微生物遗传育种学3.1诱变育种
微生物菌种的选育和保藏--诱变育种
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢诱变处理： ➢诱变剂的处理方式： ✔单因子处理：采用单一诱变剂处理出发菌株； ✔复合因子处理：两种以上诱变因子共同诱发菌体突变，包括①两种或多种 诱变剂先后使用；②同一种诱变剂的重复使用；③两种或多种诱变剂的同时使用。 ➢诱变剂的处理方法： ✔直接处理方法：将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株； ✔生长过程处理法：适用于诱变作用强而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过 程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、LiCl、 秋水仙碱等；方法：可将诱变剂 加入培养基后涂平板；或先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平 板； 或摇瓶振荡培养处理；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 制备单孢子(或单细胞)悬液： ➢ 目的：获得单孢子(或单细胞)均匀的悬液；
➢ 原因: 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落；
➢ 方法:✔菌龄:对数期细胞、刚成熟的孢子母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选： ➢ 筛选方案:
➢ 筛选方法： ✔初筛：a.随机筛选：也称摇瓶筛选；随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选； b.平板菌落预筛：在培养皿上诱变后从试样检出突变体的一种
琼脂平板筛选法,有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等; ✔复筛:对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作，代表方法：琼脂
放线 菌或细菌的浓度为108个/ mL左右;
✔菌悬液配制方法:离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬 液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。 通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢ 诱变剂种类的选择：物理诱变剂和化学诱变剂 ✔物理诱变剂：紫外线、χ射线、γ射线、等离子、快中子、ɑ射线、β射线、 超声波等； ✔化学诱变剂: 碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等； ➢ 最适诱变剂量选择： ✔诱变剂剂量表示方式：a.UV的剂量指强度与作用时间的乘积； b.化学诱变剂剂量：诱变剂的浓度和作用 时间的乘 积来表示； c.在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂 的相对剂量； ✔最适诱变剂量确定：a.依据：最适剂量应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例； b.方法：通过比较剂量--存活率曲线和剂量-
微生物遗传学三
单链整合 复制与分离
转化子(strR) 肺炎链球菌转化的主要过程
非转化子(strS)
转化因子进 入细胞
转化因子单链 配对与整合
复制 分离
筛选的方法: a. 高于临界浓度的平板进行分离； b. 梯度平板法
所谓结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等 ）相似的物质。
如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变 株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。
为什么在筛选突变株时,不能直接用代谢产物,而必须用其结构类似物?
补充培养基（SM, supplemental medium）[A]:[-]+A [B]:[-]+B
相应营养缺陷型能生长的组合或半组合培养基
三种遗传型：
野生型（wild type） 从自然界分离到的、发生营养缺陷型突变前的原始菌株。
[A+B+], 可在[-]生长。
营养缺陷型（auxotroph） 野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产
设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。
（一） 出发菌株（original strain）
出发菌株指用于诱变育种的起始菌株。
出发菌株的选择标准： • 具有有利性状（如高产、生长速度快、营养要求粗放、
标记明显等）； • 对诱变剂敏感
出发菌株的来源： •野生型菌株； •从生产中选育的自发突变菌株； •诱变获得的高产菌株
a
b
c
单一营养物质要求的鉴定：
以氨基酸缺陷为例进行说明 将18种氨基酸按右表分为6组
特点：每2组只有一种共同物质
诱变育种发展
在人为的条件下,利用物理,化学等因素,诱发生物产生突变,从中选择,培育成动植物和微生物的新品种.诱变育种是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株，进而培育成新的品种或种质的育种方法。
它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。
诱发突变的物理因素主要指某些射线，如Y射线、X射线、B射线和中子流等；化学诱变剂主要指某些烷化剂，碱基类似物，抗生素等化学药物。
物理诱变方法应用于植物始干1928年。
L.J·斯德勒首先证实了X射线对玉米和大麦有诱变效应。
1930年和1924年H.尼尔逊·爱尔和D.托伦纳分别用辐射诱变技术获得了有实用价值的大麦突变体和烟草突变体。
化学诱变剂在植物上的应用一般认为始于1943年，当时F·约克斯用马来糖(脲烷)诱发了月见草、百合和风铃草的染色体畸变。
这些早期工作为确立诱变育种的地位奠定了基础。
通过近几十年的研究人们对诱变原理的认识也逐步加深。
我们知道，常规助杂交育种基本上是染色体的重新组合，这种技术一般并不引起染色体发生变异，更难以触及到基因。
而辐射的作用则不同，它们有的是与细胞中的原子、分子发生冲撞、造成电离或激发；有的则是以能量形式产生光电吸收或光电效应；还有的能引起细胞内的一系列理化过程。
这些都会对细胞产生不同程度的伤害。
对染色体的数目、结构等都会产生影响，使有的染色体断裂了；有的丢失了一段，有的断裂后在“自我修复”的过程中头尾接倒了或是“张冠李戴”分别造成染色体的倒位和易位。
当然射线也可作用在染色体核苷酸分子的碱塞上，从而使基因（遗传密码)发生突变。
至于化学诱变，有的药剂是用其烷基置换其它分子中的氢原子，也有的本身是核苷酸碱基的类似物，它可以“鱼目混珠”，造成DNA复制中的错误。
无疑这些都会使植物的基因发生突变。
理、化因索的诱导作用；使得植物细胞的突变率比平时高出千百倍，有些变异是其它手段难以得到的。
诱变育种
①不同种属的植物对辐射的感性差异很大： 物种不同，品种也有差异。许多研究表明： 十字花科>菊科>豆科>禾本科
如：萝卜素LD50为70千伦；小麦、大麦的LD50为30千伦； 大豆属的临界剂量为25千伦； ②不同器官，组织和细胞对辐射也有差异：各种组织中，以
分生组织最敏感，性细胞>体细胞，卵细胞>花粉细胞 ③植物倍性不同，敏感性不同：
紫外线： 是一种穿透力小的非电离射线。在2500—
2900nm范围内的波长效力最大，因为这是核酸 的最大光吸收区域。因其穿透力有限，在植物试 验中其用途只限于处理孢子或花粉粒。
辐射剂量单位：（见书)
二、辐射处理的方法和剂量
1、辐射处理的方法和部位
①方法：内、外照射两种 外照射：指被照射的种子或植株所受的辐射 来自外部某一辐射源。如用X光机进行X光照射； 用C060源进行γ射线照射，用原子反应堆、加 速器或中子发生器进行快中子或热中子照射等。
自然界中各种因素，如温度的剧烈变化，宇宙线照射 等都可以使植物出现自然突变，只是频率低而已。人工诱 发突变的频率要比自然突变高上千倍。
三、特点（用途）意义：
1、能提高植物的变异率，扩大变异范围
自然突变频率较低，一般在十万分之几到百 万分之几左右，而辐射诱发的频率可达1/30左右。 比自然突变率高100—1000倍。同时变异类型多、 范围大，这是系统选育方法所不及的。
γ射线： 是原子核内的电磁辐射，由原子核蜕变时产生。 它是一种高能电磁波，波长短、射程远、穿透 力强。因此一次可照射很多种子，剂量也比较均 匀.目前常用的γ射线是放射线同位素60C0产生的。
X射线： 又称阳极射线，由X光机产生，也是一种电磁辐
射，放射出来的是光量子，波长长，射程近，穿 透力弱，不易处理大量种子。 β射线：是由放射性同位素，如32P、35S等衰变 时所放出来的带负电荷的粒子流，在空气中、射 程短，穿透力弱，在生物体内电离作用较γ、X强， 是一种有效的诱变源、目前大都用于浸种试验。
诱变育种方法在微生物育种中的应用概述
诱变育种方法在微生物育种中的应用概述摘要：在现代发酵工业中，诱变技术（无论是物理还是化学诱变）对于促进微生物发酵从而提高利用反应底物的能力和高产率仍然起着至关重要的作用。
本文主要从工业生产中对于微生物的诱变育种的方法（物理、化学诱变育种等）进行了综述，以及通过几种常见的诱变方式来介绍在微生物育种方面的相关研究进展。
关键词：微生物；诱变育种；物理诱变；化学诱变一、前言现代发酵工程技术的最终产物，一般都是由微生物生产得到的，且通过微生物的发酵生产所取得的效益已经得到了全世界的瞩目和认可。
对工业微生物菌种的优化选育是提高产量和质量的一条有效途径。
以突变和筛选为中心的传统育种技术在工业微生物发展到现在规模的过程中始终起着重要作用。
70年代以来，重组DNA技术和原生质体融合技术开始用于菌种选育。
各种外源基因在原核生物、真核细胞的克隆和表达研究取得了重大成果，使工业微生物育种技术进入了真正意义的分子水平育种时代[1]。
常规的诱变育种方法主要为物理诱变和化学诱变两种。
微生物的诱变育种，是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选出产量高、性状优良的突变株，并找出这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适条件下合成有效产物。
以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种，具有速度快、收效大和方法简单等优点，是菌种选育的一个重要途径，在发酵工业菌种选育上具有卓越的成就，迄今为止，国内外发酵工业中所使用的生产菌种绝大部分是人工诱变选育出来的[2]。
理想的工业化菌种必须具备遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存、能经诱变产生变异和遗传、生产能力具有再现性、具有高产量和高收率等特性。
而从自然界分离的野生菌种，不论是在产量上还是在质量上，均难适合工业化生产的要求。
但诱变筛选方法相对简便，是菌种选育的基本、常规和经典方法。
特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是必不可少。
第三章 新技术育种原理
(3)移码突变的诱变剂
移码突变是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数 几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码 发生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变产生的突变体称 为移码突变体。
吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、吖啶橙及α -氨基吖啶等) 和溴化乙锭(EB、核酸染色剂，用于DNA凝胶染色)都是移码突 变的有效诱变剂
0.5%甘氨酸) 溶菌酶和EDTA处理 溶菌酶和EDTA处理 溶菌酶处理(生长时补充0.41M蔗糖及
0.3u/ml青霉素)
纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶
蜗牛酶
添加甘氨酸：菌体较易被酶解。提高细胞壁对溶菌酶的 敏感性作用机理并不十分清楚，有人认为甘氨酸渗入细 胞壁肽聚糖中代替D-丙氨酸的位置，影响细胞壁中各组 分间的交联度。不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相 同。
(1)与核酸碱基化学反应的诱变剂
烷化剂(alkylating agent) 带有一个或多个活性烷基，带 一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分别称为双功能或 多功能烷化剂。它们的烷基可转移至其它分子中电子密度高的位置， 它们的诱变作用是其与DNA中的碱基发生磷酸作用。
常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙 烯亚胺和环氧乙酸等。
B淋巴细胞(B-lymph) 骨髓瘤细胞(myeloma)
原生质体融合 杂交瘤细胞 MAB
主要步骤为：选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生 及筛选优良性状的融合子。
3.2.1 选择亲株
为了获得高产优质的融合子，首先应该选择遗传性状稳定且具有 优势互补的两个亲株。 同时，为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率，参与 融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗 药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。
第七章微生物的遗传变异和育种2
10-6~10-9
若干细菌某一性状的突变率
菌名
突变性状
突变率
Escherichia coil （大肠杆菌）
抗T1噬菌体
3×10-8
E．coil
抗T3噬菌体
1×10-7
E．coil
不发酵乳糖
1×10-10
E．coil
Staphylococcus aureus（金黄色葡 萄球菌）
S．aureus
抗紫外线 抗青霉素 抗链霉素
间接引起置换的诱变剂：
引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧 啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤 （8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP） 等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到DNA 分子中后而引起的，故是间接的。
（2）移码突变（frame-shift mutation 或phase-shift mutation）
（四） 基因突变的自发性和不对应性的证明
一种观点：突变是“定向变异”，是“驯化”，是由环 境因子诱发出来的；
另一种观点；基因突变是自发的，且与环境因素是不对 应的，后者只不过是选择因素；
1、 变量试验（fluctuation test） 又称波动试验或彷徨试 验。
2、涂布试验（Newcombe experiment） 3、平板影印培养试验（replica plating） 1952年，J．Lederberg夫妇
2、定向培育优良品种：指用某一特定因素长期处理某微生 物的群体，同时不断的对它们进行移种传代，以达到积 累并选择相应的自发突变株的目的。由于自发突变 的 频 率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程十分缓 慢。与诱变育种、杂交育种和基因 工程技术相比，定向 培育法带有“守株待兔”的性质，除某些抗性突变外， 一般要相当长的时间
微生物育种学的主要原理和技术
微生物育种学的主要原理和技术摘要微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。
微生物的育种技术已从常规的突变和筛选技术发展到基因诱变、基因重组和基因工程等，育种技术的不断成熟，大大提高了微生物的育种效果。
本文将讲述微生物育种学的主要原理和技术。
关键词：微生物育种原理方法技术1.微生物育种学的主要原理微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造，去除不良性质，增加有益新性状，以提高产品的产量和质量的一种育种方法。
其原理如下：生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制→不会有代谢产物的积累→解除或突破微生物的代谢调节控制→目的产物积累→微生物育种的目的2.微生物育种学的主要技术2.1 自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。
一般认为自然突变有两种原因引起，即多因素低剂量效应和互变异构效应。
所谓多因素低剂量效应，是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等作用引起的突变。
互变异构效应是指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构，会引起碱基的错配。
自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降；另一种是对生产有益的突变。
为了保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产菌种自然选育，以淘汰退化的，选出优良的菌种。
自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。
但是自然选育的效率低，因此经常要与诱变育种交替使用，以提高育种效率。
由于DNA的半保留复制以及校正酶系的校正作用和光修复、切除修复、重组修复、诱导修复等作用，使得自发突变几率极低，一般为10-6～10–10。
所以常规育种时间较长，工作量较大。
通过常规育种提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低，效果不明显。
第三章 自然选育和诱变育种
一般从菌落大小也可 以判断，新长出的菌 落较小，即是营养缺 陷型
•四.鉴定营养缺陷型 生长谱法
方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基 倒混 合平板或涂布平板，再在平板上点接各 种营养物质（最好稀释成一定浓度，用滤纸片 法接入），适温培养，观察生长圈。此法可以 在一个平板上对一株菌进行多种营养因子进行 测定 方法二：在基本培养基中加入某种营养物 质，倒混合平板，再点接菌株，观察生长圈。 此法可同时对多个菌株进行测定
基因突变
二、微生物突变的类型
1、 形态突变型 2、致死突变型 3、抗性突变型 4、营养缺陷型突变型
青霉
三、微生物突变的特点 1、 不对应性 2、 自发性 3、 稀有性 4、 独立性 5、 诱变性 6、 稳定性 7、 可逆性
• （四）、自然选育的程序 • • • • 1. 2. 3. 4. 采样 增殖培养 纯种分离 生产性能的测定
一、 产环己酰亚胺新菌株YIM41004 的复合诱变选育
前言：环己酰亚胺（cycloheximide）,又名放线酮 （Actidione），是于1948年德国化学家B.E.Leach 等分离并鉴定出来的一种戊二酰类化合物.它对多 种真菌具有拮抗作用，其制剂具有水溶解性良好、 作用剂量低的优点,在植物保护方面得到广泛应用。
通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株， 该突变型不能产生苏氨酸。
在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长， 并且因为消除了反馈抑制
突变型能过量生产L-赖氨酸
第四节 温度敏感突变株的筛选
一、温度敏感突变株（temperaturesensitive mutant, TS突变体）： 突变株在一定温度范围内（许可温度） 正常生长，其表型和野生型没有区别， 但超出这一温度范围（非许可温度）， 则不能生长或生长微弱甚至死亡（条件 致死）或某些代谢停止或减弱。
微生物的遗传变异和育种
第七章微生物的遗传变异和育种第一节微生物的遗传变异的概述遗传和变异是生物体最本质的属性之一。
所谓遗传，讲的是发生在亲子间的关系，即指生物的上一代将自己的一整套遗传因子稳定地传递给下一代的行为或功能，它具有极其稳定的特性。
而变异是指子代与亲代之间的不相似性。
遗传是相对的，变异是绝对的。
遗传保证了物种的存在和延续，而变异推动了物种的进化和发展。
在学习遗传、变异内容时，先应清楚掌握以下几个概念：（一）遗传型又称基因型，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因组所携带的遗传信息。
遗传型是一种内在可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的特定遗传信息。
具有某遗传型的生物只有在适当的环境条件下，通过自身的代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型。
（二）表型指某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是其遗传型在合适环境下通过代谢和发育而得到的具体体现。
所以，它与遗传型不同，是一种现实性。
（三）变异指在某种外因或内因的作用下生物体遗传物质结构或数量的改变，亦即遗传型的改变。
变异的特点是在群体中以极低的概率(一般为10-5～10-10)出现，性状变化的幅度大，且变化后的新性状是稳定的、可遗传的。
（四）饰变指一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。
其特点是整个群体中的几乎每一个体都发生同样变化；性状变化的幅度小；因其遗传物质不变，故饰变是不遗传的。
例如，Serratia marcescens(粘质沙雷氏菌)在25℃下培养时，会产生深红色的灵杆菌素，它把菌落染成鲜血似的。
可是，当培养在37℃下时，群体中的一切个体都不产色素。
如果重新降温至25℃，所有个体又可恢复产色素能力。
所以，饰变是与变异有着本质差别的另一种现象。
上述的S.marcescens产色素能力也会因发生突变而消失，但其概率仅10-4，且这种消失是不可恢复的。
从遗传学研究的角度来看，微生物有着许多重要的生物学特性：微生物结构简单，个体易于变异；营养体一般都是单倍体；易于在成分简单的合成培养基上大量生长繁殖；繁殖速度快；易于累积不同的最终代谢产物及中间代谢物；菌落形态特征的可见性与多样性；环境条件对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性；易于形成营养缺陷型；各种微生物一般都有相应的病毒；以及存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式等。
第三章微生物育种
制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理 时，应采用相应的缓冲液配制，以防处理过程中pH变化而 影响诱变效果。
三、诱变剂及诱变剂量的选择
复合因子处理中，为了提高诱变效果，在具体使用时还 要注意诱变剂处理先后和协同效应问题。
五、影响突变率的因素
菌种遗传特性 菌体细胞壁结构 培养条件和环境条件 பைடு நூலகம் 诱变前预培养和诱变后培养（突变体的修复、表型迟 延） ➢ 温度、pH、氧气等外界条件的影响 ➢ 平皿密度效应
六、突变体的分离和筛选
微生物通过诱变处理后，群体中产生各种类型突变体，有 正突变、负突变和未突变的菌株，需要经过分离和筛选， 逐一挑选出来。
第一节 诱变育种
诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传 结构和功能，从中筛选出产量高、性状优良的突变株， 并 设计出适合该突变株最佳的培养基和条件，使其在最适的工 艺条件下最有效地合成产物。
诱变育种有以下几个优点：速度快，收效大、方法简单。
诱变育种的三大要素：诱变剂、诱变条件、筛选技术。
分三个阶段：菌种基因型改变， 突变体筛选，产量评估
诱变育种的步骤
•出发菌株的选择与纯化 •单孢子（单细胞）悬液的制备 •诱变剂及诱变剂量的选择 •诱变处理方法 •高产菌株的分离
一、出发菌株
对出发菌株的要求：
(1)从自然界样品中分离筛选出来的野生菌株，虽然产量 较低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高；
通常丝状菌菌株由于遗传分离产生不纯现象，一个多核细胞 经诱变剂处理后，某个核发生有益的突变易被其他尚未突变 的核竞争性地抑制，多核菌体会降低单位存活菌的突变率
第三章突变的应用微生物遗传育种
一、营养缺陷型及其应用
营养缺陷型（auxotroph）：是指丧失了合成一 种或多种必需生长因子能力的菌株，它们只能在 补充了相应的生长因子的培养基上才能正常生长。
野生型（wild type)：从自然界分离到的任何微 生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株，均称 该微生物的野生型。
原养型（prototroph) ：营养缺陷型突变株经回 复突变或重组后产生的、其营养要求在表型上与 野生型相同的菌株。
完全培养基 Complete Medium （CM）含有满 足某微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长 所需营养物质的天然或半合成培养基。
基本培养基Minimal Medium（MM）：不含生 长因子仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要 的最低成分合成培养基。
补充培养基Supplemented Medium(SM)：补充 了一种或数种生长因子，以满足某微生物的特定 的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多 是通过直接添加AA、碱基或维生素而提供。
尽量选择既往诱变史少的高产菌株： 由 自然界分离获得的野生型菌株，突变可 能性较大;经自然分离的生产菌株，对生 产环境适应，又具野生型特性，也是良 好的出发菌株;经过诱变改造的菌株，负 突变可能性较大，可结合其它育种方法 改变其遗传保守性
（一）出发菌株的选择
挑选纯系（遗传纯）菌株：避免使用丝 状真菌菌丝体（异核体）；要尽量选择 单倍体单核细胞（孢子），以减少诱变 菌的分离延迟（结合诱变剂选择）
SAMP
AMP
R-5-P B.subtilis
IMP
(2)
XMP
(1) AMP脱氨酶
GMP还原酶
(3)
GMP
(AK)
高丝氨酸脱氢酶
诱变育种
4．取未照射的制备菌液和照射菌液各0.5ml进行稀释 分离，计数活菌细胞数。 5．取照射菌液2ml于液体培养基中(300ml三角瓶内装 30ml培养液)，120r／min振荡培养4～6h。 6．取中间培养液稀释分离、培养。 7．挑取菌落进行筛选。
化学诱变剂：主要有烷化剂、碱基类似物、吖啶化 合物、脱氨剂等。
1.提高有效产物的产量
包括提高野生菌种和改变菌种的代谢产物和中间 产物的产量。 2.改善菌种特性、提高产品质量 通过诱变育种，除了可以获得高产突变株之外， 还可以选育到一些具有良好性质的变株，包括改 善产品的质量、提高有效组分比例、缩短周期以 及适合发酵工艺要求的变株
3.简化工艺条件
选育出更适合工业化发酵的要求的突变株。(例如选育 孢子生产能力强的变株；泡沫产生少的变株；发酵液黏 度小的变株；抗噬菌体变株；无油的变株；发酵低热变 株；低空气量要求的变株等)。
一、诱变前对出发菌株的了解
1、区分不同菌落类型
一般情况下，在同一种培养基和培养条件下往往会出现 多种形态类型的菌落(2～5种)，从中找出正常性菌落。
2、出现不同菌落类型的原因
①遗传因素决定的 是出现不同菌落类型的主要原因(如自 发突变、回复突变、异核体分离等）。
②非遗传因素引起的（因培养条件的变动，菌种会产生一 些类似遗传的现象，一旦恢复原来的条件，其就会恢复到原 有性状）。
1.培养基是影响孢子形成的重要因素之一，其中碳氮的 种类及浓度对其影响很大。
2.斜面制备技术（培养基的灭菌条件的控制，平板的制 取，琼脂的加入量选择等).
3.移种的密度。
4.温度 温度对菌种影响很大，一般情况下温度高则生 长快，但超过一定范围，则会使生产能力显著下降， 甚至引起变异。
微生物诱变育种
诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传 结构和功能，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性状优 良的突变株， 并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件， 使其在最适的工艺条件下最有效地合成产物。 分三个阶段：菌种基因型改变， 突变体筛选，产量评估 基因突变是微生物变异的主要源泉，人工诱变是加速基因突 变的重要手段。诱变育种有以下几个优点：速度快、收效大、 方法简单。
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生长因子的配制方法： 把同一组的氨基酸粉末混合置于洁净的瓶中，加入灭菌的 蒸馏水，充分溶解，置冰箱保存。 配制浓度：用于放线菌测定的氨基酸约1mg／ml 用于霉菌测定的约10mg／ml 维生素一般0.1mg／ml 生物素、维生素B12约0.01mg／ml 测定方法：缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把 6 组生长因子直接点加于同一琼脂平板上，或用滤纸片沾取 后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两个组区产 生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷的生长因子。
①
天冬氨酰磷酸
天冬氨酸-β-半醛 ASA ② ③ 二氨基庚二酸 DAP 高丝氨酸 Hse
④
高丝氨酸 磷酸 苏氨酸 Thr
⑤
O-琥珀酸 高丝氨酸
赖氨酸
甲硫氨酸 Met
反馈抑制
异亮氨酸 Ile
优先合成
Asp
ASA DDP DAP Lys
Hse Met
Thr Ile
谷氨酸棒状菌、黄色短杆菌
Asp ASA DDP DAP Lys Hse Met Thr Ile Asp ASA DDP DAP Lys Hse Met Thr Ile
挑菌落
初筛 1瓶/株
诱变育种
（二）植物辐射的敏感性差异
诱变处理的材料包括：种子、绿色植物、花 粉、子房、合子和胚细胞、营养器官、离体 培养中的细胞和组织等。 1. 不同的植物辐射敏感性不同 2. 不同品种对辐射敏感性差异很大 3. 同种植物的器官、组织以及发育时间和 生理状况不同，其敏感性也不同 4. 处理前后的环境条件也影响诱变效果
➢ 体细胞变变常会形成嵌合体，不易分离 纯的组织变异。 突变又多是隐性突变， 有利突变性状与不良性状常呈连锁关系， 需要结合有性杂交予以分离。
第二节 物理诱变
物理诱变：用不同种类的射线处理，引起基因突 变或染色体变异。
一、物理诱变剂的种类（表11-1，P186） 紫外线:辐射源是紫外光灯，能量和穿透力低， 能成功地用于处理花粉粒，波长200-390nm。
2. 生理代谢损伤大，容易引起生活力和可 育性下降；
3. 使用所需的设备比较简单，成本较低， 诱变效果较好；
4. 对人体更具有危险性
三、化学诱变处理方法
（一）药剂配制： 1. 化学诱变剂的性质：包括溶解度和毒性； 2.处理浓度：诱变剂的浓度高于种子细胞中的
浓度，浓度也不能过大。 3.处理时间：以使受处理组织完成水解作用以
第四节 诱变育种的方法和程序
一、处理材料的选择
（一）材料的选择 正确地选择诱变处理的亲本材料非常重要， 原则有四点：
1. 首先必须根据育种目标来选择亲本材料； 2. 亲本材料必须是综合性状优良而只具有一、
两个需要改进的缺点；
3. 选用的处理材料应避免单一化； 4. 适当选择单倍体、原生质体和多倍体等 做诱变材料。
能与植物体的遗传物质发生作用，并能改 变其结构，使其后代产生变异的化学物质 称为化学诱变剂。
微生物的遗传变异和诱变育种讲课文档
DNA
ACC A C
CCC
TGG T
G
GGG
mRNA
UGG
GGG
多肽
色氨酸
甘氨酸
第二十页，共82页。
（2）无义突变
碱基改变使编码某一氨基酸的密码子变为终止密码子，使蛋白
质合成中断，产生无活性的多肽，例如：
DNA mRNA
ATA
AGT
UAU（酪氨酸) UCA（丝氨酸）
DNA上 ATT
mRNA
易误修复
基因突变
分离
突变基因型 表达
突变表型 细胞分裂
突变克隆
第二节 基因重组和杂交育种
两个不同生物个体交换遗传物质并进行重新组合以产生具有新基因 型和表型个体的过程。
第三十七页，共82页。
原核生物基因重组的特点
1. 非等量交换; 2. 单向进行的;
供体：提供DNA 受体：接受DNA
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第四十页，共82页。
转化的3个阶段
1 ） 感受态阶段 competence
2 ） DNA的结合和吸收 binding and uptake
3 ） 整合 integration
第四十一页，共82页。
1）感受态阶段 competence
感受态：
受体菌细胞容易接收DNA片断的生理状态。 感受态是细菌的一种遗传特性，并且受培养条件的影响，感
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只能使供体的一 个或少数几个基 因以噬菌体为媒 介转移到受体的 转导作用称为局 限性转导。大肠 杆菌的温和噬菌 体λ只能转导大 肠杆菌的gal或 bio基因。
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两类转导的比较
普遍性转导
局限性转导