细胞培养全过程

我是细胞培养的新手，在开始养细胞前看到篇文章（老师给的）很实用，希望对大家有帮助。细胞培养室实验操作规范

一、细胞培养室的环境

1. 细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件：

1) 培养室应为独立、封闭的空间。培养室及缓冲间都应保持整洁，不要随意出入；

2) 保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒15—30分钟；每次使用后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用70%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30分钟以上；

3) 定期擦洗桌面、地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒；

4) 每次打开培养箱前，或手伸入超净工作台进行操作之前，均应用70%酒精擦手。

5) 定期清理冰箱。将药品试剂分类摆放，过期的试剂应及时清除；

6) 培养箱要定期清洁。隔板及内壁等用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，再用70%酒精擦净；并要注意底层水箱的水位，及时补充水份；

7) 注意监测CO2的气压，及时补充。

8) 注意监测液氮罐中液氮的挥发情况，及时补充，液面不能低于最高一层细胞冻存盒的位置。

2. 实验器具的清洗、消毒灭菌：

1) 反复使用的器皿应严格清洗干净，其清洗程序为：清水浸泡——去污剂刷洗

——清水冲洗——超声波洗涤——洗液浸泡（过夜）——充分冲洗（务必冲洗干净，不能残留洗液）——蒸馏水漂洗——烘干；若为新的玻璃器皿，要在刷洗后用5%的稀盐酸浸泡过夜。

*洗液：浓硫酸+重铬酸钾

2) 胶塞的清洗：清水浸泡——2%NaOH煮沸10—20分钟——冲洗——1%稀盐酸浸泡30分钟——充分冲洗——蒸馏水漂洗——烘干

3) 玻璃器皿，如玻璃吸管、离心管、玻璃培养瓶、套管等等以及胶塞，清洗后均可用高压蒸气灭菌，15磅灭菌30分钟。

4) 不能高压灭菌而又需反复使用的器具，如加样枪、多道枪的加样槽、塑料吸头等，应事先用70%的酒精擦洗，置于超净工作台中用紫外线照射2小时以上。

二、细胞培养用水、用液：

1. 胞培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水，二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制备的蒸馏水只能用来清洗器皿；

2. 平衡盐溶液（BSS）严格按照配方配制，含Ca++、Mg++离子的要避免其沉淀。可过滤灭菌或高压灭菌。采用高压灭菌时如含有葡萄糖等成份，应避免高压过度，一般8磅10分钟及即可。灭菌后的BSS于4℃冰箱中保存，如出现浑浊或沉淀时，应废弃，重新配制。

3. 培养液的配制，以配制1000ml RPMI1640为例：

1) 将RPMI1640干粉倒入约800ml三蒸水中，搅拌使其溶解；

2) 加入5.94g HEPES，在磁力搅拌器上搅拌约半小时；

3) 加入2g NaHCO3，继续搅拌约2小时；

4) 定容至1000ml；必要时用1N NaOH凋至PH7.0

5) 过滤除菌。滤纸由上到下为：普通定性滤纸、0.4μm滤膜、0.22μm滤膜；

6) 加入抗生素液至每毫升100单位青霉素+100μg链霉素；

7) 按需要加入一定比例的血清使用。常用10%胎牛血清。

8) 密封置于4℃冰箱保存。超过一个月需补加谷胺酰胺（Gln）。

4. 消化液的配制：

实验室采用0.125%胰蛋白酶溶液+0.01%EDTA

1) 按0.25%的浓度计算所需的胰蛋白酶量，将称好的胰蛋白酶粉末置于烧杯中，用少许消毒的PBS液（或D-Hank液）调成糊状，再补足盐溶液；

2) 搅拌均匀，置于4℃冰箱中一到两天，并不时搅拌振荡；

3) 过滤除菌，分装成小瓶，置于-20℃冰箱；

4) 按0.02%的浓度计算并称量EDTA，溶解；

5) 高压蒸气灭菌，分装成小瓶；4℃冰箱保存；

6) 使用时将胰蛋白溶液与EDTA溶液按1:1混合，混合液也可分装成小瓶，保存于-20℃。

5. 冻存液的配制：FBS+10%DMSO，可于4℃冰箱保存。

6. 抗生素液的配制：

将青霉素及链霉素用三蒸水溶解，分别配成20万单位/ml及20万μg/ml，再按1：1混合，即为10万单位/ml青霉素+10万μg/ml链霉素。可于-20℃保存。使用时按1ml培养基加入1μl抗生素液的比例使用。

三、细胞培养实验基本操作

1. 细胞的复苏

非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏：

1) 实验准备：将水浴箱温度调至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预

热；

2) 在记录本上查到所要复苏的细胞存于液氮罐中的位置；

3) 从液氮罐中取出所要细胞，立即置于37℃水浴箱中，使其快速解冻；

4) 将冻存管及培养液瓶的外表面用70%酒精擦拭后，入放入超净台；

5) 将细胞悬液移到离心管中，并加入2-3ml培养基，用吸管轻轻吹打；

6) 1000～1500rpm离心3分钟；

7) 吸去上清液，加入2-3ml培养液，吹打均匀，使细胞悬浮；

8) 将细胞悬液移到50ml培养瓶中，补加约5-8ml培养液；置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。

2. 细胞的传代

培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。

1) 悬浮细胞的传代

悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000～1500rpm离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱中培养（拧松培养瓶盖）。

2) 贴壁细胞的传代

(1) 将消化液从冰箱中拿出，37℃解冻、预热；

(2) 吸出全部培养液，沿壁缓缓加入消化液，将培养瓶有细胞面向下，加入消化液的量至刚好可以覆盖为止，轻轻摇晃；