联合应用NK细胞及CTL对黑色素瘤B16细胞的影响

・基础研究・联合应用ＮＫ细胞及ＣＴＬ对黑色素瘤Ｂ１６细胞的影响余少鸿１，汤荣春１，ＰｅｒＨＢａｓｓｅ２（１．云南省昆明市第一人民医院普外科　６５００１１；２．美国匹兹堡大学肿瘤中心，宾夕法尼亚州匹兹堡１５２１３‐１８６３） 摘　要：目的　探讨联合应用自然杀伤（ＮＫ）细胞及细胞毒Ｔ细胞（ＣＴＬ）对黑色素瘤Ｂ１６细胞的作用。

方法　提取ＮＫ细胞及ＣＴＬ，分别用白细胞介素‐２（ＩＬ‐２）（６０００ＩＵ／Ｌ）、ＩＬ‐２（６００ＩＵ／Ｌ）及植物血凝素（８μｇ／ｍＬ）活化，流式细胞仪检测细胞表面受体，将ＮＫ细胞及ＣＴＬ互为靶细胞及效应细胞进行细胞毒性实验；以黑色素瘤Ｂ１６细胞为靶细胞检测ＣＴＬ的杀伤率。

结果　ＮＫ细胞表面受体ＮＫ１．１＋的百分比在８７％以上，ＮＫｐ４６＋在９０％以上；ＣＴＬ表面受体的百分比在ＣＤ３＋９９％以上，ＣＤ８＋在９８％以上。

ＮＫ细胞与ＣＴＬ相互无细胞毒性，联合应用ＮＫ细胞与ＣＴＬ明显增加对黑色素瘤Ｂ１６细胞的杀伤作用。

结论　联合应用ＮＫ细胞及ＣＴＬ对黑色素瘤Ｂ１６细胞有协同杀伤作用。

关键词：黑色素瘤，实验性；Ｔ淋巴细胞，细胞毒性；自然杀伤细胞ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１‐８３４８．２０１２．０９．００１文献标识码：Ａ文章编号：１６７１‐８３４８（２０１２）０９‐０‐０ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｏｎＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓＹｕＳｈａｏｈｏｎｇ１，ＴａｎｇＲｏｎｇｃｈｕｎ１，ＰｅｒＨＢａｓｓｅ２（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ′ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＫｕｎｍｉｎｇ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５００１１，Ｃｈｉｎａ；２．ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１５２１３‐１８６３，ＵＳＡ．）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）ｃｅｌｌｓａｎｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ（ＣＴＬ）ｏｎＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ａｎｄａｃｔｉｖａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐２（ＩＬ‐２）（６０００ＩＵ／Ｌ），ＩＬ‐２（６００ＩＵ／Ｌ）ａｎｄｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（８μｇ／ｍＬ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐ‐ｔｏｒｓ．ＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｗｅｒｅｓｅｒｖｅｄａｓｔａｒｇｅｔａｎｄｅｆｆｅｃｔｏｒｃｅｌｌｓｅａｃｈｏｔｈｅｒ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｔｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄ．Ｂ１６ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｓｔｏａｓｓａｙｔｈｅｋｉｌｌｉｎｇｒａｔｅｏｆＣＴＬ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＮＫｃｅｌｌｕｌａｒｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒＮＫ１．１＋ｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ８７％，ＮＫｐ４６＋ｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ９０％．ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＣＴＬｓｕｒｆａｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒＣＤ３＋ｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ９９％，ＣＤ８＋ｗａｓｍｏｒｅｔｈａｎ９８％．ＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｓｈｏｗｅｄｎｏｍｕｔｕａｌｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ａｎｄｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓｏｎＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆＮＫｃｅｌｌｓａｎｄＣＴＬｐｏｓｓｅｓｓｅｓｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｎｍｅｌａｎｏｍａｃｅｌｌｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｅｌａｎｏｍａ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ；Ｔ‐ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ；ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｃｅｌｌｓ 细胞免疫在肿瘤免疫中发挥重要的作用，其中，自然杀伤（ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ，ＮＫ）细胞及细胞毒Ｔ细胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏ‐ｃｙｔｅ，ＣＴＬ）是体内主要的免疫细胞［１］。

研究表明，白细胞介素‐２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐２，ＩＬ‐２）及血凝素激活的ＣＴＬ体外能有效破坏肿瘤细胞［２］。

ＣＴＬ能够识别结合主要组织相容性复合体（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）Ⅰ类抗原及来源于小鼠及人类多种肿瘤细胞的多肽抗原。

临床及动物实验表明，ＭＨＣⅠ类抗原限制性导致ＣＴＬ不能有效杀灭肿瘤细胞。

下调肿瘤细胞表面人类白细胞抗原（ｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）是肿瘤细胞逃避ＣＴＬ攻击的重要原因之一［３］。

研究表明ＭＨＣⅠ类抗原部分或全部缺失是黑色素瘤对ＣＴＬ不敏感的因素之一［４‐５］。

ＮＫ细胞表达自杀相关因子配体（ｆａｃｔｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｕｉｃｉｄｅｌｉｇａｎｄ，ＦａｓＬ）、颗粒酶Ｂ（ｇｒａｎｚｙｍｅＢ，ＧｚｍＢ）及穿孔素（ｐｅｒｆｏｒ‐ｉｎ）。

ＮＫ１．１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６活化时表达活化性受体ＮＫＧ２Ｄ（ｎａｔｕｒａｌ‐ｋｉｌｌｅｒｇｒｏｕｐ２，ｍｅｍｂｅｒＤ），同时，ＮＫ细胞分泌大量细胞因子［如肿瘤坏死因子α（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒａｌ‐ｐｈａ，ＴＮＦ‐α）、ＩＬ‐１２及干扰素α（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎα，ＩＦＮ‐α）］，通过Ｆａｓ‐ＦａｓＬ、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（ｔｕｍｏｒｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ，ＴＲＡＩＬ）、ＮＫＧ２Ｄ‐主要组织相容性复合体‐Ⅰ类分子链相关蛋白Ａ（ｍａｊｏｒｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｃｏｍ‐ｐｌｅｘｃｌａｓｓⅠｃｈａｉｎ‐ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＡ，ＭＩＣＡ）等途径，抑制肿瘤细胞增殖及分化，促进肿瘤细胞凋亡。

研究表明，ＮＫ细胞可直接杀伤血液循环的肿瘤细胞及肿瘤组织［６］，并且对黑色素瘤肺转移也有抑制作用［７‐８］。

细胞因子ＩＬ‐２可调节其杀伤及分泌功能［９］。

ＮＫ细胞可识别靶细胞“非己”性改变，能够识别无ＭＨＣ表达或ＭＨＣ低表达的肿瘤细胞，有利于靶向定位于肿瘤及转移部位［１０］，而ＣＴＬ能够识别结合ＭＨＣⅠ类抗原的肿瘤细胞，因此，推测联合应用ＮＫ细胞及ＣＴＬ可提高对肿瘤细胞的抑制作用。

１　材料与方法１．１　动物及肿瘤细胞培养　Ｃ５７ＢＬ／６雌性裸鼠购自Ｊａｃｋｓｏｎ实验室，匹兹堡大学肿瘤中心无菌环境饲养，８～１２周龄。

黑色素瘤Ｂ１６细胞为匹兹堡大学肿瘤中心实验室保存培养，于ＲＰＭＩ１６４０培养基（含１０％灭活小牛血清、２ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酰胺、０．８ｇ／Ｌ链霉素及１．６×１０５Ｕ／Ｌ青霉素）中常规培养。

１．２　ＮＫ细胞及ＣＴＬ的分离培养、纯化及表面受体检测　断颈处死Ｃ５７ＢＬ／６裸鼠，取脾脏磨碎，离心５ｍｉｎ（离心半径８ｃｍ，１２００ｒ／ｍｉｎ），溶解红细胞３ｍｉｎ，再离心、过滤，制成脾单细胞悬液，计数，置于Ｔ７５培养瓶中，并加入２５ｍＬ细胞条件培养基及６０００ＩＵ／ｍＬＩＬ‐２培养。

２天后，用抗白细胞分化抗原（ｃｌｕｓｔｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ＣＤ）３抗体磁珠（美国ＤｙｎａｌＢｉｏ‐ｔｅｃｈ公司）纯化，敲除Ｔ细胞，制成ＮＫ细胞；再加入６０００ＩＵ／ｍＬＩＬ‐２（美国ＣｈｉｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ公司）培养２～３天后，制得活化ＮＫ（ａｄｈｅｒｅｎｔＮＫ，Ａ‐ＮＫ）细胞。

收获细胞，将每管０．５ｍｏｌ／Ｌ细胞离心、取沉淀、混匀，分别加入抗体ＮＫ１．１、ＮＫｐ４６、ＣＤ３、ＣＤ４及ＣＤ８，采用流式细胞仪（ＦＡＣＳ）检测其表面受体。

脾单细胞悬液的制备同上，加入８μｇ／ｍＬ植物血凝素（美国ＤＩＦＣＯ公司）及６００ＩＵ／ｍＬＩＬ‐２进行培养。

２天后，可见大量细胞聚集成团，静置５～７ｍｉｎ，小心吸弃上清液，即可获得细胞团块，再加入６００ＩＵ／ｍＬＩＬ‐２培养２天，即可制得ＣＴＬ。

１．３　ＮＫ细胞及ＣＴＬ功能的检测　将５１Ｃｒ溶液与靶细胞（ＮＫ细胞或ＣＴＬ）混合，于３７℃培养１ｈ左右，洗去游离５１Ｃｒ后，即可得到５１Ｃｒ标记的靶细胞。

收集ＣＴＬ或ＮＫ细胞为效益细胞，将待检细胞毒性的细胞与５１Ｃｒ标记的靶细胞混合４ｈ，用γ射线测量仪检测上清液的放射性每分钟计数（ｃｏｕｎｔｓｐｅｒｍｉｎｕｔｅ，ＣＰＭ）值，根据公式即可计算出ＮＫ细胞及ＣＴＬ的杀伤率。

特异性细胞杀伤率（％）＝（特异性释放ＣＰＭ值－自发性释放ＣＰＭ值）÷（最大量释放ＣＰＭ值－自发性释放ＣＰＭ值）×１００％１．４　ＮＫ细胞及ＣＴＬ体外对黑色素瘤细胞作用的检测　设立对照组，收集ＮＫ细胞和ＣＴＬ，计数并调整细胞，使ＮＫ细胞与Ｂ１６细胞比值从１０∶１稀释至０．３１２∶１，ＣＴＬ细胞与Ｂ１６细胞比值从２００∶１稀释至３．１２∶１，分别用５１Ｃｒ标记靶细胞，使这２种靶细胞１∶１混合后，轻轻旋转９６孔板（使细胞紧密接触），３７℃孵育４ｈ。

即可检测上清液ＣＰＭ值，计算待检细胞的杀伤率。

特异性肿瘤细胞杀伤率（％）＝（特异性释放ＣＰＭ值－自发性释放ＣＰＭ值）÷（最大量释放ＣＰＭ值－自发性释放ＣＰＭ值）×１００％２　结 果ＮＫ细胞及ＣＴＬ的形态、大小均匀，ＮＫ细胞表面受体ＮＫ１．１＋的百分比在８７％以上，ＮＫｐ４６＋在９０％以上；ＣＴＬ表面受体ＣＤ３＋的百分比在９９％以上，ＣＤ８＋在９８％以上，见图１～３。

ＮＫ细胞、ＣＴＬ相互无细胞毒性，见图４、５。

联合应用ＮＫ细胞与ＣＴＬ对Ｂ１６细胞的杀伤活性见图６。

图１ ＮＫ细胞（左）及ＣＴＬ（右）的形态表现（倒置相差显微镜×２００） 上：ＣＤ３；左下：ＣＤ８；右下：ＮＫｐ４６。

图２ ＣＴＬ细胞表面受体的表达情况（流式细胞术） 左上：ＮＫ１．１；右上：ＮＫｐ４６；左下：ＣＤ８；右下：ＣＤ３。

图３ ＮＫ细胞表面受体的表达（流式细胞术）图４ ＮＫ细胞：ＣＴＬ的细胞毒性（４ｈ）图５ ＣＴＬ细胞：ＮＫ的细胞毒性（４ｈ）图６ ＮＫ细胞与ＣＴＬ对Ｂ１６细胞的杀伤活性３　讨 论研究证实体内外活化ＮＫ细胞及ＣＴＬ均需要ＩＬ‐２维持，ＩＬ‐２是激发细胞因子（如ＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ）级联反应的关键因素，活化的ＮＫ细胞及ＣＴＬ均有较高的细胞活性及较高的纯化度［８］，同时，也可应用其他细胞因子如ＩＬ‐１２、ＩＬ‐１８活化ＮＫ细胞，以ＩＬ‐２活化的ＮＫ细胞对肿瘤细胞杀伤力较强［１１‐１２］。