B16细胞的培养

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兔抗B16黑素细胞多克隆抗体的制备及对黑素细胞增殖的影响

免疫家兔得到兔抗Ｂ６１黑素细胞多克隆抗体；试管凝集法检测抗血清效价；Ｇ蛋白亲和层析纯化抗血清；ＳＳＰＧ ② Ｄ－ＡＥ检测纯化抗体分子量大小；３ＭＴ检测纯化抗体ＩｇＧ对Ｂ６黑素细胞增殖的影响。结果１兔抗Ｂ６１黑素细胞抗血清效价高达ｌ１８；：２０
ｕｉｇＭＴｒａｓｙ．ｓｔＴｅｔｅｆｔｅａｔｓｒｍｅｃｅ：８Ｓ－ｓｎｓａＲｅｕｌｈｉｒｏｈｎｉｅｕｒａｈｓ１１２０；ＤＳＰＡＧＥｈｗｓｔａｈｅｖｈｉｌｃｌｒｗｅｇｔｏｈｕｉｄｓ：ｔｓｏｈｔｔｅｈａｙｃａｎｍｏｅｕａｉｈｆｔｅｐ６ｆｅ
ＣＥ一ｌ，Ａ，，ＵｈＪａ，ＥａｎＨＮＪ，ＭｌＬＯＺｉｕｎＷＩ — ｇ．ｕｇｇ — Ｄ
Ｙｎｚｏ２０ａｇｈｕ２５０１，ｈｎＣｉａ
ＳｃｄＣｉｉｌｅｉｎｏｅｅｆＹｎｚｏｎｖｓｙｅｎｌｃｄｉＣｌｇｇｈｕＵｉｒｔ，ｏｎａＭｃｅｌｏａｅｉ
中国免疫学杂志２１００年第２６卷
ｄｉ１．６／．ｓ．０ —８Ｘ２１．５０２ｏ：０３９ｊｉｎ１０４．０００．１９ｓ０４
兔抗Ｂ６黑素细胞多克隆抗体的制备及对黑素细胞增殖的影响① １
陈菊萍马樱② 罗志娟② 魏大鹏② （州大学第二临床医学院皮肤性病科，扬扬州２５０）２０１
Ｒ９．１３２１文献标识码Ａ文章编号１０．４２１）５４６０００４Ｘ（０００．３．５８０

人参皂苷Rh2对B16黑色素瘤细胞侵袭、转移能力的影响

人参皂苷Rh2对B16黑色素瘤细胞侵袭、转移能力的影响苑家鑫;邹澄;田华;李丽波;崔红霞【摘要】目的探讨人参皂苷Rh2对B16黑色素瘤细胞侵袭、转移能力的影响.方法培养B16黑色素瘤细胞,同时对其进行药物处理,采用四唑盐比色(MTT)法对细胞活力进行检测.采用划痕试验观察细胞的愈合情况,评价其转移能力;Transwell小室侵袭实验观察细胞侵袭情况.结果细胞存活力实验显示,不同浓度的人参皂苷Rh20、25、50、100 μmol/L对B16黑色素瘤细胞生存率的影响比较差异无统计学意义(P＞0.05);随着剂量浓度的增加,经人参皂苷Rh2处理的B16黑色素瘤细胞穿越小室的细胞数明显减少,并呈剂量效应关系(P＜0.05);细胞迁移的距离随人参皂苷Rh2剂量浓度的增加而缩短.结论人参皂苷Rh2能显著抑制B16黑色素瘤细胞迁移及抑制细胞穿越小室,具有抑制细胞B16黑色素瘤细胞侵袭及非定向迁移的作用;随人参皂苷Rh2剂量增加,其抑制作用增强.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2016(013)012【总页数】4页(P135-138)【关键词】人参皂苷Rh2;B16黑色素瘤细胞;侵袭;转移【作者】苑家鑫;邹澄;田华;李丽波;崔红霞【作者单位】齐齐哈尔医学院药学院临床药理教研室,黑龙江齐齐哈尔 161006;昆明医科大学药学院天然药物化学教研室,云南昆明650500;齐齐哈尔医学院药学院临床药理教研室,黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔医学院药学院临床药理教研室,黑龙江齐齐哈尔 161006;齐齐哈尔医学院药学院临床药理教研室,黑龙江齐齐哈尔161006【正文语种】中文【中图分类】R961.1［Abstract］Objective To study the invasion and metastasis abi1ity of Rh2 ginsenosides on B16 me1anoma ce11.Methods B16 me1anoma ce11s was cu1tured and treated with drug.Ce11 vita1ity was detected by tetrazo1ium sa1t（MTT）method.Hea1ing condition of ce11 was observed by scratch test and transfer abi1ity was estimated.Invasion was observed by Transwe11 matrige1 invasion assay.Results Ce11 surviva1 experiment showed that the surviva1 rate of different concentrations of ginseng saponin Rh 20，25，50，100 μmo1/L to B16 me1anoma ce11s had no statistica11y significant difference （P＞0.05）.With the increase of dose concentration，the ginseng of ginsenoside Rh2，B16 me1anoma ce11s through the chamber ce11s was significant1y reduced with the dose effect re1ationship（P＜0.05）；The ce11 migration distance was shorten a1ong with the increasing of Rh2 ginsenosides dose concentration.Conclusion Rh2 ginsenosides can inhibit the migration of B16 me1anoma ce11 and through sma11 room，p1ay the effect of inhibition of invasion and directiona1 migration of B16 me1anoma ce11；With the increasing of Rh2 ginsenosides dose；the inhibitory effect is enhancing.［Key words］Rh2 ginsenosides；B16 me1anoma ce11s；Attacks；Transfer肿瘤的侵袭与转移是恶性肿瘤十分明显且重要的生物学特征。

培养基诱导B16细胞黑色素合成及机理研究

２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＭｉｎｎａｎＮቤተ መጻሕፍቲ ባይዱｏｒｍｌａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ３６３０００，Ｃｈｉｎａ）
ＧｅｎｅｒａｌＮｏ．９２
培养基诱导ＢＩ６细胞黑色素合成及机理研究
陈金妹，林进妹ｚ，黄家福，欧一新，曹娜，张秀芬１，朱祯慧，潘裕添
ｆ１．闽南师范大学茵物产业工程技术中心，福建漳州３６３０００，；２．闽南师范大学化学与环境学院，福建漳州３６３０００）
细胞中三种黑色素合成相关蛋白质（Ｔｙｏｓｒｉｎｓｅａ，Ｔｙｒｏｓｉｎｓｅａ — ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ１和Ｔｙｍｓｉｎｓｅａ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ２）在以上两种培养基中表达的差异。发现这三种蛋白质的ｍＲＮＡ转录水平基本没有差异，在Ｇｉｂｃｏ — ＤＭＥＭ一１２８００培养基中这三种蛋白质的翻译水平均明显提高，总蛋白质组也更加多样．结论：Ｇｉｂｃｏ — ＤＭＥＭ－１２８００培养基通过提高
ＣＨＥＮＪｉｎ — ｍｅｉ，ＬＩＮＪｉｎ — ｍｅｉ，ＨＵＡＮＧＪｉａ — ｆｕ，ＯＵＹｉ — ｘｉｎ，ＣＡＯＮａ，ＺＨＡＮＧＸｉｕ－ｆｅｎ，

中华眼镜蛇毒组分C对B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用

中华眼镜蛇毒组分C对B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用目的：研究中华眼镜蛇毒组分C（FC）对体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用。

方法：采用MTT比色法、生长抑制实验、集落形成实验，探讨FC对小鼠B16黑色素瘤细胞株的毒性作用。

结果：FC对B16细胞有明显的毒性作用，处理细胞48 h，其IC50=1.75 μg/ml。

FC处理B16细胞24、48、72 h后，各时间点的细胞存活数随FC的浓度升高而减少，细胞的生长受到抑制。

FC还显著抑制B16细胞的集落形成，当FC浓度为0.5、1.0、2.0 μg/ml时，其抑制率分别为33.42%、50.57%、77.34%。

结论：中华眼镜蛇毒组分C对B16细胞具有明显的细胞毒性和生长抑制作用。

标签：中华眼镜蛇毒；黑色素瘤；细胞毒眼镜蛇是我国南方常见的毒蛇之一，据文献报道，眼镜蛇毒对多种肿瘤细胞有较好的杀伤作用。

中华眼镜蛇毒组分C是从中华眼镜蛇毒中分离出的具有明显抗癌活性的组分，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一区带，分子量约6000 Da[1]。

以往研究表明眼镜蛇毒组分C体内外都具有较好的抗白血病和其他肿瘤作用[2-6]。

本文探讨了其对体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞株的毒性作用。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞株小鼠B16黑色素瘤细胞株由广州医学院实验中心提供。

1.1.2 主要试剂噻唑蓝（MTT）：SIGMA产品；二甲基亚枫（DMSO）：天津市化学试剂一厂（分析纯）；RPMI1640：GIBCO产品；新生牛血清：杭州四季青生物工程有限责任公司。

1.1.3 中华眼镜蛇毒组分C（fraction C from naja naja actra venom，FC）由广州蛇毒研究所提供。

1.1.4 主要仪器SW-CJ-1F型洁净工作台：苏净集团安泰公司；自动化酶免分析仪：北京圣健北方医疗仪器有限公司；CO2培养箱：美国QUEUE，Stabil therm；倒置显微镜：重庆光学仪器厂。

B16F10小鼠黑色素瘤高转移细胞

B16F10小鼠黑色素瘤高转移细胞
Cat Number：KG078 For Research Use Only
一、组成:
二、客户自备试剂:
1、PBS (凯基货号：KGB5001)
2、Complete growth medium (凯基货号：KGM 31800-500)
3、0.25% （W/V） Trypsin-0.53mM EDTA (凯基货号：KGY0012)
三、细胞简介:
四、常见问题及解决方案:
1、培养瓶有破裂，培养液有漏液：细胞极大可能会污染，所以我们会及时安排帮老师解决。

2、细胞漂浮：培养瓶不开封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。

次日观察，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞
活力正常，剩余漂浮的细胞可以离心去掉，留10ml培养液培养观察，细胞生长至汇合度80%，进行消化传代；如细胞还是不贴壁，将细胞离心收集转到新培养瓶，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察，我们的技术人员会一直跟踪指导，直到问题解决。

客户收到细胞后请务必仔细阅读细胞注意事项，确保细胞的培养条件一致，如果由于培养条件不一致导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

由于运输的情况，所以极个别细胞会出现不稳定，客户收到细胞后务必第一时间和我们联系，告知细胞具体情况，以便我们技术人员能及时有效的和老师沟通，不胜感谢！。

柯里拉京对B16细胞增殖及酪氨酸酶活性的抑制作用

柯里拉京对B16细胞增殖及酪氨酸酶活性的抑制作用黄海潮;郑公铭;王如意;张显策;李忠军;刘纲勇;傅中【摘要】采用体外培养B16细胞,在柯里拉京作用不同时间后,用MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测柯里拉京对B16细胞生长的影响;用多巴氧化法检测柯里拉京对B16细胞中酪氨酸酶活性的抑制作用;用形态学和Hoechst33258染色法观察柯里拉京对B16细胞生长形态的影响.结果表明,柯里拉京对B16细胞增殖的抑制作用明显,其作用12,24和48 h的IC50分别是35.63,25.78和20.94 mg/L;对作用于B16细胞中酪氨酸酶12,24和48 h时的IC50分别是16.38,14.00和13.85 mg/L;形态学观察表明,当p(柯里拉京)＞16 mg/L作用24h时,B16细胞损伤明显;Hoechst33258染色显示,当ρ(柯里拉京)≤16 mg/L作用24h时,B16细胞呈现凋亡形态.【期刊名称】《日用化学工业》【年(卷),期】2016(046)001【总页数】4页(P44-47)【关键词】化妆品添加剂;柯里拉京;B16细胞;酪氨酸酶【作者】黄海潮;郑公铭;王如意;张显策;李忠军;刘纲勇;傅中【作者单位】广东食品药品职业学院,广东广州 510520;广东食品药品职业学院,广东广州 510520;广东食品药品职业学院,广东广州 510520;广东食品药品职业学院,广东广州 510520;广东食品药品职业学院,广东广州 510520;广东食品药品职业学院,广东广州 510520;广东食品药品职业学院,广东广州 510520【正文语种】中文【中图分类】TQ658现在越来越多的人注重外表，因此化妆品拥有众多的消费者，其中美白化妆品较受青睐。

由于绝大部分天然中草药毒副作用小，使消费者易于接受，中草药的美白作用及其应用成为研究热点，相关文献报道众多，且市场上宣称添加某种或几种中草药提取物的美白化妆品也林林总总。

裸鼠抑制肿瘤瘤实验具体步骤及方法

动物体内抑瘤实验具体步骤及方法活体生物发光成像技术的原理：在小型哺乳动物体内利用报告基因（荧光素酶基因）表达所产生的荧光素酶蛋白与其小分子底物荧光素在氧、Mg2+存在的条件下消耗ATP 发生氧化还原反应，将部分化学能转化为可见光能释放。

因此只有在活细胞内才会发生发光现象。

并且光的强度与标记细胞的数目线性相关。

一、材料准备1. 动物：裸鼠9 只，6～8周龄，雄性；C57小鼠24 只，6～8 周龄，雄性；动物均为自由饮水采食。

2. 细胞：MDA-MB-231人乳腺癌细胞系，使用荧光素酶基因标记。

方法：用荧光素酶报告基因标记的质粒转染人乳腺癌细胞，共转染的还有选择性标记基因，从而保证转染细胞的稳定性，形成表达荧光素酶的肿瘤细胞株；B16 黑色素瘤细胞。

二、实验步骤1. 紫杉醇混合胶束的制备（1）将适量紫杉醇溶解在少量无水乙醇和丙二醇的混合溶剂中.（2）加入适当比例的磷脂和表面活性剂A 进行充分混合，制得稳定的紫杉醇混合胶束前体制剂，载药浓度为6 g/L。

（3）临用时按剂量加入生理盐水中稀释、摇匀后即可使用。

制剂体系的粒径大小与分布特征采用动态激光光散射粒度仪检测。

2. MDA-MB-231人乳腺癌细胞荷瘤鼠模型的建立（1）培养荧光素酶基因标记的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系，使用DMEM 培养基（添加10%胎牛血清），37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，每3天传代1次。

（2）待细胞密度为80%～90%、细胞总量达到实验所需要求时，使用胰酶消化，收集于PBS溶液重悬。

（3）如有需要，在细胞培养一定时间后，应使用抗生素Zeocin进行抗性筛选，保证荧光素酶基因的表达量足够。

（4）收集细胞，使用PBS稀释至细胞数1.5×108/mL，接种于裸鼠腋下，每只裸鼠的接种量为0.1 mL 。

3. 动物活体成像检测（1）接种后将裸鼠随机分为3组，分别为生理盐水组、紫杉醇注射液组、紫杉醇混合胶束制剂组，每组3只。

茶叶提取物EGCG和GCG及ECG对B16细胞内黑色素生成的抑制作用

茶叶提取物EGCG和GCG及ECG对B16细胞内黑色素生成的抑制作用张向娜;林勇;黄建安;刘仲华;梁丹丹【摘要】Inhibitory effects of tea extracts EGCG, GCG and ECG on melanoma cell B16 from mouse were studied in this paper. Cells were treated with different concentrations of GCG, ECG, EGCG and Arbutin, and their morphology was observed in an inverted microscope. The proliferation rate of B16 was determined using MTT method, tyrosinase activity was detected by using L-DOPA as substrate, and NaOH-lysis approach was employed to measure the melanin synthesis. The results showed that EGCG, ECG, GCG could significantly inhibit the melanogenesis and tyrosinase activity in cells B16 with a dose-dependent manner. The proliferation rate would be lower than 50% when the concentration was increased to 60 μg/mL. Compared with the control group, tyrosinase activities affected by the three substances were reduced by 26.67%, 27.27% and 32.71%, respectively, the melanin inhibition rates were all above 30%.In conclusion, tea extracts could efficiently inhibit melanogenesis. The inhibitory effect of GCG was best, followed by ECG, EGCG, and arbutin in turn.%为研究茶叶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechingallate,GCG)和表儿茶素没食子酸酯(epicatechingallate,ECG)对体外培养B16小鼠黑色素瘤细胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影响,分别用不同浓度的EGCG、GCG、ECG和熊果苷(Arbutin,AR)处理细胞,观察效应物对细胞形态的影响,用溴化二苯四偶氮法(MTT法)测定茶叶提取物对细胞增殖率的影响,以左旋多巴(L-DOPA)为底物,测定细胞内酪氨酸酶的活性,采用氢氧化钠裂解法测定细胞内黑色素的含量.结果显示,EGCG、ECG、GCG能显著抑制B16细胞的黑色素生成和酪氨酸酶的活性,且呈剂量依赖关系;当浓度为60μg/mL时,细胞增殖率均低于50%,酪氨酸酶活性与对照组相比分别降低了26.67%、27.27%和32.71%,黑色素生成抑制率均在30%以上.结果表明,茶叶提取物能通过多种途径抑制黑色素生成,且GCG的作用效果最优,ECG的作用效果次之,三者的作用效果均优于熊果苷的作用效果.【期刊名称】《湖南农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(043)004【总页数】6页(P405-410)【关键词】茶叶提取物;表没食子儿茶素没食子酸酯;没食子儿茶素没食子酸酯;表儿茶素没食子酸酯;B16黑色素瘤细胞;黑色素生成;酪氨酸酶【作者】张向娜;林勇;黄建安;刘仲华;梁丹丹【作者单位】国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128【正文语种】中文【中图分类】Q946.84+1健康、白皙的肌肤是东方女性理想的肌肤状态，而皮肤黑色素的含量及分布很大程度上影响着肌肤的呈色。

小鼠皮下及肺转移肿瘤模型制备

小鼠皮下及肺转移肿瘤模型制备宋天姣;曹倩文;王娜;田雨;郑全辉【摘要】①目的经皮下和尾静脉注射，制备小鼠黑色素瘤细胞增殖、转移模型。

②方法体外培养黑色素瘤细胞，分别经腋部皮下和尾静脉注射接种C57BL／6小鼠，接种剂量分别为1×106／只和3×105／只，2周后观察黑色素瘤形成及肺部转移情况。

③结果黑色素瘤细胞注射2周后，经皮下接种的小鼠腋窝出现明显肿瘤，成瘤率达100％；经尾静脉注射的小鼠肺部出现大量黑色素瘤结节，肿瘤转移率达90％。

④结论经皮下和尾静脉注射方法能够成功制备小鼠的肿瘤细胞增殖和转移模型。

%Objective To prepare tumor proliferation and metastasis mouse models through sub‐cutaneous and tail vein injection of melanoma cells .Methods Melanoma cells (1 × 106/100uL )were subcutaneously injected into C57BL/6 mice from the axillary region to prepare the tumor proliferation mouse model;melanoma cells(3 × 105/100uL)were injected by tail vein to prepare the tumor metasta‐sis mouse model .Melanoma tumor formation and lung metastasis were detected 2 weeks after melano‐ma cell injection .Results The subcutaneously injected mice showed obvious melanoma formation in the axillary region and the tumor formation rate was 100% .The lung of tail vein injected mice showed apparent melanoma nodules and the tumor metastasis rate was 98% .Conclusion Tumor proliferation and metastasis mouse models can be successfully prepared by subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells .【期刊名称】《河北联合大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】2页(P1-2)【关键词】肿瘤细胞;黑色素瘤;增殖;转移【作者】宋天姣;曹倩文;王娜;田雨;郑全辉【作者单位】华北理工大学河北唐山 063000;华北理工大学河北唐山 063000;华北理工大学河北唐山 063000;华北理工大学河北唐山 063000;河北省慢性疾病重点实验室【正文语种】中文【中图分类】Q784[ABSTRACT] Objective To prepare tumor proliferation and metastasis mouse models through subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells.Methods Melanoma cells(1×106/100uL)were subcutaneously injected into C57BL/6 mice from the axillary region to prepare the tumor proliferation mouse model;melanoma cells(3×105/100uL)were injected by tail vein to prepare the tumor metastasis mouse model.Melanoma tumor formation and lung metastasis were detected 2 weeks after melanoma cell injection.Results The subcutaneously injected mice showed obvious melanoma formation in the axillary region and the tumor formation rate was 100%.The lung of tail vein injected mice showed apparent melanoma nodules and the tumor metastasis rate was 98%.Conclusion Tumor proliferation and metastasis mouse models can be successfully preparedby subcutaneous and tail vein injection of melanoma cells.[KEY WORDS] Tumor cell metastasis.Melanoma.Proliferation.Transfer目前恶性肿瘤已成为一类严重威胁人类健康的多发病和常见病，其发病机制仍未完全阐明，对肿瘤有效的治疗措施还处在不断探索之中。

Transwell侵袭实验

Transwell侵袭实验总结－Transwell的其他应用的实验步骤1．Transwell肿瘤细胞迁移实验过程与Transwell侵袭实验基本一致，不同的只是不需要铺Matrigel。

个人认为，由于没有基质胶的阻挡，细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快，所以细胞量要更大。

我做侵袭实验的细胞密度是1×105，而迁移实验的密度是1×106。

另外，下层培养液的FBS浓度也可适当下调，我做侵袭实验的浓度是5%，迁移实验的浓度是2.5%。

2．Transwell上皮细胞培养步骤做了一段时间的原代细胞培养，把经验拿出来跟大家分享一下吧，请有关战友共同探讨：(1). 将雄性wistar大鼠麻醉，开胸，将气管取出，置于4℃含0.1％胰蛋白酶XIV (Sigma)，100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg2＋，无血清的MEM。

(2). 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁，将所得溶液离心后得到游离细胞。

(3). 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次，以中和胰蛋白酶，再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲洗一次。

(4). 冲洗过后，将得到的细胞悬液用台盼兰测定活力，若存活率大于90％，则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar），以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml 链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天。

(5). 孵育后，经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间，即可用于电生理试验。

显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片3. Transwell B16细胞的体外迁移实验我以前用costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验，具体是这么做的：首先把Transwell倒置，在Transwell的PVPF膜（0.8 um）的下表面涂一层fibronectin(10 ug/ml，50ul),37度2小时，PBS洗一遍后，放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内，后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度），放入培养箱，12-18小时后，取出Transwell，用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞，另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟，结晶紫染色20分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，记数。

B16黑素瘤细胞黑色素含量测定方法

黑色素含量测定
一．实验材料
仪器：倒置显微镜、96孔板、微量移液器（枪及枪头）、恒温培养箱、喷壶、脱脂棉、封口膜、培养瓶100ml 、点滴瓶(250ml 、500ml)、烧杯（500ml 、50ml ）、量筒（500ml ，100ml ，10ml ），滤器及滤膜（0.22um ）、酒精灯、移液管、吸球、吸管架及瓶架、镊子、标签贴、双蒸器、超净台
试剂：胎牛血清、DMEM 培养基、胰蛋白酶、PBS 液、75%酒精、NaOH 、
二．实验方法
用NaOH 溶解法。

取对数期的B16黑素瘤细胞，弃去培养液，用PBS 液清洗2次，加入培养液，调节细胞浓度为0.5×104—1×104/孔相当于干细胞悬液5×104—10×104个（ml -1）,加入96孔板中，每孔加入100ul 。

过夜后(12h)，细胞贴壁,使用同MTT 法同浓度同体积的含药培养基加入，并设置对照组（细胞+培养基）和空白对照组（培养基），每个浓度组设置5个复孔，培养基中均含5%胎牛血清，于37摄氏度5%CO 2恒温培养箱中培养56h 后，吸去培养液用 0.25%胰酶消化，以1000r/min 离心5min 弃上清液，每个处理因素下的细胞加入200ul 含10%二甲基亚砜（DMSO ）的NaOH （1mol/L ）溶液，于65摄氏度水浴完全溶解黑色素颗粒，酶联免疫检测仪检侧490nm 处吸光度A 值。

（黑素形成率＝A 实验组/A 空白组平均值×100%）。

GHK对B16细胞内黑色素合成的抑制作用

GHK对B16细胞内黑色素合成的抑制作用王昭维;王惠嘉;高恩;赵金礼;杨小琳【摘要】为探讨甘氨酰组氨酰赖氨酸(GHK)对细胞内黑色素合成的抑制作用以及可能的作用机制,为GHK作为美白化妆品的添加剂提供试验依据,采用液相合成方法制备GHK,研究GHK对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用及对小鼠B16黑素瘤细胞(B16)增殖、酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响.结果表明,GHK在质量浓度低于5 g/L时,在培养过程中B16细胞的增殖并没有受到影响,且随着GHK浓度的提高,对B16细胞内的酪氨酸酶活性及黑色素合成均呈现质量浓度依赖性的抑制作用.说明GHK对B16细胞内黑色素的合成具有显著的抑制作用,是一种高效的黑色素合成抑制剂,在美白化妆品中具有良好的应用潜力.【期刊名称】《香料香精化妆品》【年(卷),期】2019(000)003【总页数】5页(P29-32,44)【关键词】化妆品添加剂;甘氨酰组氨酰赖氨酸;黑色素合成;酪氨酸酶【作者】王昭维;王惠嘉;高恩;赵金礼;杨小琳【作者单位】陕西慧康生物科技有限责任公司,陕西西安 710000;陕西慧康生物科技有限责任公司,陕西西安 710000;陕西慧康生物科技有限责任公司,陕西西安710000;陕西慧康生物科技有限责任公司,陕西西安 710000;陕西慧康生物科技有限责任公司,陕西西安 710000【正文语种】中文胜肽的生物学活性取决于其氨基酸组成和序列。

人体内各种生理进程几乎都是由特定的氨基酸序列组成的多肽或者蛋白质调控的。

在与皮肤护理相关的自然进程中，肽起着重要的作用，如细胞增殖、细胞迁移、炎症、血管发生、色素形成和蛋白合成及调控等[1-3]。

甘氨酰组氨酰赖氨酸（GHK）是1973年由Pickart等人首先从人血浆中分离得到的一种三肽。

GHK和二价铜离子有很强的亲和力，能自发形成络合物（GHK - Cu）[4]。

有关研究表明，GHK及GHK - Cu能改善血液循环，促进神经和神经营养因子的合成，具有抗氧化、抗炎症、治疗癌症等作用[5- 6]，同时GHK在皮肤再生中也发挥着重要作用 [7- 8]，但GHK对细胞中黑色素合成的影响尚未被人们所认识。

非接触式共培养技术在体外细胞实验中的初步应用.

非接触式共培养技术在体外细胞实验中的初步应用[ 07-09-17 10:40:00 ] 编辑：studa20作者：赵学铭，刘易欣，倪春生，赵秀兰，孙涛，古强，孙保存【关键词】 ,间充质干细胞；恶性黑色素瘤；非接触式共培养,［摘要］目的研究与恶性黑色素瘤细胞进行非接触式共培养的间充质干细胞表型变化，从而明确非接触式共培养体系可以应用于两种细胞之间相互作用的研究。

方法利用Transwell进行非接触式共培养，分析间充质干细胞形态变化，利用免疫组织化学与免疫荧光检测其Ⅷ因子和CD34表达。

结果间充质干细胞在非接触式共培养体系中可以被恶性黑色素瘤细胞诱导为多角形或短梭形，同时Ⅷ因子和CD34表达上调。

结论初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的间充质干细胞中部分细胞表型发生改变，明确非接触式共培养体系可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。

［关键词］间充质干细胞；恶性黑色素瘤；非接触式共培养Primary application of in vitro cell research by indirect coculture system［Abstract］ Objective To study the phenotype change and interactions of mouse bone marrowderived mesenchymal stem cells induced by B16, a mouse malignant melanoma cell line.Methods Indirect coculture was based on transwell system to analyse the phenotype change of MSC. Determination of the expression of Ⅷ factors and CD34 by immunohistochemistry and immunofluorescence.Results MSC was form in polygon and fusiform induced by B16. Then the immunohistochemistry and immunofluorescence staining show Ⅷ factors and CD34 was upregulation of MSC.Conclusion The results of the indirect coculture experiments with B16 cell and MSC in vitro can initially confirm that parts of the MSC transform their phenotype, it means that indirect coculturesystem may used in cell interaction research in vitro.［Key words］ mesenchymal stem cells; malignant melanoma; indirect cocuuture间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是指存在于骨髓基质中的非造血组织的另一类重要的干细胞，它最显著的生物学特征是既有自我更新的能力，又具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的潜能［1,2］。

黄芪甲苷抑制黑色素瘤B16细胞的增殖作用

黄芪甲苷抑制黑色素瘤B16细胞的增殖作用王日明，宁雪，任跃英（吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118）摘要：本文研究了黄芪甲苷抑制黑色素瘤B16细胞增殖并诱导细胞凋亡的影响。

将细胞培养成功后，分别分成空白对照组、低浓度组（10 mg/mL）、中浓度组（20 mg/mL）、高浓度组（50 mg/mL），检测黄芪甲苷对黑色素瘤B16细胞增殖及凋亡的影响，并测定Caspase-3、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bax、β-catenin等蛋白的表达量。

结果表明，黄芪甲苷具有较好的抗氧化活性，50 mg/mL处理时，其还原能力和DPPH自由基清除能力分别为0.92和70.82%；在此作用浓度下，处理72 h后，其对B16细胞的增殖率和凋亡率分别为15.55%和40.45%，和其他各组均有显著性差异（p<0.05）。

此外，在高浓度黄芪甲苷作用下，Caspase-3、Bcl-2、Bax、β-catenin蛋白的表达量分别为0.56、0.58、0.27、0.25，显著区别于其他各实验组（p<0.05），说明黄芪甲苷能抑制较好黑色素瘤B16细胞的增殖，并通过调控Caspase-3、Bcl-2、Bax、β-catenin蛋白表达，诱导细胞凋亡。

关键词：黄芪甲苷；黑色素瘤；增殖；凋亡文章篇号：1673-9078(2021)03-32-36 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2021.3.0860 Astragaloside IV Inhibits Proliferation and Induces Apoptosis ofMelanoma B16 CellsW ANG Ri-ming, NING Xue, REN Yue-ying(Jilin Agricultural University College of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130118, China) Abstract: The effect of astragaloside IV on the proliferation and apoptosis of melanoma B16 cells was investigated. After the cells were cultured successfully, they were divided into blank control group, low concentration group (10 mg/mL), medium concentration group (20 mg/mL) and high concentration group (50 mg/mL). The effects of astragaloside IV on proliferation and apoptosis of melanoma B16 cells were evaluated, and the expression levels of caspase-3, B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), bax and β-catenin were detected. The results showed that astragaloside IV had good antioxidant activity. When treated with 50 mg/mL, the reducing ability and DPPH free radical scavenging capacity were 0.92 and 70.82%, respectively. Under this concentration, the proliferation rate and apoptosis rate of B16 cells after 72 h treatment were 15.55% and 40.45%, respectively, which were significantly different from those of other groups (p<0.05). In addition, the expression levels of caspase-3, Bcl-2, bax and β-catenin were 0.56, 0.58, 0.27 and 0.25, respectively, which were significantly different from those of other groups (p<0.05). Results indicated that astragaloside IV could inhibit the proliferation of melanoma B16 cells and induce apoptosis by regulating the expression of caspase-3, Bcl-2, bax and β-catenin.Key words: astragaloside IV; melanoma; proliferation; apoptosis引文格式：王日明,宁雪,任跃英.黄芪甲苷抑制黑色素瘤B16细胞的增殖作用[J].现代食品科技,2021,37(3):32-36W ANG Ri-ming, NING Xue, REN Y ue-ying. Astragaloside IV inhibits proliferation and induces apoptosis of melanoma B16 cells [J]. Modern Food Science and Technology, 2021, 37(3): 32-36黑色素瘤属于临床中一种恶性肿瘤，主要发生在患者的肢端的皮肤以及皮肤黏膜处。

树突状细胞与黑色素瘤细胞体外共培养体系对小鼠黑色素瘤形成的影响

树突状细胞与黑色素瘤细胞体外共培养体系对小鼠黑色素瘤形成的影响郑云梅;和晨辰;王世忠;沈万秋;李海东【摘要】目的探讨树突状细胞(DC)与黑色素瘤细胞(B16)体外共培养后对小鼠黑色素瘤生长的影响.方法提取小鼠骨髓细胞,分化DC,培养至第6天,将细胞分为4组,脂多糖(LPS)组、聚肌胞[Poly(IC)]组、Melan-A抗原肽(Melan-A)组分别加入DC佐剂LPS(终浓度100 ng/mL)、Poly(IC)(终浓度20 ng/mL)、Melan-A抗原肽(终浓度5μmol/L)进行处理,未处理组未进行干预.采用流式细胞术检测DC成熟状态.B16细胞与培养第6天的DC共培养2 d.取C57BL/6J小鼠皮下注射B16细胞(8只),DC+B16细胞(8只),LPS(8只)、poly(IC)(8只)、Melan-A抗原肽激活(8只)的DC+B16细胞,接种B16细胞1周再接种DC+B16细胞(5只),对照组(3只)不接种细胞.于接种第14天取部分小鼠处死,取脾脏,镜下观察其组织形态,接种第28天测算肿瘤体积.结果LPS组、Poly(IC)组、Melan-A组成熟DC多于未处理组.接种DC+B16细胞的小鼠未见肿瘤生长;接种第28天,与接种B16细胞的小鼠比较,接种LPS、poly(IC)、Melan-A抗原肽激活的DC+B16细胞及接种B16细胞1周再接种DC+B16细胞的小鼠肿瘤体积减小(P均<0.05).与对照组比较,第14天接种DC+B16细胞小鼠脾脏滤泡结构无明显变化,而接种B16细胞及LPS、poly(IC)、Melan-A抗原肽激活的DC+B16细胞小鼠,脾脏滤泡结构增加.结论 DC与B16共培养的可抑制小鼠黑色素瘤的形成.%Objective To investigate the effect of co-culturing dendritic cells (DC)with melanoma cells (B16)on growth of melanoma in mice.Methods We extracted the bone marrow cells.Mouse DC were cultured for 6 days and then were divided into 4groups:lipopolysaccharide (LPS)group,Poly (IC)group,Melan-A group andthe control group. Cells in the LPS group,Poly (IC)group,Melan-A group were incubated with LPS (LPS with final concentration of 100 ng/mL),poly-inosinic-cytidylic acid [Poly(IC)with final concentration of 20 ng/mL]and Melan-A peptide (with final concentration of 5 μmol/L),respectively.The control group was not treated.Flow cytometry was used to study the matura-tion and activation state of DC.B16-F10 (B16)melanoma cells were co-cultured with DC for 2 days and then were used for inoculation of mice.For melanoma model,C57BL/6J mice were inoculated subcutaneously.Some mice were killed at 14 days after inoculation and their spleens were taken to study the structural changes by histochemistry.Tumor size was meas-ured at 28 days after inoculation.Results More mature DC were produced after LPS,Poly(IC)or Melan-A peptide treat-ment as compared with that of the control group (P <0.05).There was no tumor growth after DC +B16 cell inoculation. Compared with the mice inoculated with B16 cells only,the tumor volume was smaller in the mice inoculated with LPS,Po-ly(IC)or Melan-A peptide-activated DC +B16 cells or the mice inoculated with B16 cells one week later followed by an-other inoculation of DC +B16 cells (all P<0.05).Compared with the control group,there was no structural change of the spleen follicles in the mice inoculated with DC +B16,but the number of spleen follicles was increased in the mice inocula-ted with B16 or with LPS,Poly (IC),or Melan-A peptide-activated DC +B16 cells.Conclusion DC co-cultured with B16 can inhibit the growth of melanoma in mice.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2017(057)005【总页数】3页(P1-3)【关键词】黑色素瘤;树突状细胞;免疫治疗;小鼠【作者】郑云梅;和晨辰;王世忠;沈万秋;李海东【作者单位】天津医科大学基础医学院,天津 300070;天津医科大学药学院;天津医科大学基础医学院,天津 300070;天津医科大学药学院;天津医科大学基础医学院,天津 300070【正文语种】中文【中图分类】R739.5黑色素瘤恶性程度高，转移发生早，病死率高[1]。

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细胞增殖快非常好养，但是要及时换液，否则也很容易死亡、或变形。

我养的最
好的时候，天天都在换液，两三天就要消化传代。

我用的消化液一般是消化用
含EDTA的胰酶0.25%，个人感觉效果比较好一点。

消化步骤：吸出培养液，加入PBS洗涤（视培养瓶大小加入相应的量，25CM加
入1-2ML）而后加一次胰酶（25CM培养瓶加0.6ML）作用 2-3分钟，轻轻摇晃使
均匀作用在细胞层面上。

要一直在显微镜下观察，以防消化过头，等细胞从梭形
变成椭圆形（或是棱角变钝），本来连成片的细胞之间开始有小小的空间，细
胞与细胞好象是一粒粒的，界限清楚，这时是消化的最佳时机。

（细胞的活力最
好，又非常容易吹打）加入培养液进行吹打十几次即可。

如果消化到细胞全部飘起来，就消化的稍微有点过了。

如果细胞的形态还是老样
子，就消化的有点不足，吹打起来十分费力，有大片的细胞就会贴在壁上，起不
来，而且很不均匀。

只好重新加胰酶消化。

还有就是细胞长的比较密时，胰酶可以比平时多加一点，消化时间适当延长。

雅吉货号中文名称英文名称种属组织来源形态学生长方式培养基血清
YJ255 小鼠黑色素瘤细
胞
B16 小鼠黑素瘤
成纤维细胞
样
贴壁RPMI-1640 C S
B16用加10%血清，加双抗的RPMI-1640培养液，0.25%胰酶消化对数生长期B16细胞，传代比约1:5.
倒置相差显微镜下，对数生长期品源B16细胞形态为梭形或不规则形。