感受态细胞和质粒DNA的转化(C)

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质粒的转化实验报告

一、实验目的1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。

2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。

3. 学会筛选和鉴定转化子。

二、实验原理质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。

通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。

本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。

三、实验材料1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）2. 受体菌：大肠杆菌DH5α3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。

（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。

（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。

（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。

（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。

（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。

（7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。

2. 筛选和鉴定转化子（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。

（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。

（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。

（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。

五、实验结果1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。

2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。

3. 阳性克隆PCR产物与预期相符，测序结果验证目的基因正确导入。

实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告

感受态细胞总数＝对照组1菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查明可能的失败原因。
实验四大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受态细胞。
实验原理实验材料实验步骤预期结果注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出，冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素

(完整word版)质粒转化流程

质粒转化流程：（以下操作如无特别说明均在超净台中操作）
1.取一管感受态细胞，待感受态细胞在冰上融化后，取1µl质粒DNA或20µl连接产物与
之混合(质粒DNA的用量不超过50ng)，冰浴30min。

2.42℃水浴90s。

3.冰浴5min。

4.加入800µl不含抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床培养45min。

5.5000rpm离心3min，吸去800µl上清。

6.将剩余200ul菌液重悬，加入倒有含抗生素的LB固体培养基平板上，用涂布棒涂均匀。

7.正置数分钟，待菌液稍干，放入37℃培养箱中倒置培养，12-16个小时后可观察到菌落
形成。

8.第二天上午挑取单菌落于1ml含有抗生素的LB液体培养基中37℃摇菌。

9.晚上将摇起来的菌株每管加入500ul 50%无菌甘油，于-70℃中冻存。

注：可做一组阴性对照，即用无菌水取代质粒，与感受态细胞混合，其余操作相同，平板上应无法长出菌落。

连接产物的转化应设一组用线性化载体的阴性对照和空载体的阳性对照。

质粒DNA转化感受态大肠杆菌 protocol

质粒DNA转化感受态大肠杆菌一、实验原理转化（transformation）是将一种生物（供体）的遗传物质（通常为DNA）转入另一种生物（受体）并使其在受体中得以保存和繁殖的过程。

大肠杆菌不是天然感受菌，在低温（0~5℃）环境下经CaCl2处理，细胞壁变松变软后能摄入外源DNA，这种状态称为感受态细胞（competent cell）。

质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

二、实验材料准备1. 器材微量移液取样器，移液器吸头，恒温水浴锅，制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，1.5 ml Eppendorf管，50 ml离心管，乳胶手套，恒温培养箱2. 试剂LB液体培养基、LB固体培养基、100mg/ml 氨苄青霉素(或卡拉霉素) 、感受态细胞3. 材料处理转化之前超净台紫外照射15-20min；枪头、50ml离心管需提前灭菌，烘箱烘干；液体LB培养基灭菌后放到冷库，防止长菌；三、转化1．从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,置冰上解冻1-2 min。

2．加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟。

3．42℃水浴中热击90秒, 然后迅速置冰上2min，整个过程不要振荡菌液。

4．向管中加入200μl LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养（225 rpm）1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

5. 将上述菌液摇匀后涂布于含Amp（或kna）的LB琼脂平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后,37℃倒置培养12-16小时。

四、注意事项1.加液体LB培养基之前观察其是否长菌2.玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂3.提前打开水浴锅，将温度调到42度4.实验目的是表达蛋白，可热击完直接涂平板；目的是质粒扩增或后续要PCR，需在热击后37℃振荡培养复苏1小时5.实验室常用的用于质粒扩增的感受态菌是Top10，用于质粒表达的感受态菌是BL21 Star(DE3)。

质粒转入感受态细菌的原理

质粒转入感受态细菌的原理
质粒转入感受态细菌的原理是通过一种称为转化的机制进行的。

转化是细菌之间通过吸收外源DNA并将其融合到自身基因组中的过程。

感受态细菌是对外源DNA（如质粒）具有接受能力的细菌。

转化包括以下几个步骤：
1. 准备感受态细菌：通常使用复苏液处理细菌，复苏液中包含一些醣化剂或离子（如Ca2+）等物质，可以使细胞膜变得更容易渗透。

2. 吸收外源DNA：将质粒与感受态细菌一起暴露在低温、高电压或添加特定溶液条件下，使质粒能够进入细菌细胞。

3. DNA融合：在感受态细菌内，外源DNA通过DNA酶等酶的作用，与细菌染色体发生重组。

这样，外源DNA的片段可以被整合进细菌基因组中。

通过上述步骤，质粒可以被转入感受态细菌中。

感受态细菌在接受外源DNA后，它可能会表达质粒中的基因，从而产生质粒编码的特定蛋白质。

这种转化的机制被广泛应用于基因工程和遗传学研究中。

直接给出感受：通过质粒转化的过程，感受态细菌可以获得质粒中所携带的额外基因信息，这些额外基因信息可以被细菌利用，产生新的蛋白质，赋予细菌新的
功能或性状。

大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]

• 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。
行业知识
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
行业知识
③ 彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ； ④ 4000r／min离心10min； ⑤ 弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。
行业知识
• 质粒DNA的转化
① 分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作：
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
行业知识
• 实验目的 • 实验原理 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
行业知识
一、实验目的
• 了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
• 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
• 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
行业知识
四、实验步骤
• 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培养;
②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置 10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；

〖医学〗感受态细胞的制备与质粒DNA的转化

感受态细胞的制备与质粒DNA的转化
一、实验原理
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞, 使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl) 等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞 (Competent cells)。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源 DNA分子的受体细胞)。
实验结果:下次实验观察并分析筛选结果
四、注意事项
➢ 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素: 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌,最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好,可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右 (不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
四、注意事项
➢ 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
➢ 4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
五、质粒DNA转化常见问题

EColi感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定

溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2＋）结合，降低DNase对DNA的降解。
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构
色，可确定DNA在胶中的位置。影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：
DNA的分子大小；琼脂糖浓度； DNA构象；电场强度；碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。
三．实验材料与设备：
1、用品与与仪器：超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头、烧杯、量筒
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置2～3min；
溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep 管中；
7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放置2min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约 8min)，存于－20℃或直接用于酶切。

感受态细胞和质粒DNA的转化

⑧ 取出后稍加离心，去掉部分上清，留500uL或250mL LB则全部铺板。
⑨ 取100~200uL，臵于有选择性标记的琼脂培养皿上，用无菌玻
璃棒涂匀；静臵5~10分钟。
⑩ 倒臵37℃培养12~18小时(一般过夜)；次日，挑选单菌落，扩增，提取DNA酶切，电泳检测，筛选重组子。并设下列对照： A．不加需转化的DNA溶液（用蒸馏水或LB培养基代替）。ห้องสมุดไป่ตู้B．用普通LB琼脂平板代替有选择性标记的琼脂平板。 DNA超螺旋转化最好
抗生素的配制
抗生素
工作浓度松驰型质粒 60ug/mL 严紧型质粒 20ug/mL
氨苄青霉素(Amp) 50mg/mL（水）氯霉素(Cm) 卡那霉素(Kan)
34mg/mL（乙醇） 50ug/mL（水）
170ug/mL 50ug/mL
25ug/mL 10ug/mL
链霉素(Sm)
四环素(Tc)
10mg/mL（水）
处使DNA鲜旋。 ③ 线状DNA 琼脂糖(Agrose)电泳可将这三种构型的DNA分开，Agrose电泳中 cccDNA位置最前。
二、阅读微生物的基因型符号
在描述一个微生物的品系时，最重要的事就是区分它的基因型和表现型。基因型说明它的遗传决定子，这是看不见的特性；而表现型反映的是可观察到的特性。 1．由于一个微生物的基因组中有成百个基因。因此，一般而言，在描述一个品系的基因型时只给出它与野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些与野生型相同的基因。也就是说，在它们名称后面所给出的是这些品系的基因组中发生了突变的基因。如：某菌，trp、his和 metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突变了的，其他基因组仍然正常。在上下文贯通地具体描述微生物的某个基因 (如trp) 时，可以用 trp+，或者只是简单地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到它时都写作trp+。有些突变型是缺失突变，就用△表示，如△lon表示 lon基因的缺失突变。

口腔生物学第三章练习题

选择题1. 1953年Watson和Crick提出（ A ）。

A．多核苷酸DNA链通过氢键连接成一个双螺旋 B．DNA的复制是半保留的，常常形成亲本-子代双螺旋杂合链 C．三个连续的核苷酸代表一个遗传密码 D．遗传物质通常是DNA 而非RNA E．分离到回复突变体证明这一突变并非是一个缺失突变2. DNA以半保留方式复制如果一个具有放射性标记的双链DNA分子在无放射性标记的环境中经过两轮复制。

其产物分子的放射性情况如何( A )。

A其中一半没有放射性 B都有放射性 C半数分子的两条链都有放射性 D都不含放射性质粒是一种细菌细胞内独立于染色体外的___DNAA. 线状B.环状C. 颗粒状D. 网状E. 不规则形答案：B1.RNA聚合酶特异性识别结合和启动转录的DNA序列是：（B）A.增强子B.启动子C.沉默子D.终止子2.转染的定义是：（C）A.将外源性的DNA分子导入原核细胞的过程B.利用噬菌体颗粒为载体，将外源性DNA导入受体细菌的过程C.将外源性的DNA分子导入真核细胞的过程D.其它以下哪个不是基因的点突变：A1.( C)是蛋白质合成的模版A tRNAB DNAC mRNAD 以上都不对2.64个密码子中，有（A）个是终止密码子A 3B 4C 5D 61. 遗传密码的性质:(E)A.所有的密码都是由3个连续的核苷酸组成，相邻的两个密码之间没有间隔的核苷酸存在；B.64个密码子中，有3个是终止密码（UAA、UGA、UGA)，其余61个都能编码氨基酸，其中AUG是起始密码；C.密码具有简单性D.密码具有通用性.E.以上全是2遗传病是指遗传物质的结构或功能发生改变引起的疾病，牙周病属于：（C）A.染色体病B.单基因病C.多基因病D.线粒体病.E.体细胞遗传病1.启动子通常含有以下哪些元件：eA.TATA框B.CAAT框C.GC框D.A和BE.A,B,C1;除了那个选项，都是釉质的主要蛋白质：bA.釉原蛋白B.胶原蛋白C.釉蛋白D.成釉蛋白E.釉丛蛋白1、转导是（C）A 将外源性的DNA分子导入原核细胞的过程。

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及质粒转化方法研究一、本文概述本文旨在深入研究枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备方法，以及质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。

文章首先将对枯草芽孢杆菌的生物学特性进行简要介绍，包括其生理结构、生长环境及其在生物技术领域的重要地位。

随后，将详细阐述感受态细胞制备的原理和步骤，包括细胞的诱导、处理和保存等关键环节，并对不同方法进行比较分析，以找出最佳制备条件。

在此基础上，本文将深入探讨质粒转化技术在枯草芽孢杆菌中的应用。

质粒转化作为一种高效的基因转移手段，对于枯草芽孢杆菌的遗传改造和功能研究具有重要意义。

文章将详细介绍质粒转化技术的操作流程，包括质粒的选择、转化条件的优化以及转化效率的评价等方面。

本文还将对枯草芽孢杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法的应用前景进行展望。

随着生物技术的不断发展，这些方法在基因工程、生物制药、环境修复等领域的应用潜力将逐渐显现。

通过本文的研究，旨在为相关领域提供可靠的技术支持和实践指导。

二、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备制备枯草芽孢杆菌感受态细胞是质粒转化的关键步骤之一，它涉及到细胞的生长、处理和储存等多个环节。

以下是详细的制备过程：菌种复苏与活化：从低温保存的菌种库中取出枯草芽孢杆菌菌种，在LB固体培养基上进行划线接种，然后将其置于37℃恒温培养箱中倒置培养，待菌落长出后，挑选单个菌落进行活化。

种子液制备：将活化后的菌落接种到LB液体培养基中，以一定的转速（如200rpm）在37℃下振荡培养，直至达到对数生长期。

感受态细胞制备：将种子液按照一定比例接种到新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4~6。

然后，将培养液转移到预冷的离心管中，冰浴10分钟，以4℃、4000rpm的条件离心10分钟，收集菌体。

细胞处理：去除上清液，用预冷的感受态细胞洗涤液轻轻悬浮菌体，冰浴10分钟，再次离心收集菌体。

重复此步骤一次，以彻底去除培养基中的盐分。

感受态细胞和质粒DNA的转化(C)

质粒DNA可以用于基因治疗，将正常的基因导入病变细胞，纠正或补偿缺陷基因。
质粒DNA可以用于构建转基因植物、动物和微生物，用于生物工程领域的研究和应用。
03
感受态细胞与质粒DNA的转化过程
转化方法
CaCl2法
通过使用CaCl2处理细胞，使细胞处于易于吸收外源DNA的状态，然后加入质粒DNA进行转化。
在基因工程领域的应用
基因克隆与鉴定
将目的基因插入质粒中，通过转化感受态细胞实现基因克隆与鉴定。
基因敲除与突变
利用感受态细胞将突变基因导入细胞，实现基因敲除或突变。
基因表达分析
通过将目的基因导入感受态细胞，分析目的基因的表达情况，研究基因功能。
转化技术的发展与展望
技术优化
不断优化感受态细胞的制备和转化条件，提高转化效率和稳定性。
应确保质粒DNA的浓度、纯度和分子量符合要求，以提高转化效率。
转化液的选择
根据不同的转化方法选择适当的转化液，如CaCl2溶液或电穿孔缓冲液。
转化效率
影响因素
感受态细胞的制备、质粒DNA的质量、转化液的选择、温度、pH 值等都会影响转化效率。
提高转化效率的方法
优化感受态细胞的制备条件、选择高质量的质粒DNA、调整转化液成分、控制适宜的温度和pH值等。
感受态细胞和质粒DNA的转化
目
CONTENCT
录
• 感受态细胞介绍 • 质粒DNA介绍 • 感受态细胞与质粒DNA的转化过程 • 转化后的筛选与鉴定 • 感受态细胞与质粒DNA转化的应用
与展望
01
感受态细胞介绍
感受态细胞的定义
感受态细胞是指在特定条件下，能够接受外源DNA并使其转化进细胞内的细菌细胞。

质粒转化42摄氏度热激作用

质粒转化42摄氏度热激作用
质粒转化是将外源 DNA 导入受体细胞的过程，其中一个关键步骤是热激作用。

在质粒转化过程中，将感受态细胞与质粒 DNA 混合后，需要进行热激处理，以提高转化效率。

热激的温度通常为 42°C，这是因为在这个温度下，细胞膜的通透性会增加，使得质粒 DNA 更容易进入细胞。

此外，热激还可以诱导 SOS 反应，激活一系列与 DNA 修复和重组相关的基因，从而促进质粒 DNA 的整合和表达。

热激的时间通常为 90 秒到 2 分钟不等，具体时间取决于使用的感受态细胞和质粒 DNA 的性质。

过长或过短的热激时间都可能会影响转化效率。

需要注意的是，热激处理可能会对细胞造成一定的伤害，因此在进行质粒转化时，需要选择适当的感受态细胞和质粒 DNA，并控制好热激的时间和温度，以确保转化效率和细胞的存活率。

42°C 的热激作用在质粒转化过程中起到了关键的作用，它可以提高细胞膜的通透性，促进质粒 DNA 的整合和表达，从而提高转化效率。

感受态细胞的制备及重组质粒的转化PPT课件

-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；
❖经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发
生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。
experiments of molecular biology
7
❖ 转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。
感受态细胞的制备及重组质粒的转化
experiments of molecular biolog1y
重组DNA技术
分：分离外源基因目的基因。
切、接：利用酶学方法，将外源基因与载体连接，形成复制子。
转：转化宿主细胞，使复制子可以扩增复制。
筛：筛选含有目的基因的细胞(转化子) 并扩增以获得目的基因克隆。
转化是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。
experiments of molecular biology
5
转化的方法
❖ 化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克处理将载体DNA分子导入受体细胞。
❖ 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。
注
意
experiments of molecular biology
19
思考题
1、影响CaCl2法转化率的因素有哪些？如何提高转化率？
2、如何利用抗性筛选出重组克隆？
experiments of molecular biology
20
experiments of molecular biology

感受态细胞的制备和质粒的转化实验

生物工程大实验学院：生命科学学院专业： 10级生物工程班级：三班姓名：林冬学号：指导教师：肖露老师感受态细胞的制备和质粒的转化实验一．实验目的：1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。

2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。

二．实验原理：细菌吸收外源DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。

有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态，如本实验所用的大肠杆菌。

用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。

对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。

这种转化方法称为“化学法”。

三．材料：设备与试剂四．实验方法：①取100mlDH5ɑ培养物置于冰浴中10min，同时将0.1mCacl2和灭菌的50ml离心管4℃中放置10min.②在无菌条件下将培养物移入50ml离心管中（不能超过2/3体积约30ml）平衡后对称放入离心机，在4℃，6000转/min,离心5min,停止离心后，弃上清液（在超净工作上无菌条件下操作）③加入5ml预冷的0.1molCacl2溶液，用涡旋振荡器振荡均匀使DH5ɑ细胞重新悬浮，置于冰水浴中旋转20min后，在4℃6000转/min离心5min,弃上清。

④细胞重复③一次，离心后弃上清，沉淀后用4mlCacl2悬浮，加灭菌甘油至浓度15％左右，混匀后分装于1.5mlEP管中，200ul/管，于80℃冰箱中冻存备用。

转化实验：200ul感受态→加入1ul质粒混匀→42℃水浴90s→迅速拿出置于冰浴2min→加入800ulLB培养基→37℃，220rpm振荡培养1h→取出100ul涂板。

单菌落扩大培养用接种环挑单菌落接入含150ml液体LB培养基锥形瓶中。

37℃，120rpm摇瓶培养，直至透过菌悬液看报纸上的字能够看出形状但不能辨认。

质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤

质粒 DNA 的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤【原理】转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。

转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶( R- ， M- )。

将对数生长期的细菌(受体细胞)经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。

进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。

将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子(带有异源 DNA 分子的细胞) 。

本实验采用 CaCI2法制备感受态细胞。

其原理是细胞处于 0〜4 C, CaCI2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。

转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经 42 C 90 秒热激处理,促进细胞吸收 DNA 得合物。

将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间, 促使在转化过程中获得的新的表型, 如氨苄青霉素耐药 ( Amp r )得到表达,然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上,倒置培养过夜,即可获得细菌菌落。

本实验是将人 BcI-2重组质粒转化 DH5 a 扩增菌，转化后在含 Amp 的培养基上进行筛选,生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。

含人 BcI-2 重组质粒的 DH5 a 菌用于质粒 DNA 的扩增,获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物 DNA 。

试剂与器材】4 ．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成 100mg/mI5 .人 BcI-2重组质粒它是 Eco R I 单酶切的 pBluescript n KS(-)载体与 EcoR I 单酶切的人 BcI-2 cDNA 重组而成的,大小为 4 861bp ,前者是一种由 pUC19 质粒衍生而来的具有2 961bp 的质粒载体。

新手入门：质粒的转化,满满干货

新手入门：质粒的转化，满满干货原理：在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后，受体细胞的膜通透性发生改变，质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子，进入到细菌体内而实现扩增。

感受态细胞：是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。

在基因工程中，用于转化的受体菌（Restriction-Modification 缺陷变异株，以防止对导入外源DNA进行切割）一般通过诱导的方式实现。

主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。

由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

质粒的转化主要包含Ⅰ感受态细胞制备Ⅱ质粒DNA转化Ⅲ质粒DNA的提取（Ⅰ）感受态细胞制备1）从新活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2）将该菌悬液按照1:100转接到液体培养基中，100ml，37℃振荡扩大培养，2~3h。

当培养液开始浑浊时，间段性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。

3）培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20min，0℃-4℃离心10min （4000r/min）。

4）弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。

5）加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30min。

（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率）6）4℃离心10min（4000r/min）。

7）弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。

8）可直接用于实验，4℃保存。

也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。

（Ⅱ）质粒DNA的转化1）取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒1ul DNA混匀,同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。

冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最-后一点冰融化后，迅即加入DNA. 解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。