《血红蛋白的提取和分离》课件

电 泳 结 果
阳 极
血红蛋白的提取和分离
样品处理 粗 分 离 血液组成成分
1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白
纯 化 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白
纯度鉴定
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血液组成成分 阅读思考： 血浆 和________ 血细胞 两部分组成。 1. 血液由______ 红细胞 细胞数量最多，红细胞的含 2. 血细胞中________ 血红蛋白 量最高的有机化合物是_____________ 。
2、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是 A 调节pH B 维持红细胞的能量供应 C 防止微生物生长 D 防止血液凝固
血红蛋白的提取和分离
样品处理 粗 分 离 血液组成成分
1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白
纯 化 3.分离血红蛋白 4.透析血红蛋白
纯度鉴定
跳转
纯化－－凝胶色谱操作
1.凝胶色谱柱的制作： 2.凝胶色谱柱的装填： 3.样品的加入和洗脱 教材图5－19
基础知识
（一） 凝胶色谱法
1、凝胶色谱法的别名：分配色谱法 是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 2、依据的特性 3、凝胶实质
①性质：一些微小的多孔球体，球内含许多贯穿的通道；
蛋白质分子量的大小。
②化学本质：多糖类化合物： ③实例：葡聚糖、琼脂糖： 4、原理
基础知识
（一） 凝胶色谱法
原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对（分子质量较小 ）的蛋白质容易进入 凝胶内部的通道，路程（ 较长 ），移动速 度（ 较慢 ），而（ 相对分子质量较大） 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能 在（ 凝胶外部 ）移动，路程（ 较短 ）， 移动速度（ 较快 ），相对分子质量不同 的蛋白质因此得以分离。
3.样品加入与洗脱
注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
3.样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降 到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加 样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏 凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当 高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集 流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如 果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、 贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。
CO
NH
脱水缩合 肽链 （n条） 盘曲折叠
7、分子结构 氨基酸
蛋白质
8、蛋白质多样性的原因：
(多样性的根本原因)
氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多 端；多肽链的空间结构千差万别
9 、蛋白质的鉴定方法 双缩脲试剂 10、生理功能 细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的 主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切 生命活动的主要承担者
(2)血红蛋白的释放：
加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯， 置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破 裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。
磁力搅拌器
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2、粗分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min的速度离心10 min。 ②试管中溶液层次：4层。 ③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于 分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
蛋白质分子的差异性
凝胶色谱法 凝胶电泳法 缓冲溶液 蛋白质的 原 组 理 成 分离过程 作 用
样品处理
粗 分 离 纯 化
提取分离
纯度鉴定
3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电
荷（
A相同
B
）的电极移动。
B相反 C相对 D相向
4.
哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（
氧气的运输有关。
A
）与
A血红蛋白
（二）、缓冲溶液 缓冲溶液－－洗脱剂 组成：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。 如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠， NaH2PO4/Na2HPO4等
作用： 抵制外界酸碱对溶液pH的干扰，保持 pH与体 内环境基本一致。
基础知识
（三）电泳
基础知识
（三）电泳
阅读第65页的相关内容，回答以下问题：
C肌动蛋白
B肌红蛋白
D肌球蛋白
5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（
含量最多。
C
）的
A白细胞
的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判
断分离效果？
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确 的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、 平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散
乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的
装填有关。
知识总结
血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离
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实验操作
（二）凝胶色谱操作
2.凝胶色谱柱的装填 1、凝胶的选择材料? G代表意义? 2、简单步骤？ 3、注意点：
1、选择交联葡聚糖凝胶（G-75） “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围, 75表示凝 胶的吸水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。
2、固定色谱柱－－配凝胶悬液－－装填色谱柱－－ 洗涤平衡
A
• 下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操 作，其中正确的是（ A ） • A．可采集猪血作为实验材料 B．用蒸馏水重复洗涤红细胞 • C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流 出液
三、实验结果分析与评价
1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处 理后的样品发生了哪些变化吗？ 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科
课题3 血红蛋白的提取和分离
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 1、含量
占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物
2、组成元素
C、H、O、N 高分子化合物 H
3、相对分子质量
4、基本组成单位： 氨基酸 结构简式： 种类：
R
C NH2
COOH
5、氨基酸连接方式
脱水缩合
知识回顾--------有关蛋白质的几个问题： 6、肽键
书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、
未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时
间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到
纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色
谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱
• 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量 大的蛋白质 D • A．路程较长，移动速度较慢 B ．路程较长，移动速度较快 • C．路程较短，移动速度较慢 D ．路程较短，移动速度较快
• 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中 的进行过程可表示为图中哪一个
•B
（二）、缓冲溶液 1、 之前在什么地方遇见过缓冲物质？ 2、 缓冲物质有哪些？作用是什么？ 3、 本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？
(三)电泳 （2）类型： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)
（3）SDS作用
为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶 中加入SDS。
电 泳 结 果 阳 极
使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋 白质的电泳迁移率完全取决于 A 电荷的多少 B 分子的大小 C 肽链的多少 D 分子形状的差异
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装配好的凝胶柱
色谱柱的制作过程：准备材料→加工 橡皮塞→安装色谱柱
（二）凝胶色谱操作
（1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸 磨平。 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→ 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一 端。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。
收集得到的纯化后的血红蛋白
• 样品的加入和洗脱的操作不正确的是 • A． 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面 • B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶 床内 • C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 • D．用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱 柱的顶端，不要破坏凝胶面
试管中溶液层次
第1层（最上层）：甲 苯层（无色透明） 第2层（中上层）：脂 溶性物质沉淀层（白色 薄层固体）
第3层（中下层）：血红 蛋白的水溶液层（红色透 明液体） 第4层（最下层）：杂质 沉淀层（暗红色）
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4.透析血红蛋白
练习巩固
1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋 白质的研究和应用越来越深入，首先要 做的一步是 A 弄清各种蛋白质的空间结构 B 弄清各种蛋白质的功能 C 弄清各种蛋白质的合成过程 D 获得高纯度的蛋白质
1、电泳的概念；
2、电泳的原理； 3、电泳的种类； 4、SDS的作用。
(三)电泳 1.电泳的概念 指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程. 2．凝胶电泳法： （1）原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团， 在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电 极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本 身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现 样品中各种分子的分离。
2条β-肽链 2条α-肽链 和____________ 3. 该化合物是由 _____________ 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和
亚铁血红素 基团。 CO2结合的___________ 返回
1.洗 涤 红 细 胞
阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤过程： 3g柠檬酸钠 血液 100mL 低速离心 2 min
吸出血浆 5倍体积生理盐水
血
浆
红细胞
搅拌10min
红细胞
重复洗涤3次，直至上清液没有黄色
采集得到猪血
初次离心后的结果
3次洗涤后的结果
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阅读思考：
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2.释放血红蛋白
1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了
哪些物质？
2. 为了加速释放过程，采取了什么措施？
①目的分析：
使红细胞大量吸水胀裂 ②蒸馏水的作用是______________________________ 。 溶解红细胞的细胞膜 ③加入甲苯的作用是____________________________ 。 加速红细胞的破裂 ④充分搅拌的目的是____________________________ 。
旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得
均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色 葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如
果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。 如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气 泡，消除不了时要重新装柱。
3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带
一、基础知识--蛋白质提取和分离原理
1、选用一定的物理或者化学方法分离具有不同 物理或化学性质的生物大分子。
2、形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸 附性质、亲和力等千差万别。 提取 分离 方法
凝胶色谱法
基础知识
（一） 凝胶色谱法
阅读并回答 （P64） 1、凝胶色谱法另一个名称是什么？ 2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据是什么？ 3、凝胶的实质是什么？ 4、凝胶色谱法的原理是什么？
血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚 铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二 氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。
血红蛋白的提取和分离
本课题的主要内容如下：
样品处理 及粗分离
方法原理
纯
化
方法原理
凝胶色谱法
纯度鉴定
方法原理
电
泳
一、基础知识:
样品处理及粗分离的原理: 1 、分离生物大分子的基本思路是什么？ 2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？ 3 、为什么不用鸡的血红细胞而用猪的血红细胞作为 实验材料？ 4 、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质？
3、凝胶色谱柱的装填注意事项：
（1）、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的 空隙。 （2）、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅 乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 （3）、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡 混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的 分离效果。 （4）、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。