细胞培养标准流程
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
细胞间基本规定
每次操作结束后开启超净台紫外(30 min)和房间大紫外(30 min)。
显微镜开启使用后将光调暗,最后一个操作者将显微镜关闭。
超净台用完收拾干净,移液器、盒子等摆放整齐。
带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。
细胞培养盘至少需备注:所属者,细胞系名称
细胞间冰箱内物品至少需备注:所属者,物品名称。基培需写上开启时间。
细胞培养标准流程
1、细胞换液、传代(以圆盘培养为例)
Note:所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品(包括双手)进入安全柜之前要酒精消毒。
步骤:1.观察:高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌
2.弃旧:细胞生长融合达90%时,吸出培养基
3.漂洗:PBS(2mL)漂洗1-2次
4.消化:加入1ml0.25%胰蛋白酶,轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶,
后吸去胰酶计时CO
放置40s-1min,,轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞
2
脱壁。
5.终止:吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消化。
6.吹悬:轻轻吹打混匀,(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁,呈卵圆形),
吹打成单细胞悬液后按1:2 或1:3 比例传代接种于新培养皿。
再加入10ml全培。(大盘10ml全培,小盘6ml全培)
(细胞生长快留30%,慢40%-50%;其余细胞可提取蛋白或RNA)
7.培养:每天或每两天更换一次培养基,直至细胞生长至融合时再次进行
传代,每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。
PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。
2、细胞转染
TurboFect 转染试剂转染(用于质粒的转染,说明书附后)
细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。
以6 孔板为例,转染前细胞先换液,加4ml全培。
取1.5 ml 离心管,加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液,加入质粒2 μg,混匀后静置5 min,再转染试剂4 μL,混匀(转染试剂是质粒的2倍),室温静置15-20 min。
(转染试剂需加在培养液中部,切忌勿贴壁;静置时间不可超过20 min)
无血清无双抗DMEM量=全培体积的10%。如6孔板加4mL培养液培养,即转染体系为400ul无血清无双抗DMEM。
缓慢均匀加到培养液后,轻轻晃动圆盘,使其均匀分布。
转染后6h后细胞换液,排除试剂的毒性影响。
24~48 h 后收集细胞用于后续实验。
Note:如果用这种方法转染效率一直不佳,可以在接种细胞前,把转染试剂配好,把转染试剂加到培养盘上,再把细胞接种上。该方法不适用所有细胞,这种方法会导致细胞死亡,不贴壁。
HiPerFect转染试剂转染(用于siRNA的转染,说明书附后)
For transfection of eukaryotic cells with siRNA and miRNA 以6 孔板为例,转染之前,以2mL全培接种1.5-6×105细胞于6孔板每孔。
将细胞放置在培养箱中培养,直至转染。(前50%---染90%)
取1.5 ml 离心管,加入100 μL 无血清无双抗DMEM 培养液,加入
siRNA(20uM浓度,相当于0.25ug/μL)5uL,转染试剂12μL,轻轻混匀,室温
静置5-10 min。
siRNA:转染试剂:无血清无双抗DMEM 5uL:12ul:100ul。(比例待定)
将步骤3混合液缓慢均匀加到培养液后,轻轻晃动圆盘,使其均匀分布。
24~48 h 后收集细胞用于后续实验。
3、细胞冻存(慢冻快融)
1)配冻存液:全培+10%DMSO或者90%胎牛+10%DMSO。(保护细胞膜不被冻坏)2)提前准备好程序性降温盒。
3)标记冻存管:帽子:细胞系名称冻存者
侧面:细胞系名称冻存者冻存时间
级别(按照细胞状态标记A+,A,B),太差的别冻
4) 细胞经过换液消化后,离心,弃上清.加入2ml的预先配好的冻存液,快速吹
打混匀。若不离心,则在冻存管中加100μL DMSO+900μL细胞悬液。
5) 冻存顺序:用冻存仪(程序性降温盒)-80℃过夜→液氮。
或者4℃半小时→-20℃2小时→-80℃存储。
冻存仪的使用方法
1、确认冻存仪内的异丙醇是否已经使用5次,准备细胞,放入冻存盒(最多
18管)。
2、将冻存盒放入-80℃冰箱,并登记信息(冻存者,冻存细胞名称,异丙醇
使用次数)
3、至少三个小时后(过夜),将细胞取出放置于自己的细胞盒内或液氮中。
4、将冻存盒取出放回原处。
冻存盒内需放置250ml的异丙醇,异丙醇使用4-5次后需要更新
4、细胞复苏(DMEM培养液+10%FBS+1%双抗)
1)准备37℃水浴箱,10mL离心管,配制相应培养基,标记好培养皿。
(离心管和培养皿可提前加好约5ml培养基)
2) 将取出的细胞冻存管快速投入到温水中,同时手握冻存管快速搅动,让细胞
以最快的速度融解。
3)吸取所有融化的细胞悬液至加有5倍体积培养基的离心管中。
4)离心800rpm,3min。
5)弃上清,加全培重悬细胞。
6)依次加2ml细胞悬液和10ml全培入新培养皿。
(6cm小圆盘上加入 2 ml的全培;10cm大圆盘上加入10ml的全培)。
7)混匀(十字混匀),CO
培养。
2
标准程序:
3)离心1000rpm,2-3 分钟;弃上清,加入1ml全培重悬后转入10ml管,再加入4-5ml全培重悬
4)离心1000rpm,2-3 分钟,离心期间,在6cm小圆盘上加入 2 ml的全培
10cm大圆盘上加入10ml的全培
5)弃上清,加入1ml全培重悬随后加入到上述的6cm小圆盘中
Note:细胞请在6cm的小圆盘内
细胞离心后请用全培再洗一遍尽量去除DMSO的影响
(注:专业文档是经验性极强的领域,无法思考和涵盖全面,素材和资料部分来自网络,供参考。可复制、编制,期待你的好评与关注)