法简单易行，但它的筛选能力比较有限。
间接筛选则是以作物生长促进、氢气释放等作为固氮菌筛选的指标，通过对具备这些特征的细菌进行分离富集和筛选，如何同时兼顾作物生长和氮固氮的效果对筛选提出了更高的要求。
目前，常用的筛选技术包括荧光快速测量、Si膜过滤技术、PCR技术、微生物组培技术等。
荧光快速测量技术是一种常见的筛选方法。
通过荧光探针（如Acridine Orange, SYBR Green I）所发出的荧光信号，能够快速检测出生长在土壤和根际环境中的植物固氮菌，这些菌具有特有的荧光特征。
这种方法适用于样本量较少的情况下，但也存在着对设备要求高等问题。
Si膜过滤技术则是一种利用Si膜实现细菌分离、鉴定的技术。
通过先将样本在Si膜上培养，然后将培养基滴在Si膜中心，并让Si膜在培养基中浸透一定时间。
接下来，将Si膜转移到一盘培养基中进行进一步的培养，即可快速筛选出该环境下的植物固氮菌。
这种技术不仅能很好地保留样本的特征，还可以落实样本归档和保留的规范要求。
微生物组培技术则是一种基于微生物的分生技术，将固氮菌纯化分离后分别接种到富含养分的固定培养基中，经过培养后，细菌以生长点的形式展示出来。
这种技术的特点是检测灵敏度高，需要专门的设备和技术。
二、植物固氮菌的鉴定鉴定植物固氮菌的主要依据是形态学、生理学与分子生物学。
形态学鉴定主要包括形态学特征的摄影、显微镜观察和染色体及孢子的研究等。
固氮菌筛选
将筛选纯化出的菌株接入已灭菌的装有70~80mlAshby无氮液体培养基的三角烧瓶中，置于恒温摇床上，以120rpm的震荡速度在37℃下振荡培养2~3天，然后各取20ml培养的菌液分别注入已灭菌的带反口胶塞的250ml注射瓶，把反口胶塞塞紧，抽出10ml空气，再注入10ml高纯乙炔，封好瓶塞，置于摇床上26℃振荡培养1h，而后抽取600ul气体测定C2H2、C2H4的组成情况。以注射了高纯乙炔但未加菌液的注射瓶做对照。从气相色谱仪显示屏的C2H4 峰值判断有无C2H4的产生。按下列公式计算固氮酶活性：
4、固氮菌菌种的鉴定
形态学鉴定：将筛选出来的具有固氮能力的菌株在琼脂平板上培养，观察细菌菌落生长特性，主要是其菌落形状、大小、颜色、透明度、边缘特性、隆起程度等，并做详细记录。同时用接种环挑取单菌落上的细菌进行革兰氏染色和芽孢染色，镜检，记录结果。如有条件可用透射电镜观察细菌细胞大小、形状、鞭毛、有无孢囊、有无荚膜，初步确定科属。
三、自生固氮菌筛选方法
1、土壤样品的生物富集
分别取保存的土样各5g，放入250 mL锥形瓶中，加95mL无菌水和玻璃珠，150r/min，28℃振荡30 min，制备成母液。
2、菌株初筛
采用梯度稀释法，将母液稀释至10-7-10-1倍，并分别用微量移液枪取0.2 mL接种于Ashby无氮固体培养基平板中，涂布均匀，待接种液被培养基吸收后，倒置培养于对应温度的恒温恒湿培养箱中，28℃培养5d。当培养基上长出菌落时，对菌落进行观察和记录。将培养基上形成的单菌落分离出来在该培养基上连续转6代，今儿纯化筛选出固氮活性较高的固氮菌菌株。将该菌株接种到斜面培养基上，在28℃培养2d后4℃保藏备用。全部操作均在无菌条件下进行。
技术中心
各芽孢杆菌生物学特性及其防治汇总
各芽孢杆菌生物学特性及防治
一、枯草芽孢杆菌
1、生物学特性
革兰氏阳性菌，需氧菌。
产泡沫多。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，有长而又丰富的周生鞭毛
2、防治
在芽孢状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C温度下能存活20分钟；
二、解淀粉芽孢杆菌
1、生物学特性
革兰氏阳性杆菌，严格好氧可兼性厌氧。
平板：圆形、扁平、湿润有粘性的小菌落。
镜检：两端钝圆、长短不一、革兰氏阳性杆菌，有大于菌体的次末端芽孢。
2、防治
解淀粉芽孢杆菌在95%乙醇中72h、1000mg/L的84消毒液中18h、20g/L 戊二醛中60min仍能存活。
紫外线照射30min、121℃20min压力蒸汽灭菌、100℃煮沸5min均可将其完全杀灭。
三、地衣芽孢杆菌
1、生物学特性
革兰氏阳性杆菌，兼性厌氧菌。
菌落：菌落粗糙，不透明，粘着，扩展。
培养特性：在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h后菌落直径为3mm
2、防治
综上，121℃、30min灭菌处理可完全杀灭以上三种芽孢杆菌。
芽孢杆菌代谢产物研究进展(479)
芽孢杆菌代谢产物研究进展方晓翠（2009123479）摘要：本文通过高效液相色谱、硅胶柱、凝胶柱、硫酸提取等方法，对芽孢杆菌代谢产物进行了定性与定量分析，测定其中的主要成分极其有效成分的作用，探究芽孢杆菌在医药、饲料、生防等各个方面的利用价值和潜在的经济效益。
本文在专业知识的基础之上，基于对芽孢杆菌属真菌研究现状的宏观了解和把握，所做出的总结性的概述。
前言：对微生物研究利用的步伐从未停止过，微生物具繁殖快、体微小、好培养等突出的优点。
因此，人类竭尽全力让微生物为己所用，为人类谋福利。
对微生物极其代谢产物几十年研究中，科研人员发现了一些具有利用前景的微生物，芽孢杆菌便是其中的一种。
芽孢杆菌属(Bacillus) 是一类好氧或兼型厌氧、可以产生抗逆性内生芽孢的杆状细菌。
多数是腐生菌,分布在植物体的表面、土壤及水体中,由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学物质有强抗性的芽孢,因此能忍受多种不良环境［8］。
芽孢杆菌中存在很多特殊功能的菌株，可产生许多种活性物质，如多肽，环肽，氨基酸，蛋白酶及香豆素等。
［7］由于具有以上特性，目前芽孢杆菌属的各类细菌已被广泛应用于工业、农业、军事、畜牧业、医学等多个领域。
正文：1.芽孢杆菌在农业方面的研究情况对于芽孢杆菌的研究利用在农业上较全面也较广泛。
农业上，主要应用芽孢杆菌产生蛋白质伴孢晶体，其作用机理主要是产生几丁质酶使鳞翅目、鞘翅目等幼虫的肠道损坏致死，还可溶解真菌细胞壁防治病害的发生［20］。
从1905年从家蚕体内分离出苏云金芽胞杆菌( Bacillus thuringiensis)，到现在苏云金芽孢杆菌被制成多种生物农药。
多次实验证实，其制剂针对线虫在内的4个门、节肢动物门的9个目的生物有杀伤活性［9］。
其形成的蛋白晶体毒素（Insecticidal crystal poteins,ICPs）能够对鳞翅目（lepidoptera）、膜翅目（Ｈymenoptera）、双翅目（Ｄiptera）、鞘翅目（Ｃoleoptera）、食毛目（Ｍallophaga）、直翅目（Ｏrthoptera）等９个目５００多种害虫具有毒害作用[25]，现今已发现的具有杀虫活性的芽孢杆菌的种共有11个(见表1) [10]。
生物固氮菌的研究报告
生物固氮菌的研究报告摘要生物固氮菌是一类重要的微生物，它们具有固定大气中的氮气能力，将其转化成可供植物吸收利用的形式。
本文通过对生物固氮菌的研究进行了综述，包括其分类、生活特性、作用机制以及在农业领域的应用等方面。
通过对相关文献资料的调研，我们了解到生物固氮菌在土壤肥力改善、植物生长促进和环境保护方面具有巨大潜力。
然而，生物固氮菌的研究还存在一些挑战，如固氮效率的提高、固氮菌的筛选和应用技术的改进等。
因此，我们需要进一步加强对生物固氮菌的研究，以实现农业可持续发展和环境保护的目标。
引言固氮菌是一类具有重要生物学功能的微生物，其能力在农业和环境领域具有广泛应用。
固氮菌通过将空气中的氮气转化为可供植物吸收利用的氨或亚硝酸盐，并促进土壤肥力的提高。
因此，研究生物固氮菌对于农业的可持续发展和环境保护至关重要。
本文将综述生物固氮菌的分类、生活特性、作用机制以及在农业领域的应用，并探讨其研究现状以及未来的发展方向。
一、生物固氮菌的分类根据其菌落特征以及生理生化分类等多种方法，可以将生物固氮菌分为不同的类群。
最常见的分类方法是根据生物固氮菌在土壤中的生理生化特征将其分为两大类：自由生活固氮菌和共生固氮菌。
1. 自由生活固氮菌自由生活固氮菌是指在土壤中独立生活并具有固氮能力的菌群。
它们广泛存在于土壤、水体和植物内部等环境中，主要以自由态的形式存在。
自由生活固氮菌可以固氮产生胞外酶，通过酷热或低温、风化或静脉等多种因素的调节，以适应不同的生存环境。
代表性的自由生活固氮菌有蓝藻类和假单胞菌等。
2. 共生固氮菌共生固氮菌是指与植物形成共生关系，并在植物体内固氮的菌群。
它们通常以根瘤菌和蓝藻类等形式存在。
共生固氮菌通过与植物根系形成共生关系，进入植物根系内部，利用植物根系提供的环境来生活和繁殖，并固定大气中的氮气。
共生固氮菌与植物的共生关系对植物生长和发育具有重要影响，有助于植物生长和抗逆性的提高。
二、生物固氮菌的生活特性生物固氮菌在光合作用、代谢途径、生物生成物质等方面都具有独特的特性。
固氮芽孢杆菌的筛选及其生物学特性初探
４ ５
固氮 芽孢 杆 菌 的 筛 选及 其 生 物 学 特 性 初 探
王 磊
（ 安市环境 监察支 队， 六 安徽六安 ２７ ０ ） ３０ ０
摘
要： 采用无氮培养基富集、 热筛选固氮芽孢杆 菌。 筛选到 了２株 固氮 芽孢杆 菌 ， 加 编号为 Ｊ ４和 Ｊ ５ ｚ ｚ 。采 用 固氮
Ｗ ａ ｉ ｎｇ Ｌｅ
（ ｕ ａ ｎｉ ｎ ｅｔ ｕｅｖｓ ｎＤ ｔ ｈ ｅ ｔＬ ’ｎ２ ７ ０ Ｃ ｉａ Ｌ ’ｎＥ ｖｒ ｍ ｎａ Ｓ ｐｒｉｏ ｅ ｃｍ ｎ ，ｕ ａ ３ ００，ｈｎ ） ｏ ｌ ｉ ａ
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ａ ｘ ｅｌｎ ｔ ｉ ｓ ｄ ｉ ｈ ｃ ｏ ｉ ｅ ｔ ｉ ｒｐ ｏ ｕ ｔ ｎ ｓ ａ ｅ ｃ ｌｅ ｔ ｒ ｎ ｕ ｅ ｎ ｔ ｅ ｍｉ ｒｂ ａ ｆｒ ｌ ｅ ｒ ｄ ｃ ｉ ． ｎ ｓａ ｌ ｉｚ ｏ Ｋｅ ｒ ｓ Ｂ ｏｏ ｉａ ｉ ｇ ｎ ｆ ａｉｎ；Ｂ ｃｌ ｓ Ｓ ｒ ｉ ｅ ｅ ｔ ｎ；Ｍｉｒ ｂ ａ ｅｔｌ ｅ ｙ ｗｏ ｄ ： ｉ ｌｇｃ ｌｎｔ ｅ ｘ ｔｏ ｏ ｒ ｉ ａ ｉ ｕ ； ｔ ｎ ｓ ｌｃ ｉ ｌ ａ ｏ ｃ ｉ ｆｒ ｉ ｒ ｏ ｌ ｉｚ
固氮菌筛选及鉴定
固氮菌筛选及鉴定实验原理农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。
将用表土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。
在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。
用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。
目的要求1．初步学会从土壤中分离自生固氮菌的方法。
2．初步学会制作临时涂片的方法。
材料用具农田的表层土壤(土壤溶液的pH不低于6.5)。
无菌研钵，无菌玻璃棒，接种环，天平，存放有载玻片的酒精缸，盖玻片，显微镜，酒精灯，火柴，镊子，恒温箱，量筒，玻璃铅笔。
灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿，结晶紫染液，无菌水。
方法步骤一、接种1．接种前，将灭过菌的、盛有无氮培养基的培养皿，放在37℃的恒温箱中一两天。
随后，选取培养基上没有生长任何微生物的培养皿供实验用。
2．取10g土壤，放在无菌研钵中，注入5mL无菌水，并用无菌玻璃棒搅拌均匀，备用。
3．将接种环放在酒精灯的火焰上灭菌。
略微打开培养皿盖，将接种环放在培养基边缘处冷却。
然后，用接种环蘸取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上，共点接15～20处(注意：接种时手和衣袖不要碰到火焰，以免烧伤)。
4．接种后，轻轻地盖上培养皿盖，将培养皿放在实验桌上，并在顶盖上写明实验内容、接种人的姓名和接种日期。
二、培养将接过种的培养皿放入恒温箱内，在28～30℃的温度下培养3～4d。
三、观察3～4d后，取出培养皿，仔细观察培养基上稀泥浆周围长出的培养物——黏液。
黏液初为无色透明，以后为乳白色，最后变成褐色，表明含有自生固氮菌。
四、镜检1．制作临时涂片(1)用镊子从存放载玻片的酒精缸中夹取一片载玻片，将载玻片放在酒精灯火焰的上方缓缓烘烤，以便除去上面的酒精。
将载玻片放在实验桌上，待载玻片冷却后，在载玻片的中央滴一滴无菌水。
(2)在火焰旁，按照接种的要求，用灭过菌的接种环从培养基上挑取少许黏液，将黏液涂在载玻片上的水滴中，加1滴结晶紫染液，混合均匀，染色1min。
(3)另取一片载玻片作推片。
芽孢杆菌的系统进化及其属分类学特征
芽孢杆菌的系统进化及其属分类学特征刘国红1，2, 刘波1*, 林乃铨2, 林营志1（1福建省农业科学院农业生物资源所福州350003；2福建农林大学生防所福州350002）(刘国红：liuguohong624@; 刘波：liubofaas@)芽孢杆菌Bacillus，一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，好氧或兼性厌氧生活。
1872年Cohn建立了第一个细菌分类系统，根据细菌的形态特征命名了芽孢杆菌属(Bacillus)。
早期的芽孢杆菌分类主要是根据好氧性和产芽孢，所以很多生理生化和遗传学特征迥异的菌归入到了这个属。
1981年Gorden记载了芽孢杆菌属的分类状况，尽管此分类体系的依据主要是表观特征，但为芽孢杆菌属的现代分类体系提供了良好的基础。
现在的分类研究大多采用多相分类法，即将形态、生理生化、化学(DNA碱基GC分析、脂肪酸类型)、分子(DNA同源性分析，16S rRNA 测序)等方法相结合，根据所得数据进行综合分析，得出相对比较精确的分类结果。
2004版的《伯杰氏系统细菌学手册》对原核生物的归群和分类系统完全按照这些微生物的16S rRNA系统发育树进行编的。
随着分类研究方法的发展，尤其是多相分类法的应用，芽孢杆菌属的分类发生了很大的变化，有很多种从芽孢杆菌属中分化出来另建新属。
本文主要以《伯杰氏系统细菌学手册》第二版为依据，阐述芽孢杆菌属与其近缘属的进化，及其近缘属分化出的原由并讲述了其模式菌株的主要特征。
根据产芽孢与否、16S rRNA等的特征，芽孢杆菌分化出22个属，其中位于芽孢杆菌科的属有15个，位于非芽孢杆菌科的属有7个。
此外还有13个只是在命名书写上和芽孢杆菌Bacillus 相似。
具体如下：位于芽孢杆菌科的有Amphibacillus, Anoxybacillus, Filobacillus, Geobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Jeotgalibacillus, Lentibacillus, Marinibacillus, Oceanobacillus, Paraliobacillus, Salibacillus, Ureibacillus, Virgibacillus。
第三章芽孢杆菌生物学特性
第三章芽孢杆菌生物学特性第一节芽孢杆菌形态特点一、概述芽孢杆菌属于细菌。
从细菌的形态特点上看，有三种常见形状，即球状、杆状和螺旋状。
别离称为球菌、杆菌和螺旋菌；杆菌最多，球菌次之，螺旋状细菌最少。
球菌（coccus,复数为cocci），球状的细菌；据细胞的割裂面和子细胞分离与否有不同的排列状态，包括了单球菌（尿素微球菌）、双球菌（肺炎双球菌）、链球菌（酿脓链球菌、溶血链球菌）、四联球菌（玫瑰色微球菌、四联微球菌）、八叠球菌（藤黄八叠球菌）、葡萄球菌（金黄色葡萄球菌）。
螺旋状细菌（有人称为螺菌，spirillum,复数为spirilla）；螺旋状的细菌包括了弧菌（vibrio），螺旋不到一周，菌体呈弧形或逗号状，霍乱弧菌；螺菌，螺旋1-6周，外形坚挺的螺旋状细菌，红螺菌；螺旋体(spirochaete)，螺旋6周以上，由原生质柱、轴丝、外鞘组成，柔软易曲的螺旋状菌体；钩端螺旋体，梅毒密螺旋体。
杆菌（bacillus,复数为bacilli）；杆状的细菌，形态多样，包括了短杆状，短杆菌或球杆菌（甲烷短杆菌属）；长杆或棒杆状，长宽不同较大（枯草杆菌、北京棒杆菌、白喉棒杆菌）；梭状，两头稍尖，（梭菌属：鼠疫巴斯德氏菌）；分支杆状，有分支（结核分支杆菌）；平截杆状：两头平截（炭疽芽孢杆菌）。
特殊形状的细菌，菌体分叉，双歧杆菌；菌体结尾有柄，柄杆菌；菌体有附器，臂微菌。
细菌大小一样用显微测微尺测量，单位为微米（μm）1μm＝10-3mm＝10-6m。
病毒多用纳米（nm）为单位，1μm＝103nm。
细菌的大小不一，球菌直径μm，杆菌1-5×μm，螺旋菌大小不同较大。
大肠杆菌平均长2μm，直径μm，150个大肠杆菌细胞头尾相接等于3mm长的一粒芝麻；120个大肠杆菌捆在一路才有一根头发粗细（人发平均直径60μm），109个大肠杆菌才有1mg重。
尽管芽孢杆菌形态简单，细胞大小不同也不专门大，但是，芽孢杆菌的形态特点和细胞大小是分类学的重要特点，是芽孢杆菌分类单元的实物载体，研究芽孢杆菌生物学必需描述的内容。
巨菌草一株内生固氮菌的分子鉴定及生物学特性
巨菌草一株内生固氮菌的分子鉴定及生物学特性作者：叶文雨谢序泽杨林青邱学鸿牛晓庆胡红莉余文英鲁国东来源：《热带农业科学》2018年第12期摘要菌草（JUNCAO）是可作为栽培食用菌、药用菌的草本植物。
内生固氮菌具有生物固氮的功能，可以促进植物生长，提高植物对病原菌的拮抗作用。
采用无氮培养基、乙炔还原法等方法从巨菌草根中分离纯化到1株具有较强固氮酶活性的菌株，固氮酶活性值为270.20 nmolC2H4/（mL·h）。
通过16S rDNA序列分析，进一步确定该菌株属于变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）。
内生固氮菌株fjg102对稻瘟病菌Guy11和Ku70的抑菌率分别为40.25%和44.30%，具有一定的抑制病原菌的作用。
菌株fjg102革兰氏染色阳性，具有溶磷作用、触酶反应为阳性、明胶液化为阳性等生理生化特性。
盆栽试验结果表明，接种fjg102菌株后对大麦有明显的促生作用。
其中叶长增加37.26%，根长增长9.40%，根重增加66.16%，鲜重增加96.40%，干重增加80%。
可见，该内生固氮菌株具有生物固氮和促生的效果，可进一步研究开发成为微生物肥料生产菌种。
植物的生长需要各种营养元素，氮是生长发育必须的大量营养元素之一。
空气中的氮必须通过固氮微生物的转化植物才能利用[1-2]。
植物内生固氮菌（Endophytic diazotroph）是指那些定殖在健康植物体内，与宿主植物进行联合固氮的一类微生物[3-4]。
发掘植物内生固氮菌资源遗传多样性已成为非豆科作物高效利用生物固氮战略的主攻方向之一。
内生固氮菌可以促进植物生长、抑制植物病害、提高植物产量、降低化肥使用量，减少水土污染、保持农业可持续发展、改善生态环境[15]。
内生固氮菌有利于营养供应和微环境适宜的生态位，避免了化合态氮的抑制及土著微生物的竞争，进而促进作物的生长及产量的提高[6-7]。
野生稻内生菌根瘤菌（Rhizo-bium）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）等对水稻纹枯病有一定的抑制作用[8]，芽孢杆菌（Bacillus）对赤霉病等病害可产生良好的防治效果[9]。
固氮类芽孢杆菌1-33及其应用[发明专利]
![固氮类芽孢杆菌1-33及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6b20bec04b73f242326c5f40.png)
专利名称：固氮类芽孢杆菌1-33及其应用专利类型：发明专利
发明人：陈三凤,王莉瑛,陈曦
申请号：CN201110323796.0
申请日：20111021
公开号：CN102352331A
公开日：
20120215
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一株具有固氮能力的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)菌株1-33，其保藏编号为CGMCC No.4964。
该菌具有固氮酶结构基因nifH，乙炔还原法测定其固氮酶活为
565.94nmolCH/(mg protein h)。
本发明提供的固氮类芽孢杆菌菌株1-33对多种植物病原菌有明显的抑制作用，将本发明的菌株1-33制成固氮微生物菌剂或生物有机肥可对植物种子的萌发生长产生明显的促进作用，可在农业生产中推广使用，有效降低尿素使用量。
申请人：中国农业大学
地址：100193 北京市海淀区圆明园西路2号
国籍：CN
代理机构：北京路浩知识产权代理有限公司
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固氮菌、解磷菌的分离筛选
精品固氮菌、解磷菌的分离筛选一、目的要求:1、掌握选择培养基的筛选原理。
2、掌握固氮菌、解磷菌的分离方法。
3、学习平板划线分离法。
二、实验原理：选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理化学抗性而设计的培养基，利用这种培养基可以将所需的微生物从混杂的微生物中分离出来。
固氮菌可以利用空气中的氮作为氮源进行自身代谢，根据这一原理可以利用无氮培养基将固氮菌从混合菌中分离出来。
解磷菌可以在含有难溶性磷酸盐或有机磷的固体培养基产生溶磷圈，根据这一特性可以分离出解磷菌。
同样，可以根据解钾菌的生理特性选择合适的培养基将其分离出来。
在本实验中，分离固氮菌我们采用阿须贝氏( Ashby ) 培养基，分离解磷菌采用无机磷培养基。
选择培养基的配方如下Ashby 培养基：磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2 g硫酸镁(MgS04 7H2O) 0.2 g氯化钠(NaCI) 0.2 g碳酸钙(CaC03) 5.0 g甘露醇(C6H14O6) 10.0 g硫酸钙(CaSO4 2H2O) 0.1 g精品18.0 g1000 mL6.8 〜7.0 10.0 g 0.5 g 0.3 g 0.3 g 0.3 g 0.03 g0.03 g10 g 18 g 1000 ml无机磷培养基、无菌水、土壤样品(自带) 2、 仪器及其它用具：培养皿、玻璃棒、烧杯、量筒、天平、高压蒸汽灭菌锅、 生化培养箱、超净工作台、接种环、酒精灯、 PH 试纸等。
四、方法步骤 :培养基 的配制1、根据要求，配置好三种培养基，115 C 条件下高压灭菌25min琼脂蒸馏水 pH 无机磷培养基：葡萄糖(NH ?)?SO?NaClKClMgSO ??7H ?OFeSO??7H ?OMnSO ?? 4H?O Ca?(PO?)?琼脂蒸馏水三、 实验材料 : 1、 试剂及样品： Ashby 培养基、精品2、将灭菌后的培养基在超净工作台倒平板，备用。
样品处理3、在离心管中，将自带土壤样品按5g 土样\10ml无菌水的比例溶解，土壤样品要充分溶解，使土壤中的微生物全部溶解在无菌水中。
固氮菌菌剂的筛选和鉴定方法研究
固氮菌菌剂的筛选和鉴定方法研究固氮菌是一类能够将大气中的氮气转化为可利用形式的氮化合物的微生物。
固氮菌在农业生产中具有重要的作用，能够促进植物生长、提高产量、减少化肥使用量、改善土壤质量等。
而固氮菌菌剂作为一种生物肥料广泛应用于农业领域。
然而，在开发和应用固氮菌菌剂的过程中，如何筛选有效菌株、运用可靠的鉴定方法依然是一个挑战。
本文将对固氮菌菌剂的筛选和鉴定方法进行研究。
一、固氮菌菌株的筛选方法1. 土壤采样及分离固氮菌通常存在于土壤中，因此，首先要对不同生态环境中的土壤进行采样。
采样点的选择应该覆盖到农田、林地等不同土壤类型，并且要避免污染源的干扰，以保证采样质量。
采样时要注意避免高温、阳光直射等影响固氮菌活性的因素。
采样回来后，需要将土壤样品进行稀释并在适宜培养基上进行分离。
常用的培养基有湿润的富氧培养基、富营养的富氧培养基和缺氧培养基等。
分离后的单菌落需要进行纯化，并保存在液氮中以备后续研究使用。
2. 固氮活性的初步筛选固氮菌的固氮活性是其最重要的特征之一，因此，筛选过程中需要对菌株的固氮活性进行初步评估。
常用的初筛方法有亚硝酸盐还原试验、酰胺酶检测以及利用净化的空气中含有不同浓度的15N氮气等。
亚硝酸盐还原试验是一种常用的固氮活性评估方法，通过观察固氮菌在含有亚硝酸盐的培养基上的颜色变化来判断其活性。
酰胺酶检测法则是通过检测固氮菌产生的酰胺酶的活性来评估固氮菌的能力。
15N标记法则是通过在含15N氮气中培养固氮菌，然后测定培养基中15N的含量来判断固氮活性。
3. 生理生化特征的分析除了固氮活性外，固氮菌的其他生理生化特征也是筛选的重要指标。
例如，耐盐性、耐酸碱性、温度适应性等都可以通过一系列培养实验以及相应的生化特征检测方法进行评估。
这些特征能够帮助筛选出适应不同环境的固氮菌菌株。
二、固氮菌菌剂的鉴定方法1. DNA指纹图谱分析DNA指纹图谱分析是一种常用的固氮菌菌剂鉴定方法。
通过扩增固氮菌DNA 片段，并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后用DNA染色剂染色观察DNA迁移的条带，生成固氮菌的DNA指纹图谱。
植物固氮菌菌种筛选及其应用
植物固氮菌菌种筛选及其应用植物固氮菌是一种可以固定大气氮的细菌，这种细菌可以和许多植物建立共生关系，为植物提供固氮服务，同时也可以促进植物的生长和免疫系统的功能。
因此，植物固氮菌的选育和应用具有广泛的应用前景。
一、植物固氮菌的筛选为了从细菌中选出能够固氮并与植物形成共生关系的菌株，必须进行严格的筛选。
目前，常用的筛选方法包括以下几种：1、土壤样品筛选法：这种方法适用于从自然环境中筛选具有固氮能力的细菌。
首先从土壤中取样，然后通过培养来寻找具有固氮能力的细菌。
2、植物根系筛选法：这种方法适用于从植物根系中筛选具有固氮能力的细菌。
首先从植物根系中取样，然后通过培养来寻找具有固氮能力的细菌。
3、分子筛选法：这种方法适用于从分子水平上筛选具有固氮基因的细菌。
通过分子生物学技术，可以检测出具有固氮基因的菌株。
通过以上的筛选方法，可以获得具有固氮能力的细菌。
但是，在进行实际应用之前，还需要对这些细菌进行进一步的鉴定和优化。
二、植物固氮菌的应用植物固氮菌具有广泛的应用前景。
以下是植物固氮菌的几个常见的应用领域：1、农业领域：植物固氮菌可以与许多农作物建立共生关系，为作物提供固氮服务。
在农业生产中广泛应用的菌种包括大豆根瘤菌、豌豆根瘤菌等。
2、生态修复领域：植物固氮菌可以帮助植物生长，并提高植物的抗逆能力，从而促进生态修复。
例如，在荒漠化地区种植沙生植物，可以通过与固氮菌的共生来提高沙生植物的生长速度和适应性。
3、生物肥料领域：植物固氮菌可以作为纯菌肥料，用于改良土壤和提高作物产量。
这种肥料可以减少人工施肥的使用，从而减少土地污染和环境压力。
此外，植物固氮菌还被广泛应用于生态保育、饲料添加剂等领域。
三、植物固氮菌的未来展望未来，植物固氮菌的研究方向将主要包括以下几个方面：1、新菌种的发现和筛选。
为了更好地适应各种环境和作物，需要不断地发现和筛选具有特殊性能的新菌株。
2、生物技术手段的应用。
近年来，生物技术手段的日益完善，为植物固氮菌的研究提供了新的思路和方法。
一株高效促生菌株的分离筛选与发酵
山东农业大学学报(自然科学版),2022,53(6):825-831VOL.53NO.62022 Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.002一株高效促生菌株的分离筛选与发酵条件初探杜洪波,巩杰,高婷,李传荣*山东农业大学林学院,山东泰安271018摘要:为筛选能有效促进植物生长的促生细菌，从山东省泰安市泰山山脉常年生长植株根际土壤中分离获得一株芽孢杆菌TG-5。
通过形态学特征和16S rRNA分析，将其鉴定为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。
采用NBRIP 培养基对溶磷能力进行测定，结果表明：苏云金芽孢杆菌TG-5对磷酸钙培养基溶磷效果较好，与对照相比，该菌株溶磷效率是其他菌株3倍以上，最高达10.7倍以上。
通过对该菌株固体发酵条件初探，发现发酵培养基主要成分玉米粉和大豆粉的最佳配比为2:3、碳氮源分别为玉米粉和大豆粉时生物量最大。
上述试验证明苏云金芽孢杆菌TG-5具有较好的促生应用潜力，可进一步扩大培养。
关键词:土壤微生物;苏云金芽孢杆菌;分离;发酵条件中图法分类号:S154.34文献标识码:A文章编号:1000-2324(2022)06-0825-07 Isolation and Screening of a High-efficiency Growth-promotingStrain and Preliminary Exploration for Fermentation Conditions DU Hong-bo,GONG Jie,GAO Ting,LI Chuan-rong*College of Forestry/Shandong Agricultural University,Tai’an271018,ChinaAbstract:In order to screen the growth-promoting bacteria that can effectively promote plant growth,a Bacillus TG-5was isolated from the rhizosphere soil of perennial plants in Taishan Mountains,Tai'an City,Shandong Province.It was identified as Bacillus thuringiensis by morphological features and16SrRNA analysis.The phosphorus-dissolving ability of NBRIP medium was measured.The results showed that B.thuringiensis TG-5had better phosphorus-dissolving effect on calcium phosphate medium.10.7times or more.Through preliminary exploration of the solid fermentation conditions of this strain,it was found that the optimum ratio of the main components of the fermentation medium,corn meal and soybean meal,was2:3, and the biomass was the largest when the carbon and nitrogen sources were corn meal and soybean meal,respectively.The above experiments proved that B.thuringiensis TG-5has good growth-promoting application potential and can be further expanded.Keywords:Soil microbe;Bacillus thuringiensis;isolation;fermentation condition微生物群落的多样性、相对丰度和活性在土壤有机质分解、养分循环、系统稳定性和抗干扰能力中起着核心作用[1-5]。
以碳增氮高效生物固氮回路设计与系统优化
以碳增氮高效生物固氮回路设计与系统优化以碳增氮高效生物固氮回路设计与系统优化是一个复杂且重要的研究课题。
在自然界中，生物固氮是一种重要的氮素循环过程，它能够将空气中的氮气转化为植物可利用的氮素。
然而，传统的生物固氮方法往往效率低下，不能满足现代农业和工业的需求。
因此，研究和开发新的生物固氮技术成为了当前的研究热点。
以碳增氮高效生物固氮回路设计与系统优化的主要目标是提高生物固氮的效率和产量。
这一目标的实现需要综合考虑多种因素，包括碳源的利用、氮源的转化、微生物的生长和繁殖、反应器的设计和操作等。
通过研究和优化这些因素，可以有效地提高生物固氮的效率和产量，为现代农业和工业提供更加可持续和环保的氮素来源。
为了实现这一目标，需要采取一系列的研究方法和技术手段。
首先，需要对生物固氮的原理和机制进行深入的研究，了解微生物在固氮过程中的生物学特性和代谢机制。
其次，需要设计和构建高效的生物固氮反应器，通过优化反应器的结构和操作参数，提高反应器的稳定性和效率。
此外，还需要开发高效的碳源利用技术，为微生物提供充足的碳源和能量来源。
最后，需要采用系统优化的方法，对生物固氮过程进行全面的分析和优化，提高整个系统的效率和产量。
以碳增氮高效生物固氮回路设计与系统优化的研究具有重要的实际意义和应用价值。
首先，它能够为现代农业提供更加可持续和环保的氮素来源，减少化肥的使用和环境污染。
其次，它能够为工业生产提供高质量的氮素产品，促进工业的发展和进步。
此外，这一研究还能够推动相关学科的发展和进步，促进交叉学科的融合和创新。
生物固氮是指将空气中的氮气转化为可被植物利用的形式的过程，是生态系统内氮循环的关键环节。
在自然界中，固氮主要通过大气中闪电和微生物两种途径进行。
微生物固氮是一种重要的氮源，可以为植物提供大量的氮元素，从而促进植物生长和生产。
然而，固氮过程中存在着一定的局限性，如效率低、能源消耗大等问题。
因此，设计和优化高效生物固氮回路成为了当前氮资源利用的热门研究领域。
芽孢杆菌的筛选1
实验材料和用具
• 样品
– 含有芽孢杆菌的培养液（1g养鸡场土壤+99ml无菌水）
• 培养基及试剂
– 普通肉汤培养基：
• 配方：蛋白胨20.0g，牛肉膏5.0g，Nacl 5.0g，自来水1000ml， PH 7.2~7.4 • 用法：称取上述用品30.0g，加热溶解于1000ml自来水，并不断 搅拌，煮沸1min，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min，备用。
• 倾注分离：
将培养液再经一次热 处理后，可进行适当稀释， 取一吸管以无菌操作法分 别吸取10ˉ4、10ˉ5、10ˉ6 土壤稀释液1ml，加在空 的无菌培养皿中。将淀粉 琼脂培养基，溴钾酚紫培 养基还有酪素培养基融化 冷却至50℃倾入各皿，立 即摇匀，凝固后进行涂布 平板，倒置培养24~48h。
分离淀粉酶菌株时， 可取碘液加在淀粉平 板上的菌落周围，观 察形成透明圈的情况， 未产生淀粉酶的是蓝 色，有淀粉酶产生的 无色。分离产酸菌株 时，可通过观察溴钾 酚紫培养基的颜色变 化。
– 淀粉琼脂培养基
• 配方：可溶性淀粉20.0g，KNO3 1.0g，NaCl 0.5g， K2HPO4.3H2O 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，琼脂15~20g，自来水1000ml • 用法：先用少量冷水把可溶性淀粉调成糊状，用文火加热，然后 再加水及其他药品，待各成分溶解后再补水至1000ml
– 酪素培养基：
• 配方:酪素20g、氨水 40ml、自来水1000ml • 用法：取酪素20g溶于 水中，（加氨水以助溶 解）
– 溴钾酚紫培养基：
• 乳糖5g、蛋白胨5g、酵 母膏3g、琼脂15~20g、 0.5%溴钾酚紫溶液 10ml、自来水1000ml • 用法：称取琼脂加热溶 解后，再加入以称取好 的乳糖、蛋白胨、酵母 膏和溴钾酚紫充分溶解， 混匀