土壤中芽孢杆菌的分离及初步鉴定

司。
的形状、着生位置。
显现。若出现透明圈， 即为淀粉
１．２ 土样的采集 与处理 从不 １．５ 生理生化试验 糖发酵试 水 解 试 验 阳 性 反 应 ， 否 则 为 阴
同地点采集土壤 ２０ 份， 各称取 验 （ 主 要 有 葡 萄 糖 ， 麦 芽 糖 ， 鼠 性。
１ ｇ 放 入 含 有 ５ ｍＬ 灭 菌 水 的 试 李 糖 ， 蔗 糖 ， 乳 糖 ） ： 用 无 菌 接 种
的土样中分离出了 ４ 种枯草芽
孢杆菌， 但其具体属于哪个菌种
还有待进一步鉴定。通过生理生
化 试 验 、药 物 敏 感 试 验 等 ， 可 得
到这 ４ 种芽孢杆菌的部分生化
特点及对几种药物的敏感程度，
为今后的进一步试验提供了参
考。
来自土壤中的芽孢杆菌， 其
中一些可作为益生菌应用于工
农业生产。用作饲料添加剂不论
表１
生理生化试验结果
＋ ／－
１号 菌
葡萄糖 （ 产酸 ／ 产气）
＋ ／－
麦芽糖－ ／ － （ 产酸 ／ 产气）
－ ／－
鼠李糖 （ 产酸／产气）
－ ／－
蔗糖 （ 产酸／产气）
－ ／－
乳糖 （ 产酸／产气）
－ ／－
ＶＰ 试验
＋
淀粉水解试验 ＋
吲哚试验
＋
２号 菌 ＋ ／－
＋ ／－
－ ／－
－ ／－
－ ／－ ＋ ＋ ＋
直到长出单个菌落。再分别挑取 单个菌落划线接种于生孢培养 基， 于 ３７ ℃培养箱中培养， 直到
振荡试管， 以使空气中的氧溶 入， 置 ３７ ℃恒 温 箱 中 保 温 １５～ ３０ ｍｉｎ 后， 观察结果。若培养液
胨 ， ０．５％牛 肉 膏 ， ０．２％酵 母 粉 ， 长出单个菌落。
呈 红 色 ， 即 为 ＶＰ 试 验 阳 性 反
摘要： 芽孢杆菌是一种耐高温、高压及低 ｐＨ 值的有益微生物。本试验从土壤中分离出 ４ 种 细菌， 经初步鉴定， 判定该 ４ 种细菌均为芽孢杆菌属成员。通过进一步试验， 了解到其部分生理生 化特点及对几种药物的敏感程度， 为芽孢杆菌在工农业生产中的应用及在基因工程中的研究与 应用提供了一定的依据。
关键词： 芽孢杆菌； 土壤； 分离； 鉴定
吲哚试验： 将细菌分别接
管中， １００ ℃沸水浴 １０ ｍｉｎ， 然后 环 挑 取 单 个 菌 落 ， 分 别 接 种 于 种 于 装 有 蛋 白 胨 水 培 养 液 的 试
编 吸取上清 １００ μＬ 以无菌涂菌棒 几 种 糖 发 酵 管 中 ， 倒 置 糖 发 酵 管 中 ， 置 ３７ ℃恒 温 箱 中 培 养
１ 号菌菌落大小为 ５ ｍｍ 左 右， 菌落呈圆形， 边缘不整齐， 灰 白色， 不透明， 表面有皱褶。菌体 经革兰氏染色， 呈蓝紫色， 为革 兰氏阳性细菌。菌体为杆状， 多 散在， 其中一些菌体连接成链 状。经过生孢培养基培养后， 可 见芽孢呈椭圆状或柱状， 位于菌 体中部。
２ 号菌菌落大小为 ３ ｍｍ 左 右， 菌落也为圆形， 边缘整齐， 乳 白色， 不透明， 表面光滑。菌落边 缘呈现透明液滴， 似菌落可游 走。菌体经革兰氏染色， 呈蓝紫 色， 为革兰氏阳性细菌。菌体形 状同 １ 号菌， 菌体长度略小于 １ 号菌。经生孢培养后可见芽孢位 于菌体一端。
产气。
至乙醚中， 静置片刻后乙醚层浮
２４
四川畜牧兽医·２００８·０２ 期·总第 ２０８ 期
于培养液的上面， 此时沿管壁缓 慢加入 ５～１０ 滴吲哚试剂 （ 加入 吲哚试剂后切勿摇动试管， 以防 破坏乙醚层影响结果） ， 观察结 果。如有吲哚存在， 乙醚层呈现 玫瑰红色， 即为吲哚试验阳性反 应， 否则为阴性。 １．６ 抗 药 性 试 验 采 用 药 敏 片法。主要使用的药敏片有： 氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉 素、环丙沙星、链霉素、四环 素 ， 复 方 新 诺 明 。吸 取 ８０ μＬ 菌 液 滴 于 ＬＢ 平 板 培 养 基 中 ， 用 无菌涂菌棒将其涂布均匀， 用 镊子无菌取出药敏片， 贴于平 板上， 并略微用力压按药敏片， 防止其脱落。待菌液完全晾干 后 ， 倒 置 平 板 ， 于 ３７ ℃培 养 箱 中 培 养 １２ ｈ。 ２ 结果 ２．１ 形 态 学 观 察 划 线 培 养 大 约 ６ ｈ 后 ， ２０ 个 培 养 基 上 可 见单个菌落生长。发现有 ４ 种 形态不一致的菌落， 分别记为 １～４ 号。
３号 菌 ＋ ／－
＋ ／－
－ ／－
－ ／－
－ ／－ ＋ ＋ －
４号 菌 ＋ ／－
－ ／－
－ ／－
－ ／－
－ ／－ ＋ ＋ －
２．３ 抗 药 性 试 验 培 养 １２ ｈ 后， 可见明显的抑菌环出现。根 据抑菌环直径大小可知， ４ 种芽 孢杆菌对所试 ７ 种抗生素均敏 感。其中 １ 号菌对氯霉素， 卡那 霉素， 环丙沙星， 链霉素， 四环素 为高度敏感（ 直径大于 １．５ ｃｍ） ； 对复方新诺明， 氨苄青霉素为 中 度敏感（ 直径 大 于 １ ｃｍ， 小 于 １．５ ｃｍ） 。 ３ 结论及讨论
杰 细 菌 鉴 定 手 册 》（ 第 八 版 ） ， 发
现该 ４ 种细菌均呈现出芽孢杆
菌属的菌落形态及菌体形态特 试
征。经过生孢培养后， ４ 种细菌 验
均产生芽孢， 呈现出了芽孢杆菌 研 最主要的特征， 可以证明该 ４ 种 究
细菌均为芽孢杆菌属成员。由此 ２
可以判定， 从辽宁省某地区采集
ＳＩＣＨＵＡＮ ＸＵＭＵＳＨＯＵＹＩ
１％葡 萄 糖 ； 革 兰 氏 染 色 液 ： 草 １．４ 形态学观察 首先通过肉 应， 否则为阴性。
酸 铵 结 晶 紫 ， 碘 液 ， ９５％酒 精 ， 眼 观 察 并 记 录 细 菌 的 菌 落 形 态
淀粉水解试验： 将细菌接种
番 红 复 染 液 ； 芽 孢 染 色 液 ： 萋 － 特征。之后， 通过光学显微镜观 于 含 ０．５％ 可 溶 性 淀 粉 的 Ｔ２ 琼
３ 号菌菌落大小为 ５ ｍｍ 左 右， 菌落呈圆形， 边缘整齐， 乳白
色， 不透明， 表面有皱褶。菌体经 革兰氏染色， 呈蓝紫色， 为革兰 氏阳性细菌。经过生孢培养后可 见芽孢位于菌体一端。
４ 号菌菌落大小为 ７ ｍｍ 左 右， 菌落呈圆形或椭圆形， 边缘 不整齐， 灰白色， 不透明， 表面有 明显隆起的皱褶。菌体经革兰氏 染色， 呈蓝紫色， 为革兰氏阳性 细菌。经过生孢培养后可见芽孢 位于菌体一端。 ２．２ 生理生化试 验 结果如表 １ 所示。
胨， １％ＮａＣｌ； 生孢培养基： ０．１％ 种 环 分 别 于 ＬＢ 琼 脂 平 板 上 划 ＮａＯＨ 溶 液 １０～２０ 滴 ， 并 用 牙
蛋 白 胨 ， ０．１％ 葡 萄 糖 ， ０．０７％ 酵 线接种， 于 ３７ ℃培养箱中培养， 签 挑 入 约 ０．５～１ ｍｇ 微 量 肌 酸 ，
母 粉 ， ０．０２％ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ， ０．０２％ （ ＮＨ４） ２ＳＯ４， ０．１％ Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ， １．５％ 琼 脂 ； Ｔ２ 培 养 基 ： １％ 蛋 白
是在颗粒饲料还是液体饲料中
都较稳定。还可以用于微生物肥
料和酶制剂生产的菌种筛选。芽
孢 杆 菌 是 一 类 好 氧 型 、内 生 抗 逆
孢子的杆状细菌。它以孢子状态
进入畜禽肠道进行生长繁殖， 消
耗肠内氧气， 造成厌氧环境， 使
乳 酸 菌 、双 歧 杆 菌 增 加 ， 大 肠 杆
菌减少， 属于益生菌， 既对动物
辑 收稿日期： ２００７－ ０９－ ２４
管， 于 ３７ ℃培养箱中培养 ４８ ｈ， ２４～４８ ｈ。在培养液中加入 乙醚
曾 宪
作者简介： 邹 伟（ １９８１－ ） ， 女， 在读研究
观 察 是 否 产 酸 （ 有 颜 色 变 化 ） 、 １～２ ｍＬ， 经充分振荡使吲哚萃取
Байду номын сангаас
春 生， 研究方向： 动物传染病防治。
１．３ 挑菌及纯化 根据芽孢杆 蛋白胨培养液的试管中， 置 ３７ ℃
１．１ 培 养 基 与 试 剂 ＬＢ 培 养 菌菌落形态特征， 选取菌落形态 恒 温箱中培养 ２４～４８ ｈ。取出试
基 ： ０．５％ 酵 母 抽 提 物 ， １％ 蛋 白 明显不同的几种菌落， 用无菌接 管 ， 振 荡 ２ ｍｉｎ， 再 加 入 ４０％
试 验
土壤中芽孢杆菌的分离及初步鉴定
研
究
邹 伟 １， 赵玉军 １， 陈晓月 １， 海 洋 １， 金苗苗 １， 杨剑洁 ２， 刘 永 １
１２
（ １．沈阳农业大学畜牧兽医学院， 辽宁 沈阳 １１０１６１； ２．鞍山市动物疫病控制中心， 辽宁 鞍山 １１４０００）
ＳＩＣＨＵＡＮ ＸＵＭＵＳＨＯＵＹＩ
中图分类号： Ｓ８５２．６１６ 文献标识码： Ｂ 文章编号： １００１－ ８９６４（ ２００８） ０２－ ００２４－ ０２
本 试 验 从 土 壤 中 分 离 出 ４ 分别涂布于 ２０ 个 ＬＢ 琼 脂 平 板
ＶＰ 试验 （ 乙酰甲基甲醇试
种芽孢杆菌， 并进行初步鉴定， 上， 于 ３７ ℃培养箱中培养至长 验） ： 用无菌接种环挑取单个菌
为今后进一步试验打下基础。
出单个菌落。
落分别接种于装有 ５ ｍＬ 葡萄糖
１ 材料与方法
采集样品后， 土壤经沸水浴 煮 １０ ｍｉｎ， 此时普通细菌均已被 灭活。而芽孢杆菌会形成孢子， 以抵抗不良环境因素， 维持生 命。经过培养基培养一段时间之 后， 孢子消失， 细菌复苏， 可在培 养基上正常生长， 从中选出 ４ 种 形态不一致的细菌， 进行进一步 试验。经过形态学观察， 结合《伯
四川畜牧兽医·２００８·０２ 期·总第 ２０８ 期
纳 氏 石 炭 酸 复 红 液 ， ９５％乙 醇 ， 察细菌菌落的形态特征。用革兰 脂平板中， 于 ３７ ℃培养箱中 培
碱 性 美 蓝 液 ； 抗 生 素 药 敏 片 ， 购 氏 染 色 法 及 芽 孢 染 色 法 在 光 学 养 ４８ ｈ， 然 后 用 碘 溶 液 覆 盖 平
自杭州天和微生物试剂有限公 显微镜下观察菌体形态及芽孢 板， 观察菌落周围是否有透明圈
白方面则要明显优于大肠杆
菌。随着研究的不断深入， 芽孢 编 杆菌也必将成为外源基因最具 辑
潜力的表达宿主之一。 参考文献（ 略）
■曾
宪 春
２５
机体无不良影响， 又不会造成环
境污染。
另外， 由于芽孢杆菌还具
有良好的分泌外源蛋白的特
性， 人们可从分子生物学角度
对其进行开发研究， 将其应用
于基因工程研究与生产中， 将
外源基因转入合适的该种菌株
中， 使其表达外源基因。当然，
对于外源蛋白表达的研究， 芽
孢杆菌还远远落后于大肠杆
菌， 但是在表达和分泌活性蛋