实验二_____土壤中放线菌的分离

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微生物实验指导书-教材

微⽣物实验指导书-教材微⽣物学实验指导书⽬录实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术 (3)实验⼆培养基的配制 (8)实验三从⼟壤中分离微⽣物及纯化 (11)实验四微⽣物的接种技术 (14)试验五细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 (17)实验六细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊ (20)实验七⼤肠杆菌⽣长曲线的测定 (23)实验⼋实验室环境和⼈体表⾯微⽣物的检查 (25)实验九乳酸菌的检测 (28)实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术【⽬的要求】1. 学习并掌握棉塞制作的⽬的、原理及⽅法；2. 学习并掌握玻璃器⽫清洗及包扎⽅法；3.掌握⾼压蒸汽灭菌的基本原理及操作⽅法。

4.了解其它常⽤消毒灭菌技术原理及技术【基本原理】棉塞的作⽤有⼆：⼀是防⽌杂菌污染，⼆是保证通⽓良好。

因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较⼤的影响。

微⽣物学实验所⽤的器⽫，⼤多数要进⾏清洗、消毒、灭菌，才能⽤来培养微⽣物。

玻璃器⽫的包扎⽅法正确合理，在使⽤过程中才能有效防⽌杂菌的污染。

玻璃器⽫包扎好后，⼀般⽤⾼压蒸⽓灭菌法进⾏灭菌。

⾼压蒸⽓灭菌是将待灭菌的物品放在⼀个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的⽔沸腾⽽产⽣蒸⽓。

待⽔蒸⽓急剧地将锅内的冷空⽓从排⽓阀中驱尽，然后关闭排⽓阀，继续加热，此时由于蒸⽓不能溢出，⽽增加了灭菌锅内的压⼒，从⽽使沸点增⾼，得到100℃以上的⾼温，导致菌体蛋⽩质凝固变性⽽达到灭菌的⽬的。

此外，常见灭菌⽅法还有⼲热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。

对空间灭菌常使⽤甲醛加⾼锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌⽅法。

【实验⽤品】棉花，试管，培养⽫，纱布，三⾓瓶，棉线，量筒，⽜⽪纸（或旧报纸），LDZX-50KBS ⽴式⾼压蒸⽓灭菌锅，常⽤灭菌⽤具、药剂等等。

【⽅法步骤】⼀、棉塞的制作正确的棉塞要求形状，⼤⼩，松紧与试管⼝（或三⾓瓶⼝）完全适合，过紧妨碍空⽓流通，操作不便；过松则达不到滤菌的⽬的。

制作过程见图1，包括取棉花、整理、折⾓、卷紧、成形、塞试管等步骤。

实验二：土壤中微生物分离与纯化

了解并掌握微生物的生理生化特征，如营养需求、代谢途径、酶活性等。
微生物纯化
在分离的基础上，进一步通过反复划线培养或平板克隆培养，获得纯培养的微生物。
熟悉微生物分离与纯化的实验操作流程
土壤样本采集
选择具有代表性的土壤样本，采集时要避免污染，并记录采
样点的环境信息。
微生物的纯化
对分离得到的菌落进行纯化，通过反复划线或平板克隆培养，获得纯培养的微生物。
菌落形态观察
观察纯化后的菌落形态，记录菌落特征。
微生物的保存与鉴定
菌种保存
将纯化的菌株进行冷冻干燥或甘油保藏，以备后续实验使用。
微生物鉴定
采用形态学、生理生化实验或分子生物学方法对分离得到的菌株进行鉴定。
04
CATALOGUE
实验结果与分析
微生物分离与纯化的结果观察
微生物分离
通过划线分离法，成功将土壤中的微生物分离到了培养基上，观察到菌落形态各养基
根据目标微生物的特性，选择适合的培养基。
培养
将土壤稀释液涂布或滴加在培养基上，放入恒温培养箱中培养。
观察与记录
观察微生物的生长情况，记录菌落形态、颜色、大小等特征。
微生物的纯化
挑选单菌落
从培养基上挑选单菌落，采用划线法或稀释涂布法进行纯化。
纯化培养
将纯化的菌株进行多次划线培养或传代培养，确保获得纯培养物。
01
微生物纯化的原理是利用微生物的单一特性进行分离，使同一种微生物在培养基上形成单一菌落。
02
常用的微生物纯化方法包括划线分离法、稀释涂布平板法、显微操作法等。这些方法可以根据不同微生物的特性选择使用，以获得纯培养。
03

土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离
分离土壤中的放线菌的步骤如下：
1. 准备培养基：选择适合放线菌生长的培养基，常用的包括土壤提取物富集培养基、葡萄糖琼脂糖培养基、镜菌素琼脂糖培养基等。

2. 取样：在选择好的采样地点，使用消毒的工具（如消毒棉签或无菌铲子）采集土壤样品。

注意避免土壤样品的污染。

3. 预处理：将采集到的土壤样品放入无菌研钵中，加入合适的无菌生理盐水或者缓冲液，悬浮土壤样品，使放线菌被更好地释放出来。

可以对土壤样品进行稀释处理，以降低微生物密度。

4. 稀释平板法：将预处理好的土壤样品用无菌移液管分别
在培养基平板上均匀涂布。

然后放入恒温培养箱进行培养。

孵育时间一般为3-4周。

在培养箱内，放线菌会产生菌落
形成。

5. 单菌分离：在培养箱内观察到单个的放线菌菌落后，使
用消毒的工具将其分离到新的培养基上，形成纯种菌落。

这一步可以采用传统的传代分离法或微量分离法。

6. 纯种菌株保存：将得到的纯种菌株存储在适当的冻存管中，通过冻存进行长期保存。

需要注意的是，在进行上述步骤时，需要严格遵守无菌操
作的原则，避免样品或培养基的污染，以保证得到纯种的
放线菌菌株。

土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法

土壤、水质检测——放线菌、霉菌、大肠杆菌的分离方法微生物因为体积小、质量轻、适应性强、繁殖能力强等特点，广泛分布于自然界中。

它们存在于食品、化妆品、饲料、环境等人们能触及的各个角落中。

某些微生物对产品的污染，不仅影响到产品本身的质量，更严重的是它危及消费者的健康和安全。

科标检测研究院凭借多年的微生物检测经验，可提供快速、高效、权威的第三方微生物检测服务，赢得社会业内广泛认可。

主要针对食品、医药、化妆品、农产品、一次性产品以及工业产品等进行微生物检测以及产品微生物污染分析。

以下介绍几种菌的分离方法：一、从土壤中分离放线菌1.制作高氏一号培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

2.称取土壤10克，放入装有100毫升无菌水的锥形瓶中，并加入10%酚10滴，以抑制细菌生长。

振荡10分钟，制成10-1菌悬液。

按照连续稀释分离法，进一步制成10-3菌悬液。

3.用移液管吸取0.1毫升10-3菌悬液，注入平板培养基上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上。

然后将培养皿倒置于25-30℃温箱中，培养7-10天，培养基上会出现微生物菌落。

如果菌落的硬度较大，干燥致密，且与基质紧密结合，不易被针挑起，这就是放线菌菌落。

4.挑取放线菌菌落，接种于斜面培养基上。

二、从土壤中分离霉菌1.制作豆芽汗葡萄糖培养基，并添加80%乳酸数滴，以抑制细菌生长。

将培养皿中，凝成平板，待用。

2.称取10克土壤，按上述分离放线菌的方法制成10-4或10-5的菌悬液。

3.取0.1毫升菌悬液注入培养皿内培养基上，用玻璃刮刀涂抹均匀。

然后将培养皿倒置于2 5-30℃温箱内培养3-4天。

培养基上会出现微生物菌落。

霉菌菌落常长成绒状、棉絮状或蜘蛛网状，可根据这一特征寻找霉菌菌落。

4.挑取培养皿内的霉菌菌落接种于斜面培养基上三、从饮水中分离大肠杆菌1.制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。

2.用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1:10稀释。

王--实验二土壤中微生物的分离与纯化

王--实验二土壤中微生物的分离与纯化
土壤中是存在大量微生物的，包括细菌、真菌、放线菌等，在生态系统中起着重要作用。

微生物的分离与纯化是微生物学研究的重要方法之一，对于了解土壤微生物多样性、功能和应用具有重要意义。

本实验旨在通过土壤样品进行微生物分离和纯化，了解微生物分离技术和分离纯化菌株的方法。

一、实验方法
1.1 实验设备
实验室常用的分离纯化设备有平板计数器、减压灭菌器、烧杯、移液器、离心机等。

其中，平板计数器是精确测定细菌数量的仪器。

实验材料包括培养基、细菌液、土壤样品等。

1.3 分离纯化细菌的步骤
（1）将土壤样品放入离心管内。

（2）在土壤样品中加入生理盐水，摇晃离心管，使土壤样品和生理盐水充分混合。

（3）将混合物在烧杯内振荡。

（4）利用平板计数器精确测定细菌数量。

（5）从混合物中挑出单个菌落，进行菌株分离和纯化。

（6）将菌落移至培养基上，进行培养、观察和记录。

二、实验结果
通过本实验，我们共采集了5个不同土壤样品，进行菌落计数和菌株分离、纯化、培养等处理。

实验结果显示，不同土壤样品中微生物的数量和种类存在差异。

其中，含有腐殖质较多的土壤样品中微生物数量较多，且种类丰富。

2.2 结果分析
土壤微生物数量和种类的差异主要与土壤样品的营养含量及物理化学性质有关。

白灰土、黄土、红壤等含有较高营养含量和较优地理环境的土壤样品中微生物的数量和种类较多，而贫瘠荒芜的土壤样品中微生物数量和种类较少。

此外，氧分压、pH值、盐分等土壤环境因素的差异也会导致土壤中的微生物数量和种类存在差异。

实验二土壤中微生物的分离纯化及观察

实验结果
➢ 详细描述实验中各种微生物在斜面上、半固体和液体培养基中的培养特征。
思考题
➢ 一个好氧的具周生鞭毛的菌株分别在斜面、半固体和液体培养基中的培养特征。
➢ 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条线或蛇形，而只要划一条直线？
➢ 接种环（针）接种前后灼烧的目的是什么？为什么在接种前一定要将其冷却？如何判断灼烧过的接种环已冷却？
法和步骤； ➢ 掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方
法。
培养基的种类
➢ 按成分不同分天然培养基合成培养基半合成培养基
➢ 按培养基的物理状态分固体培养基半固体培养基液体培养基
➢ 按培养基的用途分基础培养基营养培养基鉴别培养基选择培养基
培养基的配制方法和步骤
➢ 称量：按照配方正确称取各种原料置于搪瓷杯中； ➢ 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，补足水
（使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞存在），再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的选择性培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克或每毫升样品中的微生物数量。
实验器材 ➢ 土壤稀释液的三种不同培养基的培养平板 ➢ 菌种：大肠杆菌菌悬液 ➢ 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 ➢ 仪器或其他用具：1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有
灭菌
干热灭菌 ➢ 火焰灼烧法 ➢ 干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法）湿热灭菌法 ➢ 加压蒸汽灭菌法紫外线灭菌法微孔滤膜过滤除菌
火焰灼烧法
直接在火焰上灼烧灭菌主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。
干热灭菌法
设备：电热烘箱适用于耐高温器皿，160-170℃，维持2小时注意事项：

土壤中放线菌的分离 (2)

土壤中放线菌的分离简介放线菌（Actinomycetes）是一类广泛存在于地球各种土壤中的微生物，具有丰富的生物活性代谢产物和生物学功能。

分离土壤中的放线菌对于获得新的生物活性物质和解析放线菌菌株有着重要意义。

本文将介绍土壤中放线菌的分离方法及过程，并提供一些实践经验。

分离方法样品收集选择合适的样品收集地点至关重要。

一般情况下，草地、农田、果园等土壤中含有较丰富的放线菌资源。

在进行样品收集前，应先清理收集工具和容器，并使用无菌绳固定收集区域，避免外界杂质污染。

样品处理1.从采集的土壤中取得样品，并将其放入无菌锥形瓶中。

2.将样品添加至无菌水中，形成土壤悬浮液。

可以通过搅拌或振荡等方式充分悬浮土壤颗粒。

3.通过离心的方法，去除悬浮液中的大颗粒和杂质。

分离培养基的制备分离出放线菌的选择培养基非常重要，一般常用的培养基有：•考马斯琼脂培养基（Koj A）•聚芽孢杆菌琼脂培养基（SGA）•苯丁三唑糖脂琼脂培养基（BIS）其中，考马斯琼脂培养基是最为常用的一种，可以选择性地培养出放线菌。

分离操作1.在无菌条件下，将处理好的土壤悬浮液均匀涂布于分离培养基上。

2.用一次性平皿、玻璃块或玻璃棍等工具均匀划开土壤悬浮液，以增加放线菌的分离点。

3.培养皿密封后，放入恒温培养箱进行培养，通常在28-30℃下培养7-10天。

鉴定和筛选在培养箱中培养的结果显示出放线菌的单独菌落后，可以进行以下鉴定和筛选步骤：1.观察和记录菌落形态特征，包括颜色、形状、质地等。

2.进行显微镜下的形态观察，例如菌丝形态、芽孢形态等。

3.进行生理生化特性的鉴定，包括酶活性、产生代谢产物等。

4.进行16S rRNA或其它分子生物学方法的鉴定，以确定放线菌属别。

实践经验1.分离培养基的配制需要细心严谨，避免污染。

最好在无菌工作台环境下操作。

2.鉴定放线菌时，不同菌株之间可能存在形态和生理差异，需要谨慎观察和鉴定。

3.放线菌培养需要一定的时间，早期菌落的筛选和鉴定需耐心等待。

土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告

土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验目的：1、从土壤中分离产抗生素的放线菌2、放线菌的培养3、放线菌的发酵产生活性物质4、放线菌产生的活性物质提取。

实验原理：放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。

放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。

许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。

采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。

产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。

实验器材：1、土壤2、培养基：高氏一号培养基、种子培养基、发酵培养基3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。

实验步骤：一、土壤放线菌株的采集采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。

先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。

将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。

样品（土壤）处理：室温风干二、土壤中放线菌的分离、培养1、配制淀粉培养基淀粉琼脂培养基（高氏培养基）可溶性淀粉2g；硝酸钾0.1g；磷酸氢二钾0.05g；氯化钠0.05g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.001g；琼脂2g；水100ml.先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。

加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。

调整PH到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。

2、土壤悬液梯度稀释①将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。

②用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。

③按1：:1稀释至10-3、10-4、10-5，将3块灭菌平板分别标记10-3、10-4、10-5 ，稀释过程应在无菌条件下进行。

土壤中放线菌的分离和纯化实验(精选5篇)精选全文完整版

可编辑修改精选全文完整版土壤中放线菌的分离和纯化实验（精选5篇）第一篇：土壤中放线菌的分离和纯化实验土壤中放线菌的分离和纯化实验一、实验目的1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。

2、掌握培养基的灭菌方法。

掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。

4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；5、掌握高氏一号培养基的配制方法；6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。

7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。

二、实验材料高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、酒精棉球、镊子、电子天平、称量纸、烧杯、量筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀三、实验原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）第 1 页或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。

四、实验步骤1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制母液。

2、配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4℃保存；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。

溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。

土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化

土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。

2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。

3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。

4. 学习平板菌落计数法。

二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。

要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。

微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。

表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。

3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。

4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。

4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。

（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。

先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。

盛土的容器应是无菌的。

将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。

放线菌的实验报告

一、实验目的1. 掌握土壤中放线菌的采集、分离和纯化方法。

2. 学习放线菌的培养技术，观察其生长特征。

3. 提取放线菌产生的活性物质，并对其活性进行初步鉴定。

二、实验原理放线菌是一类呈菌丝状生长的微生物，广泛分布于土壤、空气和水中。

放线菌与人类的生产和生活关系密切，许多临床应用的抗生素均由放线菌产生。

本实验通过土壤中放线菌的分离、培养和活性物质提取，旨在了解放线菌的生长特征及其产生的活性物质。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 土壤样品- 高氏一号培养基- 种子培养基- 发酵培养基- 试剂：重铬酸钾、无菌水、酒精等2. 实验仪器：- 培养皿- 牛津杯- 接种环- 酒精灯- 无菌涂棒- 三角锥瓶- 高压蒸汽灭菌锅- 天平- 药匙- 烧杯- 量筒- 玻璃棒- 试管- 牛皮纸- 线绳四、实验步骤1. 土壤放线菌株的采集（1）选择取样点：选择有机质含量高的土壤，如菜地、林地等。

（2）采集样品：按对角交叉（五点法）取样，先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。

（3）将5点样品混合均匀，用无菌水稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍。

2. 放线菌的分离与纯化（1）制备高氏一号培养基平板：将高氏一号培养基加热溶解后，倒入培养皿中，待凝固后备用。

（2）将稀释后的土壤样品涂布于高氏一号培养基平板上。

（3）将平板置于37℃恒温培养箱中培养3～5天，观察菌落生长情况。

（4）挑取单菌落进行纯化，重复上述步骤，直至获得纯放线菌。

3. 放线菌的培养（1）将纯化后的放线菌接种于种子培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24小时。

（2）将种子液按一定比例接种于发酵培养基中，置于37℃恒温培养箱中发酵。

4. 活性物质提取（1）将发酵液离心分离，收集上清液。

（2）用重铬酸钾对上清液进行氧化反应，观察颜色变化，以初步鉴定活性物质。

五、实验结果与分析1. 放线菌分离与纯化：成功分离纯化出放线菌，菌落呈菌丝状，颜色多样。

实验(二)土壤中微生物的分离纯化及观察

2.稀释:
0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml
原样
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
0.2ml
0.2ml
0.2ml
3.取样
10-4
10-5
10-6
4.倒平板：倒入融化后冷却至45℃的培养基15～２５ml，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。
么？
当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在
一起时，你认为问题出在哪里？
用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不
同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？
倾注法
涂布法
倒平板
a 皿加法
b手持法
细菌Leabharlann 霉菌放线菌实验内容
一、稀释涂布平板法（全组完成）
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：涂布10-3、10-4、10-5三个剃度，每个剃度两块平板高氏Ⅰ号培养基：涂布10-2、10-3、10-4三个剃度，每个剃度两块平板马丁氏（孟加拉红）培养基：涂布10-2、10-3、10-4三个剃度，每个剃度两块平板
器材
分离源：自采集土壤样品
培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏Ⅰ号培养基、马丁氏（孟加拉红）培养基溶液或试剂盛4.5ml无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。
仪器或其他用具振荡器，无菌培养皿，无菌吸管，接种环，电磁炉，培养箱，吸耳球等。
一、稀释涂布平板法（全组完成）
1、编号：取无菌平皿１８个。另取无菌水４支，依次标明10-2、10－3、10-4、10-5。
0.5ml
各4.5ml 无菌水

实验二-----土壤中放线菌的分离

实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5～10cm的土壤后取样.放入100ml三角瓶中,加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24—48h，液面则产生黄白色皮膜。

用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28—37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。

实验6土壤中放线菌的分离（实训）实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法.2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术.实验材料：药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。

其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。

实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基.这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4•3H2O 、MgSO4•7H2O作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素,提供铁离子等组成。

放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。

由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。

分离放线菌常用稀释倒平板法。

根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。

如果培养基成分改变，或土壤预先处理(120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌.再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。

实验四、土壤中放线菌的分离

实验四、土壤中放线菌的分离一、实验目的1、从土壤中分离、纯化放线菌；初步掌握药用微生物的分离纯化方法和操作技术。

2、了解不同生境条件中土壤放线菌的种类与数量。

二、实验内容筛选放线菌永远是新抗生素研究的课题之一。

迄今为止，已发现的抗生素约有80%来自于放线菌。

土壤中放线菌最丰富，品种齐全。

通常情况下，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。

随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。

从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中可分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。

土壤中含有的放线菌主要是链霉菌，人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌，如小单孢菌、游动放线菌、诺卡氏菌等，它们是生物活性物质重要的产生菌。

但往往由于样品中稀有放线菌的数量太少，常规的分离方法很难得到。

对样品进行风干、干热处理、培养基添加重铬酸钾等方法可以减少细菌和真菌的数量，以提高放线菌的获得率。

用干热和苯酚处理可减少链霉菌数量和比例的方法，可以分离得到更多种类的放线菌。

土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法来获得放线菌。

注：从土壤中分出的放线菌要进一步鉴别是否为抗生菌。

首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。

常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。

其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。

抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。

三、实验原理、方法和手段原理一：稀释涂布平板法；如图1。

原理二：对样品进行风干、干热处理以减少细菌和真菌的数量；原理三：向培养基添加适量的重铬酸钾能抑制其他细菌、真菌的生长，但不影响放线菌的生长。

图1 稀释涂平板法示意图四、实验组织运行要求根据本实验的特点、要求和具体条件，采用“采用集中授课形式，分组试验进行”的组织运行模式。

土壤中放线菌的分离与应用

土壤中放线菌的分离与应用作者：詹庆曹雅丽来源：《现代园艺·综合版》2017年第02期摘要：放线菌是一类具有发展前景的新微生物资源，放线菌的产物除了常用的抗生素除青霉素和头孢霉素类外，绝大多数都是它的产物。

筛选的放线菌的代谢产物分类方式有很多，但按功能分类，大致可分为抑菌、杀虫、植物生长调节、抗肿瘤活性及其他多种重要的活性类型。

本文主要从放线菌的分离，应用两大方面进行研究，从而筛选出优质、纯种、功效强的放线茵。

关键词：放线菌；筛选；分离；应用放线菌是广泛分布于土壤中的优势微生物类群，其分枝状的菌丝体能够产生各种胞外水解酶，降解土壤中的各种不溶性有机物质，以获得细胞代谢所需的各种营养，对有机物的矿化有着重要作用，从而参与自然界物质循环，净化环境，改良土壤。

而现如今，人们对放线菌的应用远不及此，放线菌更多地被应用到医学治疗，减少农产品病虫害等各个领域中。

1放线菌在农业当中的应用近年来，随着人们对食品和环境中化学农药安全性的普遍关注，对一些危险性化学农药使用的谈虎色变情况，促使人们寻求其它安全有效的植物病害控制新途径。

而近年来微生物发展迅速，让人们去除植物病虫害的途径逐渐从化学农药的使用向微生物方法转变，利用有益微生物防治植物病害。

它既可以改善，维持植物自然生态系统，又可通过微生物之间的相互作用达到防病之目的。

自20世纪60年代Umezawa研究微生物产生的酶抑制剂以来，对由微生物产生的非抗生素的生物活性物质研究逐步拓宽，此类物质在控制人类非感染性疾病方面发挥了很大的作用。

这些活性物质有70%～80%是由放线菌产生的，这说明放线菌作为药物产生者具有巨大价值。

1.1抗生素的使用放线菌与人类关系极为密切，绝大部分属有益菌，放线菌的产品多种多样，特别突出的是抗生素，对人类健康作出重要贡献。

至今已报道通过的近10000种抗生素中，约70%有放线菌产生，如链霉菌、土霉素、多黏霉素、庆大霉素、井冈霉素等。

土壤中稀有放线菌的选择性分离方法_郭丽娜 (1)

４８９放线菌是具有很高实用价值的一类微生物，作为生物活性物质的主要产生菌早已成为人们研究的焦点。

目前，从微生物中发现１００００余种抗生素，约７０％为放线菌所产生。

不仅如此，放线菌还会产生酶制剂、氨基酸等有用物质。

因此，对放线菌资源的调查与开发显得尤为重要。

并且由于新物种具有产生新生物活性物质的潜力，人们开始尽可能寻找新放线菌，特别是用常规方法很少分离到的稀有放线菌。

根据Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ最早的概念，稀有放线菌是指那些用传统方法分离时，分离频度远低于链霉菌的放线菌。

稀有放线菌在土壤中分布量少，在人工培养基上生长缓慢，有的还有特殊的营养要求，按一般的分离和培养方法，获得的菌量很少。

近年来即认为链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属以外的为所谓稀有放线菌属。

分离这些稀有放线菌，不仅可以减少对产生已知生物活性物质菌株的重复分离，还可扩展放线菌次生代谢产物的化学多样性。

几十年来，科研工作者发现，稀有放线菌能产生众多生物活性物质，包括红霉素、利富平、马杜拉霉素、洋红霉素等抗生素、酶类、维生素等。

其中一些抗生素已商业化，产生巨大的社会和经济价值。

研究结果表明，环境中只有极少一部分微生物得到纯培养。

因此，分离未知放线菌是利用它们的首要前提之一。

１、土壤预处理绝大多数的放线菌来源于土壤。

采集好土壤后的第一步是土壤的预处理，即对土壤样品或刚收集的水生地样品进行特殊的处理，用物理方法或化学方法来达到目地。

不同的实验室对于预处理也有自己独到的方法。

江翠翠等研究了不同物理机械与化学分散剂结合及加热与化学物质预处理土样对放线菌分离效果的影响，以期提高放线菌检出率。

采用涂布平板稀释法进行放线菌的分离，为达到更好的分散效果，物理机械分散常与化学分散相结合，促进微生物与土粒的分离。

范丽霞等对最有利于土壤放线菌分离的自然风干时间展开了研究。

研究结果表明：土样放置７天和２１天均适合放线菌的分离，放置７天的放线菌菌落较多，种类也较齐全，而细菌和真菌数量下降较快。

高氏一号培养基的制备和土壤中放线菌的分离2

周赞云周思宇赵培养基的一般方法。 • 2 掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。 • 二实验原理1 高氏一号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基，主要特点：含有各种化学成分已知的无机盐。 • 2 放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。
• 3 涂布 • 将培养皿底部写上10-4、10-5、10-6字样，各3 个---吸取以上稀释液放于平板中央（无菌吸管吸 0.2ml）---玻璃涂棒涂均匀---再改变90度沿另一垂直线来回波动----边缘处可改变方向---静置5 10min。 • 4 培养 • 将含高氏一号培养基的平板倒置于28℃温室中培养3 - 5d。 • 5 挑菌落 • 将培养长出的单个菌落挑取少许菌苔接种在培养基斜面---置28℃和37℃温室培养---菌苔长出后-检查特征是否一致---将细胞涂片染色用显微镜观察
• 是否为单一微生物细胞--若发现杂菌，再次分离与纯化---直至获得纯培养。
五成功关键
• 1注意PH调节，不要调过头。 • 2分装时，注意所装体积，不可过多，影响灭菌效果。 • 3注意无菌操作。 • 4涂布均匀，培养后菌落在整个平板表面分散均匀。
The end,thank you!
• 二土壤中放线菌的分离 • 1 倒平板：高氏一号培养基加热熔化，冷却至55 60℃---加入数滴10%酚---加链霉素溶液---混匀- --倒平板。 • 倒平板方法：右手持试管或三角瓶置火焰旁---左手拔塞，瓶口或试管口对准火焰---在火焰旁倒15ml 于培养基---加盖后，轻摇培养皿（均匀分布）---平置于桌面---待凝。 • 2 制备土壤稀释液 • 称土样10g---于盛无菌水90ml并有玻璃珠三角瓶--振摇20min（充分混合使细胞分散）--- 吸1ml土壤悬液（1ml无菌吸管）--- 加入盛9ml无菌水大试管--混匀。此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3、 10-4、10-5、10-6 几种稀释度的土壤悬液。

土壤中放线菌的分离和纯化实验报告

土壤中放线菌的分离和纯化实验报告土壤中放线菌的分离和纯化实验报告土壤是一个很复杂，有许多层次的生态系统。

要想从事物体内分离得到目标产物，必须在特定条件下进行，而不能凭空臆断。

因此，实验室分离放线菌所需设备也应根据这些原则来选择和准备，如果单凭某种条件就妄加判断那么往往会导致实验失败或造成人力财力上的浪费。

一、样品制备与培养基配制1．取土称量，充分混匀；取干燥疏松的盆或缸或其它容器，将盛装样品的容器放入水中浸泡24小时以上并每天换水数次直至发出清香气味为止。

2．称取少量样品于蒸馏水中，混合均匀。

3．挑取含水量适当的样品接种于经灭菌消毒的马铃薯种子培养基平板上。

4．将经过灭菌消毒的培养皿置于恒温箱或酒精灯上加热使之软化。

5．软化后的样品立即倒入100毫升灭菌马铃薯琼脂培养基中。

6．迅速摇动平板混匀，冷却至45℃左右，用无菌操作法倒平板并贴签标记好。

二、增菌接种三、初代培养和测试计算平板上的菌落数，挑取相同的稀释度再按照步骤一继续培养。

然后检查各种参数及观察培养结果，对比最终的数值，以判断微生物对放线菌的敏感程度和产率。

四、菌种保藏采集长期保存的菌种可采用50℃的马铃薯培养基，将菌液接入0.7%-0.8%琼脂斜面中，斜面凝固后将斜面置冰箱中低温保存。

五、影响实验结果的主要因素环境条件和杂菌污染的因素都会严重地影响放线菌的分离纯化效果，如果只注意控制某个方面，忽视了另外两个条件都难以获得满意的结果，故要求分析工作者既要认真仔细又要灵活掌握，对那些关键性的技术环节和易受外界干扰因素影响的项目应给予足够的重视，这里只简略说明几点。

（1）温度是决定分离效果的主要因素之一。

通常情况下，分离放线菌要在25℃～28℃，湿度60%～70%的条件下进行，温度高达40℃，不但有碍于菌株的正常繁殖，还会导致菌种死亡。

2．采用多菌种混合分离的办法更能提高效率。

（3）琼脂浓度的影响在各种放线菌的分离中，无论是直接法还是间接法，均以琼脂培养基的营养丰富、无机盐和生长因子较多等优良特性著称，故为放线菌分离的常规方法，由于它在生长过程中氧化葡萄糖产酸，故利用这一特点来抑制微生物的呼吸，同时利用无机盐提供电子使酶钝化，因而提高了实验效果，并且减轻了劳动强度。

发酵工程实验指导书

发酵工程实验指导书————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：发酵工程实验指导书辽宁石油化工大学环境与生物工程学院主编《发酵工程》实验指导书实验学时：24学时适用专业：生物工程生物技术是当前优先发展的高新技术之一，本课程是为了和生物工程专业理论教学相配合，通过实践教学，培养学生对生物工程专业知识的具体实际应用的能力。

发酵工程实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课，是在学生学习了《生物化学及实验》、《微生物学及实验》等专业基础课及专业实验课的基础上开设的，课程目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个微生物生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达到提高他们理论联系实际能力的目的。

通过学习，使学生能掌握发酵工程常用的实验方法和常见的发酵工程设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。

本实验指导书包括：实验一、细菌增殖曲线的测定（6学时）实验二、土壤中放线菌的分离与纯化（6学时）实验三、发酵菌株的初筛实验四、枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育（6学时）（必做）实验五、淀粉酶的固态发酵（6学时）实验六、发酵过程中糖的利用（6学时）实验七、玉米淀粉液化和糖化（6学时）实验八、淀粉酶的固定化生产（6学时）实验九、摇床培养确定酵母菌体的培养和营养条件（6学时）（必做）实验十、小型连续发酵实验（6学时）实验十一、甜酒酿的制作（6学时）备注：实验一至实验七为基础实验，实验八至实验十一为设计性和综合性实验，除必做实验外，其他可选做。

实验总时间为24学时，包括设计实验、准备实验、进行实验、书写实验预习及最终报告及所需仪器药品清单等。

实验一发酵菌株的初筛一、实验目的与要求目的：1、从已分离到的细菌或真菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株。

2、学习淀粉酶、蛋白酶产生菌的筛选方法。

要求：1、复习微生物学及实验过程所学到的微生物培养的方法和过程，了解影响微生物生长各种条件因素。