木霉胞外蛋白酶的研究进展
酶学研究的新进展与应用前景
酶学研究的新进展与应用前景酶学作为生物化学的重要分支学科，一直受到科学家们的广泛关注。
酶是生物体内各种化学反应的催化剂，具有高效、特异性和可控性等特点，因此在医药、工业、环保等领域都具有重要的应用价值。
近年来，随着分子生物学、基因工程和生物晶体学等技术的发展，酶学研究取得了一系列突破性进展，同时也给酶学的应用前景带来了新的机遇和挑战。
一、酶学研究的新进展1. 酶的结构与功能研究生物晶体学技术的进步，使得科学家们可以高分辨率地解析酶的三维结构，加深对酶催化机制的理解和探究。
同时，在结构和功能的相关性方面也得到了深入的研究。
例如，最近一项研究发现人体中一种名为Itaconase的酶，可以将吡咯烷酮转化为丙烯酸，该过程对细胞代谢有重要意义。
这项发现揭示了酶的结构与功能之间的紧密联系，也为发掘新的生物催化反应提供了新思路。
2. 酶的进化研究生物体内的酶在长期的进化过程中，逐渐形成了丰富的多样性。
研究不同物种酶的特性和分化路径，有助于揭示酶的进化机制和适应环境的方式。
近来的研究表明，酶家族和基因家族的扩张与收缩，主要受到复制机制、自然选择和基因重组等因素的影响。
同时，比较酶家族和基因家族的演化，可以增加对生物种群进化的认识。
3. 酶的催化机理研究酶对化学反应的催化机制一直是酶学研究的中心问题。
近年来，随着理论计算、光谱学和微观动力学等技术的发展，研究人员对酶的催化机理有了更深入的认识。
例如，最近的一项研究证实了酶催化反应中的亲核攻击能够通过核子挪移（即原子的转移）的方式实现。
这一发现提供了新的理论基础，可以推动酶学的更深入研究和应用。
二、酶学研究的应用前景1. 医药领域由于酶具有高效、特异和可控的特性，成为医药领域的重要催化剂。
例如，酶抑制剂可以抑制某些疾病的发生，如癌症、糖尿病、肝炎等。
另外，酶在药物合成、药代动力学、药物传输等方面也有着重要的作用。
例如，酶可用于合成特定的药物分子，同时可以加速药物分子的代谢和排泄，从而减少不良反应和毒性。
木霉菌诱导植物抗病性研究新进展_陈捷
3
木霉菌分泌蛋白与诱导植物抗性
木霉菌在与植物根系互作过程中产生各种分泌蛋白，主要包括诱导抗性相关的激发子（elicitor）或效 应因子（effector）以及防御反应的抑制因子等，如丝氨酸蛋白酶、22 kD 木聚糖酶、几丁质脱乙酰基酶、 几丁质酶 Chit42、SnodProt1 蛋白（SnodProt1、Sm1 和 EPI）、脂肽、棒曲霉素类蛋白、无毒基因蛋白等。 多数激发子/效应因子属于富含半胱氨酸的蛋白，可诱导植物发生 MTI（microbe trigger immunity）反应， 而一些专化性激发子具有无毒基因（avr）的功能，可与植物的抗性基因（R）特异互作，诱导免疫反应，
Abstract: Trichoderma spp. are widely used biocontol microbe against plant disease with multiple antagonistic mechanism. The significant advances in induced resistance mechanism have been made in recent years. Trichoderma can produce over 20 MAMPs or DAMPs, correspondingly plant roots have about 30 receptors or response genes. The Trichoderma colonization on roots is able to initiate interaction of MAMPs/DAMPs-root receptor or response gene, which then triggers long distance transduction of signals including salicylic acid and jasmonic acid/E tresponsible for induced expression of leaf defense genes against plant disease. Integration of information based on the changes of plant trancriptome, proteome and metabolome after Trichoderma colonization on roots can provide more comprehensive understanding to Trichoderma-plant beneficial interaction associated with the induced resistance against plant disease. Key words: Trichodema; biological control; induced resistance; MAMPs; metabolome 木霉菌 Trichoderma spp.是自然界广泛分布的真菌， 普遍应用于土传病害生物防治。 近年来随着以病原 菌相关分子模式/微生物相关分子模式 （PAMP/MAPM） 为核心的植物基础免疫学理论的提出和组学技术广 泛应用，使得人们对木霉菌生物防治植物病害机理的研究上升到一个新的阶段，尤其木霉菌诱导植物抗性 分子机理研究已成为生物防治基础研究的热点，为此本文重点综述国内外关于木霉菌−植物有益互作所诱 导的植物抗性的研究进展，丰富木霉菌诱导植物免疫的理论基础。
蛋白酶生产和应用的进展
蛋白酶生产和应用的进展蛋白酶是生物世界中一类重要的酶，具有广泛的应用价值。
它们能够分解蛋白质，使其转化为更容易被机体吸收的氨基酸或小分子肽。
在食品、医药、环保等领域，蛋白酶都发挥着重要的作用。
本文将围绕蛋白酶的生产和应用进行深入探讨，展望其未来的发展趋势。
蛋白酶的生产蛋白酶的生产方法主要有三种：微生物发酵、化学合成和生物合成。
微生物发酵微生物发酵是生产蛋白酶的最常用方法。
通过选用合适的微生物菌种，在适宜的生长条件下进行培养，以获得大量的微生物菌体及分泌的蛋白酶。
该方法的优点是菌体生长快、产量高，而且生产成本相对较低。
但微生物发酵过程中，发酵条件及培养基的组成对蛋白酶的产量和性质有很大影响，需要严格控制。
化学合成化学合成是通过化学反应直接合成蛋白酶的方法。
该方法具有操作简便、成本低等优点。
但是，化学合成方法需要使用有机溶剂，有时还需加入重金属催化剂，可能导致环境污染和健康问题。
生物合成生物合成是利用细胞内基因表达系统合成蛋白酶的方法。
通过基因工程技术将目的基因导入受体细胞，在适宜的生长条件下进行培养，实现蛋白酶的高效表达。
生物合成的优点在于无污染、高效、定向，但需要具备基因工程技术的专业知识和技能，生产成本相对较高。
蛋白酶的应用食品领域在食品领域，蛋白酶主要用于肉类、奶制品、面制品等食品的加工过程中。
通过使用蛋白酶，能够提高食品的营养价值、改善口感、风味和质地等方面。
蛋白酶还被用于生产新型的功能性食品，如高纤维蛋白食品、低过敏性食品等。
医药领域在医药领域，蛋白酶主要用于药物生产和医学研究。
例如，胰蛋白酶被用于消化蛋白质，提高药物的吸收效果；胶原蛋白酶可用于治疗骨折、关节炎等疾病；弹性蛋白酶可用于治疗血管疾病等。
蛋白酶在疫苗生产和临床诊断方面也有广泛应用。
环保领域在环保领域，蛋白酶主要用于废水处理和污染环境的修复。
蛋白酶能够分解废水中的有机物，将其转化为更易被微生物降解的小分子物质，从而实现废水的净化。
木材蓝变生物控制菌康氏木霉胞外几丁质酶的纯化及特性
德 国 、英 国和 日本 等 国家 的许 多学者 相 继 开展 了这
方 面的研 究 ，取 得一 些研 究成 果 。经过 研究 有 些生
物 防治菌 株 已应 用到 防蓝 变 的生 产实 践 中 ，如蓝 变 菌 的 白化 菌株 在加 拿 大 已经商 业 化生 产 ，用 于 防治
木材蓝 变 【 ；美 国林 产 品实验 室 （ Ｐ ）开 发研 制 １ Ｆ Ｌ 的 ２种 含 有木 霉属 真 菌繁殖 体 的 菌丸 ，现 已应 用 于
酶活 测 定 采 用 ＤＮＳ法 Ｌ ｌ ，酶 活 力 单 位 （ Ｕ） 定义 ：１酶 活 力单 位 Ｕ 定 义 为 每 分 钟 在 ３ ℃ 下 每 ７ 小 时水 解 几 丁质 产 生 １ ｍｏ 还 原 糖 所 需 的酶 蛋 白 ／ ｌ ￣
量。 １ ４ 蛋 白 质 浓 度 的 测 定 ．
滤液 经 过 硫 酸 铵 分 级 沉 淀 、Ｑ Ｈ 强 阴离 子 交 换 柱 层 析 、Ｐ ｅ ｙ Ｓ ｐ ａｏ ｅ疏 水 层 析 、Ｃ Ｓ ｐ ａｏｅ弱 阳 离 子 交 －Ｐ ｈ ｎ ｌ ｈ ｒｓ 。 ｃ Ｍ－ ｅ ｈ ｒ ｓ
换 柱 层 析 、Ｐ ｅ ｙ Ｓ ｐａｏｅ疏 水 柱 层 析 后 得 到 凝 胶 电 泳 （ Ｄ －Ａ Ｅ） 谱 带 单 一 的 几 丁 质 酶 ，其 分 子 量 为 ｈｎ ｌ ｈｒｓ — ｃ Ｓ ＳＰ Ｇ ３ｋ ａ ６ Ｄ ，最 适 温 度 为 ４ １ ，最 适 ｐ 为 ４ ０ ０ ２ Ｈ ． 。多 种 金 属 阳 离 子 对 该 酶 具 有 影 响 ，Ｃ ２ ａ 、Ｆ ｚ 酶 活力 有 比较 明 显 ｅ 对
遍存 在并 有 重要 经 济意义 的生 防益 菌 。木霉 （ ｒ Ｔｉ —
ｃ ｏ ｅｍａ ｓ ｐ ） 作 为 一 种 重 要 的 植 病 生 防 因 子 ｈｄｒ ｐ ．
菌酶协同发酵生产蛋白饲料的研究进展及应用
菌酶协同发酵生产蛋白饲料的研究进展及应用。
随着我国蛋白资源短缺问题的出现，寻找其他原料弥补优质蛋白资源匮乏成为目前需要解决的问题。
我国非常规饲料原料来源广泛，富含维生素、蛋白质等营养成分，但存在抗营养因子和有毒物质且适口性差以及营养成分不平衡、差异大等缺点。
菌酶协同发酵是在微生物发酵工艺的处理下添加一定量的酶进行协同发酵，兼具酶解法和微生物发酵法的优点，能将原料中的抗营养因子降解，调节饲料苦味，改善饲料适口性，弥补单一微生物发酵产酶不足和酶解口味不佳等问题，促进动物采食，提高饲料转化率和营养价值。
因此，菌酶协同发酵饲料原料生产蛋白饲料能够充分利用我国非常规饲料资源，有效缓解我国蛋白饲料不足的压力，促进养殖业发展。
1菌酶协同发酵生产蛋白饲料的研究1.1菌酶协同发酵常用的菌种和酶菌酶协同发酵常用的菌种主要包括芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌以及霉菌。
芽孢杆菌类主要有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和蜡质芽孢杆菌等，能降解抗营养因子和有毒物质，分泌纤维素酶和蛋白酶将纤维素和大分子蛋白降解，调节动物肠道健康。
酵母菌类主要有酿酒酵母、产阮假丝酵母和啤酒酵母等，能使发酵饲料产生酒香味，改善饲料适口性，提升饲料风味，且因其本身是菌体蛋白，可增加蛋白产量，增加饲料利用率。
乳酸菌类主要有植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸杆菌和乳酸片球菌等，能产生多种有机酸和细菌素进而降低饲料pH值，抑制有害菌生长，提升饲料营养品质，促进动物采食，增强动物免疫力。
霉菌类主要有米曲霉、根霉、木霉、黑曲霉和青霉等，霉菌类菌株能分泌胞外酶，如蛋白酶、半纤维素酶和纤维素酶等来分解原料中的淀粉和蛋白来提升发酵效果和增加饲料利用率。
常用酶主要是非淀粉多糖酶和蛋白酶。
非淀粉多糖酶主要是纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和甘露糖酶等，可将饲料原料中的纤维破坏使营养物质得以释放，且可将原料中碳水化合物分解为葡萄糖和氨基酸等小分子物质为菌群提供能源，促进动物吸收消化。
木霉菌生防机制及分类的研究进展
１１ 胞 外酶机 制 ． 多 数 学 者 认 为拮 抗 木 霉 菌在 寄 生 过 程 中产 生 了 一 系列降 解病 原 菌细 胞壁 的水 解酶 ， 几 丁 质酶 如
（ ｉｎｓｓ、 维素 酶 （ ｌ ｌｅ 、 聚 糖 酶 （ｙ ｎｅ 、 ｃ ｔ ａｅ 纤 ｈｉ ） ｃ ｌａ ｓ 木 ｅｕ ｓ ） ｘｌ ａｓ ａ ）
维普资讯
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９ ８・
黄 山 学 院 学 报
２ ０ 生 ０７
育对 纤 维 素 资源 的开 发 利 用有重 要 意 义 ， 是 目前 也 绿 色木霉 的＿ 个主 要研 究方 向 。纤维 素酶 是降 解纤 二
哺 酮 。宋晓 妍 ， 秀兰等 研 究表 明木 霉 Ｓ ５分泌 陈 ＭＦ 的胞 外 产 物 中 含 有 不 耐 热 的抑 菌 物 质 和 耐 热 的抑 菌 物质 ，这 两种物 质在 木霉 Ｓ ５对 棉 花黄 萎病 菌 ＭＦ 的抑 制 过程 中协 同发 挥 作 用 ．０ ￣ 加 热 ｌｍｉ １ ０（ ２ Ｏ ｎ后 ， 木霉 昕 产 生 的细胞 壁 降解 酶 失 活 ， 此该 木霉 菌株 因 还产 生 耐热 的抗 生 素类物 质 。 陈 凯 等 ㈣在 绿 色木
生素 。里 氏 木霉 因其 纤 维 素酶 产 量较 高 ， 于培 养 易
和 控 制 ， 纤 维 素 酶稳 定 性 好 ， 生 的胞 外 纤 维 素 产 产 酶 易 于 分 离 纯 化 ，培 养 及 代 谢 产 物 安 全 无 毒 等 特 点 ， 用于 生 防 外 ， 常作 为 生产 纤 维素 酶 的 菌 种 。 除 还 有研究 发现 ． 在对 植 物病 原 菌 不产 生抗 生素 的抗 生 作 用中溶 菌酶 占重要地 位 。纤维 素酶是 由木 霉 菌产 生 的主 要酶 系之 一 ， 有高 活性 纤 维 素酶 菌 株 的选 具
木霉菌抗药性研究进展
山 东 农 业 科 学
Ｓ ａ ｄ ｎ ｒ ｕｔ ｒｌ ｃ ｎ ｅ ｈ ｎ ｏ ｇＡｇｉ ｌ ａ Ｓ ｉ ｃ ｓ ｃ ｕ ｅ
２０ ０ ７年 第 ６期
木 霉 菌 抗 药 性 研 究进 展
于 雪 云 扈 进 冬 杨 合 同 ， ，
病 原 菌 表 现 拮 抗 活 性 “ 。 Ｊ
目前所 发 现的木霉 对植物 病原 菌的拮 抗作 用
是 多机 制性 的 。主要包 括 ： 代谢 几 丁质酶 、 一ｌ ３ ｊ ， ３
一
的抗性 。解决 了这个 问题 ， 能保 证 木 霉 菌 在 生 才
防中发挥 更好 的作用 。将 生物 防治与化 学 防治协
种机制协 同拮抗作用 ， 抑制病原菌生长与繁殖 。
（ ．ｉ ｎ ｒ ｍ） 几种 土壤真 菌 有 寄生 作用 ， Ｔ １ ｏｕ 对 ｇ 在土 壤 中增加 其 含量 能 够 防治 某些 致 病真 菌 ， 木霉 菌 由此引 起 人 们 的重视 。 目前 ， 已知木 霉 菌 的 ９个 种 中 ， ５种 具有生 防潜力 ， 有 当前使 用最 多 的是哈 茨木 霉 （ ． ａ ｚａ ｕ 。利 用木霉 防治 由立枯 丝 Ｔ ｈ ｒ ｉｎ ｍ） 核 菌 （ ｈｚ ｃｏ ｉ ｏａ ｉ 、 霉 菌 （ ｔｉｍ Ｒ ｉｏｔｎａ ｓｌｎ ） 腐 Ｐｙｈ ｕ
真 菌 有 拮 抗 作 用 。现 已 发 现 哈 茨 木 霉 菌 （ ． Ｔ ｈ ｒ ｉｎ ｍ） 绿 色 木 霉 菌 （ ．ｖｒ ｅ 、 氏木 霉 ａ ｚａ ｕ 、 Ｔ ｉｉ ） 康 ｄ
菌 （ ．ｋ ｎｎ ｉ） 钩 状 木 霉 菌 （ ．ｈ ｍａｕ 和 Ｔ ｏ ｉｇ ｉ 、 Ｔ ａ ｔ ｍ）
长枝 木霉 菌 （ ．１ｎ ｉｒ ｃ ｉｔｍ） Ｔ ｏ ｇｂａ ｈａｕ 等对 多种 植 物
木霉菌_胞外水解酶_拮抗大豆根腐病病原菌的机制研究_英文_
第25卷第4期2006年11月大豆科学SOYBEAN SCIENCEVol.25No.4Nov.2006Assessment of Production of Ex tracellular Enzymes by T r ichoderma spp.for Control of SoybeanRoot Rot Pathogens(Fusarium ox y sp orum,Rhiz octonia solani)*Shao H ong tao1Xu Yanli2*(1.College of Ag ricultur e,H eilongjiang University,H abin150080; 2.Northeast Institute ofGeog raphy and Agr icultural Ecolo gy,Chinese Academy of Sciences,H abin150040)Abstract The r ole of ex tracellular enzym es by T richoderm a M M35fo r co ntro l of soy bean r oot rot pathog ens(Fusarium ox y sp or um,Rhiz octonia solani)was assessed in v itro and in v ivo.De-tective levels of hydr olytic ex tracellular enzym es w er e r ecorded by Tr ichod erma M M35using dried F.ox y sp or um m ycelium as C-source in v itro or fresh F.ox y sp or um m ycelium o r fresh R.solani my celium in vivo w as found that there w ere significant increases in chitinase activities by Tr ichoderma M M35in soil w ith inoculation of F.ox y sp orum.So il infested w ith Tr ichoderma MM35had sig nificantly elevated chitinase and B-1,3-g lucanase activities in presence of R.so-lani as com pared to R.solani control.Key words T richoder ma spp.;Ro ot rot of soy bean;Mechanism;Ex tracellular enzym e,Chit-i nase;B-1,3-g lucanase中图分类号S565.1文献标识码A文章编号1000-9841(2006)04-0429-05Tr ichod erma spp.are among the most co m-m on saprophy tic fung i in the r hizo sphere.Of these,so me isolates o f T r ichoder ma spp.hav e been pro ven to be effectiv e as bioco ntro l ag ents a-g ainst a w ide range o f im po rtant airborne and soi-l borne plant pathogens[1].The proposed mecha-nism s by w hich T r ichoder ma strains antag onize patho genic populations include the pr oduction o f antibiotics and/o r fungal cell w al-l degr ading en-zymes,as w ell as com petition for nutrients in the rhizosphere[2].The plant patho gens(F.ox y sp o-rum,R.solani)causes soybean ro ot ro t w hich are major constraints to pro duction in m any soybean-g row ing regions in H eilo ng jiang province of China. T he disease is pro tected by using fung icides.Fur-therm ore,fungi also can cause many diseases in hundreds of o ther plant species.Out o f128T ri-choder ma iso lates,one str ain Tr ichod erma M M35 w as screened w ith g ood bio control ag ainst soybean ro ot ro t pathogens.With a view to establish that the mechanism in the pr ocess of antagonism of F. ox y sp or um o r R.solani by the new ly isolated str ain involves the release of hydrolytic enzym es by the latter,the o bjectives of this study w ere to de-ter mine the pr oduction of chitinase and B-1,3-g lu-canase in vitr o and in v ivo,and to assess the role*收稿日期:2006-01-04基金项目:黑龙江省重点项目(GB01B201);黑龙江大学青年教师基金项目(QL200445)作者简介:邵红涛(1978-),男,助教,从事土壤微生物学教学,E-m ail:s haohongtao2003@430大豆科学4期of these enzy mes in antagonism.1M aterials and M ethods1.1Microorganisms and cultivationTr ichoderma M M35(iso lated from soy bean rotation plots o f H ailun eco logy resear ch of Ch-i nese Academy o f Sciences and ever tested w ith bio-control ability,data show n in table1and soy bean root rot pathog ens(F.ox y sp orum,R.solani).PDA,synthetic medium(in grams per liter): NH4NO35g,KH2PO410g,NaCl1g,MgSO4# 7H2O0.5g,H2O1000mL[pH6.5],w heat bran medium(wheat bran:sawdust15g:15g,moistened with30mL water and sterilized for15min at121e).1.2Antagonism of Trichoderma MM35against F.oxysp orum or R.solani in vitroAntago nism of T r ichoder ma M M35ag ainst F.ox y sp or um or R.solani in vitr o w as observed by the metho d proposed by Elad et al[3].1.3Preparation of dried myceliumDried m ycelium of F.ox y sp or um was pr e-pared by the method proposed by E-l Katatny[4]. 1.4Preparation of the inoculum used for infestingthe potting mixtureFour discs(5m m diam eter)w er e cut from the edge o f g row ing T richoderm a M M35colony o n PDA and added to the50mL flask containing20g w heat bran medium.T he flasks w ere incubated at 25e in darkness fo r7days.100g kafirin w as add-ed into an Erlenm ey er flask(250mL),m oistened 12h,sterilized at121e for30min o n each of tw o consecutive day s.Five disks fro m the m ar gin o f a colo ny of F.ox y sp or um g row ing on PDA w er e tr ansferred to the flask.The flask w as incubated fo r10day s.The same pro cedure w as follow ed for R.solani.All of the inoculums w ere stored at4e fo r used.1.5Conditions for enzyme production by Tri-choderma MM35^Four discs o f5m m diameter(cut fro m the edge o f actively Tr ichod erma MM35colo ny g row-ing on PDA)w ere inoculated in500m L flask w ith 200mL sy nthetic m edium supplem ented w ith the m ycelium of F.ox y sp or um(0.5g/L),incubated at150rpm on a rotar y shaker for5day s at28e. 10ml cultures w ere sam pled after ino culation at24 h,48h,72h,96h,120h,then centrifuged at 4e for20m in at10000g and the clear superna-tants w ere stor ed at-20e until assay ed.T he ex-perim ent w as replicated tw ice,five replicates fo r each treatm ent.1.6Preparation and inoculation of the potting mixPotting medium w as prepared w ith300g ster-i lized soil and infested w ith F.ox y sp orum ino culum or R.solani inoculum at a rate of5%,or T ri-choder ma MM35inoculum at a rate of2.5%.The experimental desig n included the follow ing treat-ments:(ⅰ)no T r ichoder ma M M35o r F.ox y sp o-r um or R.solani,(ⅱ) F.ox y sp or um but no T ri-choder ma M M35,(ⅲ)R.solani but no T ri-choder ma M M35,(ⅳ) F.ox y sp or um and T ri-choder ma MM35,and(ⅴ)R.so lani and T ri-choder ma MM35.M ix ing was accomplished by ro-tation in inflated plastic bags.Each combination w as placed in18@12@6.5cm plo ts.5g of sub-strate w as sampled for each treatment6to16days after inoculation.Soil samples w ere placed in plas-tic tubes and10mL sterile potassium phosphate (pH6.4)w ere added,g ently stirred for4hours, and then centr ifuged at8000g for20m in at4e. T he supernatants w ere stored at-20e until as-sayed.T he ex perim ent w as conducted tw ice.Each treatm ent w as replicated five times.1.7Enzyme activity assaysT he activ ities of chitinase and B-1,3-glucanase w ere assayed using the color im etric method pro-posed by M olano et al.[4]and ex pressed in nanmo l/ m in/m L or nanmol/min/g and L m ol/m in/m L o r L mo l/min/g,respectively.2ResultsObvious parasitism w as observ ed in interac-tion of T r ichoder ma MM35w ith R.solani by m-i cr oscopy(Fig.1),how ev er,there w as no parasit-4期邵红涛等:木霉菌(胞外水解酶)拮抗大豆根腐病病原菌的机制研究431ism in interaction of T richoder ma M M35w ith F.ox y sp orum(data not s how).Detective levels of hydro lytic extracellular en-zymes w er e recor ded by Tr ichoderma M M35usingdried F.ox y sp or um m ycelium as C-so urce invitr o.The productio n of hydroly tic ex tracellularenzy mes by T richod erm a M M35w as time depend-ent.T he sig nificant elevatio n in the productio n o fB-1,3-g lucanases w as after24h,w hilst that o fchitinase appear ed to significantly increase after72h(Fig.2,Fig.3).T able1T he r esult of g reenho use test(the fir st time)Tr eatm ent a Diseas e incidence(%)Diseas eindexRelative controleffec(%)CK(F.oxy sporu m)86.9540.86-CK(C arbendazim)24.138.9678.07 M M3559.3713.7566.34(the seco nd time)T reatmen t a Diseas e incidence(%)Diseas eindexRelative controleffect(%)CK(F.ox ysp orum)a61.5322.30-C K(Carben dazim)b34.48 6.8969.1M M3551.8516.2926.95 a CK(F.oxy sp oru m)con trol treated w ith F.ox ysp orum CK(Carb endazim)control treated w ith F.oxy sp orum and Carben-daz imM M35treatment w ith T richode rma M M35and F.oxy sporu m Detective levels of hydroly tic ex tracellular en-zy mes w er e also reco rded by T r ichoder ma M M35 in soil in presence of fr esh F.ox y sp or um my cel-i um or fresh R.solani m ycelium in situ(table2, table3).T here w ere significant increases in chit-i nase activities at day4,day9and day16by T ri-choder ma MM35in so il w ith inoculation o f F.ox-y sp orum as compared to F.ox y sp or um contro l (table2).Soil infested w ith Tr ichoder ma M M35 had significantly elevated chitinase activities at day 4and day12,and B-1,3-g lucanase activities at day 4,day9,day12and day16in presence of R.sola-ni as compared to R.solani contr ol(table2,table 3).Sig nificant elevations in chitinase,B-1,3-g lu-canase activities w ere also recorded in soil infested w ith T r ichoder ma MM35o nly in com parison to F. ox y sp or um or R.solani control at day4(table2, table3).T able2Effect o f T r ichoder ma, F.ox y s p or um and R.sol ani on the activity of chitinase in the so ilSoi-l T reatmen t4day9day12day16day T+F a22.84?4.79ab b46.98?27.99a13.84?5.87b43.33?12.98a T+R28.31?14.91a9.52?4.00b32.78?13.55a9.52?8.20bT28.72?18.55a15.28?3.82b 2.75?0.81b49.82?31.65aF 3.36?1.79c 5.46?1.87b11.14?4.95b11.43?4.01bR8.43?3.97bc 1.74?0.17b 1.77?0.15b 1.84?0.10ba T+F=Tr ic hod er ma M M35and F.ox ysp or um;T+R=T richoder ma M M35and R.solani;T=T richode rma M M35;F= F.ox ysp or um;R=R.solani;the activity of chitinase ex pres sed as n anm ol/min/gb the mean s and s tandard error are ob tained from five replicates,values followed by th e s ame letter by column w ere not sign ificantly differ-ent by Duncan's test(a=0.05)T able3Effect o f T r ichoder ma, F.ox y sp or um and R.so lani on the activit y of B-1,3-glucanase in the so ilSoi-l T reatmen t4day9day12day16day T+F a0.600?0.119b b ND c0.91?0.37b 1.27?0.22bT+R19.697?3.604a20.91?0.14a10.77?2.78a14.85?4.38aT19.692?3.604a ND0.06?0.11b NDF0.004?0.005b ND0.28?0.01b NDR0.003?0.005b ND ND NDa T+F=Tr ic hod er ma M M35and F.ox ysp or um;T+R=T richoder ma M M35and R.solani;T=T richode rma M M35;F= F.ox ysp or um;R=R.solani;the activity of B-1,3-glucanase expressed as umol/min/gb M eans follow ed by th e sam e letter b y column w ere n ot significantly different by Duncan.s test(a=0.05)c ND n ot detected432 大豆科学4期3 DiscussionSo me so ilbor ne fung i,w hich are potentially useful as biocntrol ag ents,are know n to secret chitinoly tic enzymes and endog lucanases in situ [5].Pro duction of extracellular B -1,3-glucanases,chit-i nases,and pro teinase increases significantly w hen Tr ichoderma spp.ar e g row n in media supplemen-Fig.1 T richoderma M M 35parasite R.s olani (@400)ted w ith either auto claved m ycelium or isolated pu -r ified host fungal cell w alls[6].T hese observa -tions,tog ether w ith the fact that chitin,B -1,3-glu -can and pro tein ar e the main str uctural components of most fungal cell w alls,are the basis for the sug -g estion that hydr olytic enzym es pr oduced by som e Tr ichoderma spp.play an impo rtant ro le in de -struction of plant patho gens[4].F ig.2 A ctivity of chitinase produced by T r icho der ma M M 35in shaking cultureThe levels and order of enzy mes productio n by Tr ichoderma M M35induced by dried F.ox y sp o -rum inoculum as carbo n so urce r eflected the struc -Fig.3 Activity o f B -1,3-g lucanase pro duced by T r ichoder maM M 35in shaking cultur etur e and contents o f chitin and B -g lucan in the cell w all o f F.ox y sp orum .The result show ed that the productio n of B -1,3-g lucanases was induced before that of chitinases,w hilst the levels o f B -1,3-g lu -canase productio n w as more hig her than that of chitinase.Changes in soil enzymes activitiessho wed that patho gen F.ox y sp or um could so me -w hat repr ess the productio n of B -1,3-glucanase(day 9),w hile productio n of chitinase w as not re -pressed.All of these sug gested that the content of B -g lucan w as more than that of chitin in the cell w all of F.ox y sp or um ,and the chitin layers in cell w all appeared to be bur ied in B -g lucan,rendering little chitin to expose outside.Enzym es pr oductions w er e repressed w ith fresh my celium of F.ox y sp or um in so il;how ev er,ther e w as a continuo us increase in enzy mes produc -tion w ith dried m ycelium of F.ox y sp or um .The effect might be a result of some metabolites pro -duced by patho gen F.ox y sp or um against antago -nists,the m echanism by patho gen F.ox y sp or um against antag onists required further investig ation.Cotes et al.(1994)show ed a significant co rre -latio n betw een the ability o f several iso lates of T ri -choder ma to control R.solani in bean and chitinas -es activities [7].A ltho ug h there was no parasitism in interaction of Tr ichoderma MM 35with F.ox-y sp orum in vitro,chitinase activity w as still sig nif -icantly hig her in soil infested w ith F.ox y sp or um and T richoder ma M M35in v ivo ,and activities of chitinase and B -1,3-glucanase w ere sig nificantly higher in soil infested w ith R.solani and T ri -4期邵红涛等:木霉菌(胞外水解酶)拮抗大豆根腐病病原菌的机制研究433choderma M M35.Ex tr acellular hydroly tic enzy mes pro duced by T richoder ma spp.may assist antag o-nists in w arding o ff phy to patho gens.T he increases in hydro lytic ex tracellular enzy mes activities in soil caused by inoculation o f T richoderm a M M35in presence of pathog ens could be related to biolo gical control activities.References1Harmen,G.E M yths and dogm as of biocon trol changes in percep-tion s derived from res earch on T richoderma harzianum T-22 [J].Plant Disease.2000,(4):377-93.2Yedidia,I.,Benhamou,N.,Kapulnik,Y.,et al.Induction and accum ulation of PR proteins activity during early stages of root colonization by th e mycoparas ite Trichoderm a harzian um strain T-203[J].Plant Physiol.Bioch em.2000,(38):863-873.3Elad,Y.,Chet,P.Boyle,I.,et al.Parasitism of Trichodermas pp.on Rh izoctonia solani and Sclerotium rolfsi-i scanning elec-tron micros copy and fluores cen ce microscopy[J].Phytopath olo-gy.1983,73:85-88.4E-l Katatny,M.H.,Robra,et al.Production of chitin as e and B-1,3-glucanase by T richoderma harzianum for control of the phy-topath ogenic fungus Sclerotium rolfsii[J].Food T echnol.Bio-technol.2000,38(3):173-180.5Lorito,M.,H ay es,C.K.,Di Pietro,A.,et al.Purification, char acterization and syn ergistic activity of a glu can B-1,3-glucos-i dase and an N-Acety-l B-glucosaminidase from T rich oderma h arz-i anum[J].Phytopathology.1994,84:398-405.6De la Cruz,JA Pintor T oro,T Benitez,et al.A n ovel endo-be-ta-1,3-glu can as e,BGN13.1,involved in the m ycoparasitis m of T rich od erma harz ianu m[J].Bacteriol.1995,177:6937-6945. 7Cotes, A.M.,Th on art,P.,L eepoivre,P.Relations hip be-tw een th e protective activities of s everal strain s of Tr ic hod er ma again st dampin g-off agents and th eir ability to produce hydrolytic enzymes activities in soil or in s ynthetic m edia.M eded.Fac.Landbouw kd.T oegepaste Bio.Wet.1994,59:931-941.木霉菌(胞外水解酶)拮抗大豆根腐病病原菌的机制研究邵红涛1许艳丽2*(1.黑龙江大学农学院,哈尔滨150080;2.中国科学院东北地理与农业生态研究所,哈尔滨150040)摘要通过室内试验与温室试验研究了具有生防能力的木霉菌株T richod erm a MM35所分泌的胞外水解酶在拮抗大豆根腐病病原菌(F.ox y sp or um、R.solani)中的作用。
哈茨木霉生物防治研究进展ResearchProgressofBiocontrolEffecto..
哈茨木霉生物防治研究进展吕黎，许丽媛，罗志威，周艳，郭帅，丰来（湖南泰谷生物科技股份有限公司，湖南长沙410205）摘要：木霉被认为是最有希望的生物防治因子，而哈茨木霉是木霉属中应用最为广泛的菌株。
从哈茨木霉的生防效果、生防作用机制以及基因水平上的抗生机制等方面的研究进展进行了综述，并阐述了哈茨木霉可能的应用前景。
关键词：哈茨木霉；生防机制；研究进展中图分类号：C915文献标识码：A文章编号：1006-060X（2013）17-0092-04Research Progress of Biocontrol Effect of Trichoderma harzianumLV Li,XU Li-yuan,LUO Zhi-wei,ZHOU Yan,GUO Shuai,FENG Lai（Hunan Taigu Bio-Tech Co.,Ltd.,Changsha 410205,PRC ）Abstract:Trichoderma is the most promising isolated soil fungi for their ability to protect plants and contain pathogenpopulations under different soil conditions.While Trichoderma harzianum is the most commonly applied strain among Trichoderma .The biocontrol effect,the biocontrol mechanism,and the antibiotic mechanism at the gene level of Trichoderma harzianum were summarized,and the applying future of it was elaborated.Key words:Trichoderma harzianum ;bio-control mechanism;research progress 收稿日期：2013-07-08基金项目：湖南省农业科技成果转化资金项目（2013NK4009）作者简介：吕黎（1985-），女，河南信阳市人，实习研究员，硕士，主要从事微生物工程和菌株遗传改良研究。
食用菌致病木霉的鉴定、致病机理及防治研究
食用菌致病木霉的鉴定、致病机理及防治研究一、本文概述《食用菌致病木霉的鉴定、致病机理及防治研究》是一篇旨在深入探究食用菌生产中常见病原菌——木霉的鉴定方法、致病机理及有效防治策略的研究论文。
本文概述部分将简要介绍食用菌产业的重要性、木霉病害的严重性、研究的必要性和重要性，以及本文的主要研究内容和方法。
本文将概述食用菌产业在全球范围内的快速发展及其在经济、营养和健康方面的重要贡献。
接着，将重点分析木霉病害对食用菌生产的影响，包括病害症状、传播途径和危害程度，以突显研究的紧迫性和重要性。
本文将阐述木霉鉴定的研究现状和方法，包括传统形态学鉴定和分子生物学鉴定等，旨在为后续研究提供准确、可靠的病原菌鉴定依据。
接着，本文将详细介绍木霉的致病机理研究，包括木霉与食用菌的互作关系、侵染过程和致病因子等，以揭示木霉病害发生的内在规律和机制。
本文将探讨防治木霉病害的有效策略和方法，包括抗病育种、农业防治、生物防治和化学防治等，以期为食用菌产业的健康、可持续发展提供科学依据和技术支持。
本文旨在全面、系统地研究食用菌致病木霉的鉴定、致病机理及防治策略，以期为食用菌产业的健康、可持续发展提供理论支撑和实践指导。
二、文献综述食用菌作为一类重要的食用和药用真菌，在全球的农业生产中占有重要地位。
然而，随着食用菌产业的快速发展，各种病害问题也日益严重，其中由木霉属真菌引起的病害尤为突出。
木霉是一类广泛存在于土壤中的真菌，其中部分种类具有致病性，能够侵染食用菌菌丝体和子实体，造成严重的经济损失。
因此，对食用菌致病木霉的鉴定、致病机理及防治研究具有重要的理论和实践意义。
在食用菌致病木霉的鉴定方面，传统的方法主要依赖于形态学特征和培养特性。
然而，这种方法耗时耗力，且准确性受多种因素影响。
近年来，分子生物学技术的发展为木霉的鉴定提供了新的手段。
通过PCR扩增和测序技术，可以快速准确地鉴定木霉的种类和遗传背景，为后续的致病机理和防治研究提供了基础。
8种胞外酶在香菇不同生长阶段的活性变化
8种胞外酶在香菇不同生长阶段的活性变化王伟科;陆娜;周祖法;宋吉玲;袁卫东;闫静【摘要】研究了香菇生长过程不同阶段胞外酶纤维素酶系(羧甲基纤维素酶、滤纸纤维素酶、β-葡萄糖苷酶)、木质素酶系(漆酶、愈创木酚酶、多酚氧化酶)、淀粉酶、半纤维素酶的活性变化.结果表明,香菇生长不同阶段均能检测到上述8种酶的活性,说明这些酶参与了香菇生长发育的全过程.各种酶活性峰值出现时间不尽相同,木质素酶的活性高峰出现在营养生长期,纤维素酶的活性高峰出现在生殖生长期,说明香菇生长过程中优先利用木质素.8种酶活性在香菇生殖生长阶段变化趋势较一致,从原基形成到子实体成熟均呈现逐步下降趋势.【期刊名称】《浙江农业科学》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】4页(P498-501)【关键词】胞外酶活性;香菇;不同生长阶段;变化规律【作者】王伟科;陆娜;周祖法;宋吉玲;袁卫东;闫静【作者单位】浙江省杭州市农业科学研究院,浙江杭州310024;浙江省杭州市农业科学研究院,浙江杭州310024;浙江省杭州市农业科学研究院,浙江杭州310024;浙江省杭州市农业科学研究院,浙江杭州310024;浙江省杭州市农业科学研究院,浙江杭州310024;浙江省杭州市农业科学研究院,浙江杭州310024【正文语种】中文【中图分类】S646香菇属担子菌纲、伞菌目、侧耳科、香菇属［1］,其主要栽培基质是杂木屑。
香菇生长过程中所需的营养主要通过菌丝向胞外分泌各种酶将木质纤维素及其他有机大分子物质降解后再吸收进细胞,并转化为蛋白及多糖等［2］获取。
研究不同培养条件对香菇胞外酶活性影响的报道较为多见,但对香菇从菌丝生长到子实体成熟采收全过程中的酶活性变化研究报道甚为少见,为此测定并分析了8种胞外酶在香菇生长过程6个重要阶段的活性及变化过程,旨在深入了解香菇对栽培基质的降解利用规律和生长发育过程中的生理变化,为栽培基质配方的设置提供理论依据。
现将有关结果报道如下。
大球盖菇栽培期间胞外酶活性变化研究
中国食用菌2014，33（1）：48 50EDIBLE FUNGI OF CHINACN53－1054/Q ISSN 1003－8310作者简介：于萍（1990－），在读硕士研究生，主要从事特种植物资源与生物技术研究。
*通信作者收稿日期：2013－11－19大球盖菇栽培期间胞外酶活性变化研究于萍，孙萌，傅常娥，陈艳秋*，尹勇刚（延边大学农学院，吉林延吉133002）摘要：大球盖菇是一种清香美味、营养丰富的珍稀食用菌，其对农田废弃物如稻草、秸秆等具有很好的降解能力。
因此，本试验对不同培养料栽培大球盖菇期间降解木质纤维素的胞外酶活性进行了研究。
结果表明，在不同栽培基质中各个酶的活性变化规律基本一致，除了β－葡萄糖苷酶外，其他酶均在菌丝生长期和子实体发育期活性较高，CMC 酶和FP 酶在菌丝生长中期和子实体成熟期酶活性最高，HC 酶和漆酶在菌丝生长前期和子实体成熟期酶活性最高。
所有的酶均在稻草和玉米秸秆培养料中表现出了较高的酶活性，而在木屑培养料和玉米芯培养料中酶活性相对较弱。
关键词：大球盖菇;栽培基质;胞外酶中图分类号：S646.9文献标志码：A 文章编号：1003－8310（2014）01－0048－03Extracellular Enzyme Production by Stropharia rugosoannulataFarlow During Cultivation on Ｒaw MaterialsYU Ping ，SUN Meng ，Fu Chang-e ，CHEN Yan-qiu ，YIN Yong-gang（Agricultural College of Yanbian University ，Yanji Jilin 133002）Abstract ：Stropharia rugosoannulata Farlow ，a kind of delicious ，nutritious but rare mushroom ，had an excellent ability of deg-radation on farmland wastes like straws and cornstalks．Therefore ，the activity changing regulation of extracellular enzymes in cul-tivation were studied．The results suggested that the activities changing regulation of different extracellular enzymes in each cul-ture media were basic unanimously．Enzymes except β－glucosaccharase showed higher activities during both mycelia growingperiod and fruiting body stage．CMCase and FPase showed high activities in the middle of mycelia growing period and fruiting body mature stage ，and HCase and laccase showed high activities in the early stage of mycelia growing period and fruiting body mature stage．All enzymes showed higher activities in rice straw and maize straw ，while kept relatively low activities in sawdust and corncob substrates．Key words ：Stropharia rugosoannulata ；Cultivation media ；Extracellular enzymes大球盖菇（Stropharia rugosoannulata Farlow ），别名皱环球盖菇、皱球盖菇、酒红大球盖菇、裴氏球盖菇、裴氏假黑伞，属于担子菌亚门（Basidomycota ）、层菌纲（Hyme-nomycetes ）、伞菌目（Agaricales ）、球盖菇科（Strophariace-ae ）、球盖菇属（假黑伞属）（Stropharia ）［1］。
平菇栽培种培养过程中胞外酶活性变化的研究
ｌｌｓ Ｃ ａ ｅ ｕｏｅ（ ＭＣ ｓ ），ｆ ｔｒｐ ｐ ｒｃ ｌ ｌｓ （ Ｐ ｓ ） ｙａ ａｅ ｍｙａｅ ａ ｄ ｐ ｏｅ ｓ ｅ ｒａｅ ｉ ｅ ａ ｅ ｅｌ ａｅ Ｆ ａ ｅ ，ｘ ｌｎ ｓ ，ａ ｌｓ ｎ ｒｔａｅ ｄ ｃｅ ｓｄ，ｗ ｉ ｌ ｕ ｈｌ ｅ
ｔ ａ ｆｌｃ ａ ｅ ａ ｄ ｐ ｒｘ ｄ ｓ ｎ ｒ ａ ｅ ｌ ｎ ｔ ｈｅ ｄ ｌｙｎｇ ｏ ｈ ｕ ｔ ｒｎ ｅ ｉｄ ． Ｔｈ ｃｉｉ ｈ ｔｏ ａ ｃ ｓ ｎ ｅ ｏ ｉ ａ ｅ ｉ ｃ ｅ ｓ ｄ ａｏ ｇ ｗｉ ｔ ｅ ａ ｉ ｆｔ ｅ ｃ ｌｕ ｉｇ ｐ ｒｏ ｓ ｈ ｅ ａ ｔｖｔ ｙ ｃ ａ ｇ ｅ ｄ ｎｃ ｆｄｉ ｅ ｅ ａ ｔ ｒａ ｔａ ｎ ｈ ｗｅ ｏ ｅ ｄｆｅ ｅ ｃ ｈ ｎ ｅ ｔ ｎ ｅ ｙ ｏ ｆ ｒ ｎｔｂ ｃ￣ ｓｒ ｉ ｓｓ ｏ ｄ ｓ ｍ ｉ ｒ ｎ ｅ．Ｔｈ ｓｓｕ ｙ ｈ ｓｌｉ ｏ ｄ ｆｕ ｆ Ｉ ｆ ｉ ｔ ｄ ａ ａｄ ａ ｇ ｏ ｏ ｎ— ｄａｉｎ ｆｒｔ ｅ ｐ ｙ ｉ ｌｇｃ ｌｒ ｓ ａｃ ｆＰｌｕ ｏ ｕ ｓｒａ ｕ ． ｔ ｏ ｈ ｈ ｓｏ ｏ ｉａ ｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｅ ｒ ｔｓ ｏ ｔｅ ｔｓ ｏ Ｋｅ ｒ ｙ ｗｏ ｄｓ： ｄ ｂ ｅ ｆ ｎｇ ； Ｐｌｕ ｏ ｕ ｓｒ ａ ｕ ｅ ｉ ｌ ｕ ｉ ｅ ｒ ｔｓ ｏ ｔｅ ｔｓ；ｃ ｈ ｖ ｒ；ｅ ｔａ ｅｌ ｌｒｅ ｚ ｍ ｅ ｕ ｉａ ｘｒ ｃ ｌ ａ ｎ ｙ ｕ
平 菇 栽 培 种 培 养 过 程 中胞 外 酶 活 性 变 化 的 研 究
庄庆利 ， 冠军 ， 李 申进 文
（ 南农 业大 学生命科 学学院 ， 河 河南 郑 州 ４ ０ ０ ） ５０２
摘要 ： 用棉 籽 壳 为 主 料 制 作 平 菇 栽 培 种 ， 利 测定 其 生 长发 育过 程 中几 种 胞 外 酶 活 性 变化 情 况 ． 果 表 明 ， 平 菇 结 在 栽 培 种培 养过 程 中 ， 甲基 纤 维 素 酶 、 纸 纤 维 素酶 、 聚 糖 酶 、 粉 酶 和 蛋 白 酶 活 性 整 体 上 随 时 间 延 长 呈 下 降 羧 滤 木 淀 趋 势 ； 酶 和 过 氧 化 物 酶 活 性 整 体 上 随 时 间延 长 呈 上 升 趋 势 ， 不 同菌 株 的 酶 活 变化 趋 势 有所 差异 ． 研 究 为 平 漆 但 本
体外酶修饰技术的研究进展
体外酶修饰技术的研究进展体外酶修饰技术是近年来发展迅速的一种生物学技术，它可以将特定的蛋白质分子中的氨基酸残基进行化学修饰，在保持蛋白质结构和功能的前提下改变其生理化学性质。
这种技术在药物研究、生命科学研究和工业生产等领域得到了广泛应用，对于推动科学进步和经济发展具有重要意义。
一、技术原理体外酶修饰技术的原理是利用生物学酶类催化作用进行组分化学修饰，可将不同的化合物与蛋白质之间的化学键结合，从而改变其生理化学性质，并得到功能更加多样化和复杂化的蛋白质。
通常使用的酶有亲核性活性较强的酯酶、磷酸酯酶和亲电性活性较强的脱氢酶、氧化酶等，通过与蛋白质分子的特定氨基酸残基结合，可以实现特定结构上的化学修饰，从而改变其生物学性质。
二、应用领域1、药物研究体外酶修饰技术对于药物研究具有重要作用。
利用该技术，可以将生物靶标蛋白质进行特定的改性，从而用于药物筛选和评估中。
将药物与蛋白质分子相结合可以提高其药物活性，并增加针对性，从而提高了药物的治疗效果。
利用该技术可以将药物蛋白相结合的方式，从而形成新的化合物类别，可以扩大药物的适应症和适应性，使得药物能够更好地适应不同的治疗需求。
2、分子检测和诊断利用分子检测和诊断可以提高对疾病的诊断和预测性，从而实现更为精准的疾病治疗。
利用体外酶修饰技术，可以针对分子检测和诊断的不同需求与目标，调整修饰的方式和方法，从而进行精准化的蛋白质标记和检测，在疾病诊断和监测过程中起到了重要作用。
3、生物科学研究体外酶修饰技术也在生物科学研究中得到了广泛应用。
通过该技术，可以对蛋白质进行调控和改变其生物学性质，从而研究蛋白质与其他生物分子之间的相互作用关系、信号传递机制，以及参与了生物活动的不同蛋白质所具有的特定生理功能等，为生物科学研究提供了新的思路和方法。
4、工业生产在工业生产中，体外酶修饰技术也扮演着重要的角色。
许多生物化学生产过程中，需要利用特殊的蛋白质催化反应，以实现目标产物的合成和分离等技术目标。
木霉胞外蛋白酶的研究进展
收稿ｆ１期：２００９．１２－０８ 基金项日：农业部９４８项目（２００９．ｚ３９）
作者简介：陈蕾蕾（１９８２一）。女。博士，助研，ｃｈｅｎｌｅｉｌｅｉ＠ｙａｈｏｏ．ｃｎ；＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｕｆｆ＠Ⅻ．ａｃ．ｃｎ。
３５９
万方数据
中国生物防治
第２６卷
木霉在重寄生过程中能够侵入或穿透寄主菌丝细胞，同时分泌几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶、纤 维素酶及脂酶等一系列水解酶，消解病原菌的细胞壁，这类酶统称为细胞壁降解酶。木霉胞外 蛋白酶是一类重要的细胞壁降解酶，通过参与木霉与病原菌之间的营养竞争，失活钝化病原菌 胞外酶，降解病原菌细胞壁中蛋白质组分等途径，协同其它细胞壁降解酶参与木霉对病原菌的 防治旧，３ Ｊ。此外，木霉胞外蛋白酶在根结线虫的生物防治中也发挥着重要作用。但是相对于 几丁质酶和葡聚糖酶，对蛋白酶在木霉防治病原菌和根结线虫中所起的作用了解较少。
ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ
ｗａｌｌ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｓｐｐ．ｉｓ ｒｏｏｔ・ｋｎｏｔ
ａｎｄ
ｎｅｍａｔｏｄｅ
ｃｕｔｉｃｌｅｓ，ｅｔｃ．Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｐｍｔｅａｓｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｏｎ
Ｔｒ／ｃｈｏｄｅｒｍａ
ｄｉｓ—
ｎｅ—
ｃｕｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ，ｗｉｔｈ ｅｍｐｈａｓｉｓ
１木霉胞外蛋白酶的种类及组成
蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，生物体许多生理活动和疾病发生都与蛋白酶相关。蛋 白酶有多种分类方式，根据最适作用ｐＨ值的不同，蛋白酶分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱 性蛋白酶；根据活性中心的不同，蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶 和半胱氨酸蛋白酶；而根据酶切位置的不同，蛋白酶又分为外肽酶和内肽酶。 木霉是重要的微生物蛋白酶来源，许多研究证明木霉具有复杂的胞外蛋白水解酶类系统， 并且培养条件的不同可影响胞外蛋白酶的种类及组成。Ｄｅｌｇａｄｏ．Ｊａｒａｎａ等Ｈ Ｊ采用等电聚焦的方 法在哈茨木霉（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）发酵液中检测到几种酸性、中性以及碱性蛋白酶的存在；同时发 现酸性蛋白酶的合成受发酵液ｐＨ值调控，酵母膏、蛋白胨以及干酪素可诱导其产生；而碱性 和中性蛋白酶仅被乳糖和几丁质诱导或是在碳饥饿的情况下产生。Ａｎｔａｌ等【５ Ｊ比较深绿木霉 （Ｔ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ）、哈茨木霉和绿色木霉（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）的胞外蛋白酶酶谱，发现这３种木霉都可以 分泌胰蛋白酶类似蛋白酶和胰凝乳蛋白酶类似蛋白酶。经热失活的枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）细胞壁诱导，哈茨木霉可分泌３个胰蛋白酶类似蛋白酶（分子量分别为５ｋＤ、１３ｋＤ和 １９ｋＤ）和６个胰凝乳蛋白酶类似蛋白酶（分子量在１２—４３ｋＤ之间）【６ Ｊ。而同样的诱导条件下， 绿色木霉的发酵上清液中也至少检测到６种蛋白酶∽Ｊ。环境因子对木霉胞外蛋白酶的影响近 年来也有报道。适冷木霉可在１０。Ｃ分泌具有类似胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的多种蛋白 酶，并且这些蛋白酶具有很好的适冷性，在５℃的低温条件下仍能保持良好的活力；除此之外， 这些适冷蛋白酶可以在低水活度（ｎ。＝０．９５—０．８６）及碱性条件（ｐＨ８．０—９．Ｏ）下保持活力【８ｊ。 Ｋｒｅｄｉｃｓ等旧Ｊ还研究了不同金属离子对木霉产蛋白酶的影响，研究发现汞强烈抑制木霉蛋白酶 的活力，铝、铜和铅对蛋白酶的活力有一定的抑制作用，而镍、钴、镉、锌、锰和铁没有明显的抑 制效果。综上研究表明，木霉可以产生不同类型的蛋白酶，具有复杂的胞外蛋白水解系统，而 且木霉蛋白酶可以在不利于菌丝生长的条件下长期保持活力。
液体培养条件下绿色木霉 Tr9701胞外酶及还原糖动态变化研究
液体培养条件下绿色木霉 Tr9701胞外酶及还原糖动态变化研究王勇;高苇;张春祥;霍建飞;李健强;罗来鑫【摘要】In order to improve the rate of fermentation and exploit Trichoderma Tr9701 ,the effect of liquid cul-ture on different extracellular enzyme activity and the dynamic changes of reducing sugar content were studied.The results showed that at 25 ℃,1 1 0 r /min thermostatic culture conditions,biomass of green Trichoderma hyphae reached the peak in the 6 -1 0 d;the pH value of the fermentation liquid occurs in the first 6 -1 0 d turning gradual-ly increased,then remained stable;extracellular proteins,extracellular sugar reached peak at 6,1 2 d,the secretion of guaiacol oxidase and polyphenol oxidase with a periodic curve of 5 -6 d presents the enhancement curve type.The extracellularamylase,extracellular CMCase activity increased significantly in the early culture period,and the activi-ty of extracellular CMCase was significantly higher than that of amylase and sucrose invertase in liquid fermentation. For realizing the scale fermentation of Trichoderma viride Tr9701 ,we should be determined the fermentation process according to the changes of extra-cellular enzyme activity and reducing sugar consistency during the Submerged cul-ture of Tirchoderma viride.%为提高绿色木霉 Tr9701的发酵速率，实现其有效开发，对绿色木霉 Tr9701液体培养过程中不同胞外酶活性和还原糖含量的动态变化进行了研究。
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中图分类号：￥４８２ห้องสมุดไป่ตู้２９２；Ｑ９３６
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＣＨＥＮ Ｌｅｉ—ｌｅｉ，ＷＡＮＧ Ｗｅｉ－ｍｉｎｇ，ＺＨＵ
Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ
ｆｒｏｍ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ
Ｑｉｎｇ—ｊｕｎ，ＬＩＵ
Ｘｉａｏ—ｙｏｎｇ，ＤＵ
Ｆａｎｇ—ｌｉｎｇ。
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｗ－Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒ／ｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．，舾ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
２６（３）３５９—３６４
中国生物防治Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ
２０１０年８月
木霉胞外蛋白酶的研究进展
陈蕾蕾，王未名，祝清俊，刘孝永，杜方岭’
（山东省农业科学院农产品研究所，济南２５０１００）
摘要：木霉菌Ｔｒ／ｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．是重要的农业微生物资源，在植物病原菌和根结线虫的生物防 治中发挥重要的作用。木霉菌具有复杂的胞外蛋白水解系统，可以分泌大量多种胞外蛋白酶， 是细胞壁降解酶的重要组分。胞外蛋白酶通过参与营养竞争，协同降解植物病原菌细胞壁和 根结线虫体壁等多种途径参与木霉的生物防治。本文就国内外木霉胞外蛋白酶的研究现状及 其在木霉菌防治植物病原菌和根结线虫中所起的作用进行了论述。 关 键 词：木霉；胞外蛋白酶；生物防治；植物病原菌；根结线虫 文献标识码：Ａ 文章编号：１００５．９２６１（２０１０）０３．０３５９．０６
２胞外蛋白酶的分离纯化、理化特性及其基因克隆
近些年，从木霉菌中分离到多种胞外蛋白酶，多为丝氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶（表 １）。蛋白酶分子量范围为２１—４５ｋＤ，大小不等。不同木霉菌株之间可以产生分子量、氨基酸 序列和核酸序列类似的蛋白酶。Ｇｅｒｅｍｉａ等¨驯从黄绿木霉（Ｔ．ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）分离纯化到１个与枯 草杆菌素类似的碱性丝氨酸蛋白酶ＰＲＢＩ，类似的蛋白酶在哈茨木霉中也被分离到。另外１个 胰蛋白酶类似的丝氨酸蛋白酶ＰＲＡＩ从哈茨木霉和绿色木霉中纯化得到；而且ＰＲＡＩ被证实 有杀线虫的功效，能明显降低南方根结线虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）卵的孵化率¨川。瑞氏木霉 （Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）在添加纤维素酶诱导剂的情况下可分泌酸性天冬氨酸蛋白酶，Ｈａａｂ等【１２】利用分子
ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＭＹＲＥｓ）【ｍＪ。Ｏ｜ｍｅｄｏ．Ｍｏｎｆｉｌ等¨４Ｊ认为在这４
个ＭＹＲＥｓ位点中有２个是重寄生过程诱导加１表达所必需的；研究还发现ｐｒ６１的表达受葡
萄糖的抑制，并且在氮代谢被阻遏的条件下该基因也不能表达。
裹不同木霉■株来源的臆外叠白ｔ爰叠白■基园
Ｔａｂｌｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｍｍｓ ａｎｄ
酸蛋白酶
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枯草杆菌类似筵氨
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深绿木霉
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枯草杆菌类似缝氨
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３７
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Ｎ．Ｒ．
ＡＡＡ３４２１Ｉ
瑞氏木霉
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３７
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绿色木霉
Ｔ．“础
胰蛋ｎ酶类似丝氨
ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ
ｗａｌｌ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｓｐｐ．ｉｓ ｒｏｏｔ・ｋｎｏｔ
ａｎｄ
ｎｅｍａｔｏｄｅ
ｃｕｔｉｃｌｅｓ，ｅｔｃ．Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｐｍｔｅａｓｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ
ｏｎ
Ｔｒ／ｃｈｏｄｅｒｍａ
ｄｉｓ—
ｎｅ—
ｃｕｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ，ｗｉｔｈ ｅｍｐｈａｓｉｓ
ｒｅ￥ｏｕｌ℃ｅＳ
Ａ鲥ｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊｉｎａｎ ２５０１００，Ｃｈｉｎａ）
ｉｎ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｌａｙ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｂｉｏｌｏ西ｃａｌ
ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ ｒｏｏｔ—ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ．Ｍｏｓｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｔｒ／ｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．ｐｏｓｓｅｓｓ
１木霉胞外蛋白酶的种类及组成
蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，生物体许多生理活动和疾病发生都与蛋白酶相关。蛋 白酶有多种分类方式，根据最适作用ｐＨ值的不同，蛋白酶分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱 性蛋白酶；根据活性中心的不同，蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶 和半胱氨酸蛋白酶；而根据酶切位置的不同，蛋白酶又分为外肽酶和内肽酶。 木霉是重要的微生物蛋白酶来源，许多研究证明木霉具有复杂的胞外蛋白水解酶类系统， 并且培养条件的不同可影响胞外蛋白酶的种类及组成。Ｄｅｌｇａｄｏ．Ｊａｒａｎａ等Ｈ Ｊ采用等电聚焦的方 法在哈茨木霉（Ｔ．ｈａｒｚｉａｎｕｍ）发酵液中检测到几种酸性、中性以及碱性蛋白酶的存在；同时发 现酸性蛋白酶的合成受发酵液ｐＨ值调控，酵母膏、蛋白胨以及干酪素可诱导其产生；而碱性 和中性蛋白酶仅被乳糖和几丁质诱导或是在碳饥饿的情况下产生。Ａｎｔａｌ等【５ Ｊ比较深绿木霉 （Ｔ．ａｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ）、哈茨木霉和绿色木霉（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ）的胞外蛋白酶酶谱，发现这３种木霉都可以 分泌胰蛋白酶类似蛋白酶和胰凝乳蛋白酶类似蛋白酶。经热失活的枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）细胞壁诱导，哈茨木霉可分泌３个胰蛋白酶类似蛋白酶（分子量分别为５ｋＤ、１３ｋＤ和 １９ｋＤ）和６个胰凝乳蛋白酶类似蛋白酶（分子量在１２—４３ｋＤ之间）【６ Ｊ。而同样的诱导条件下， 绿色木霉的发酵上清液中也至少检测到６种蛋白酶∽Ｊ。环境因子对木霉胞外蛋白酶的影响近 年来也有报道。适冷木霉可在１０。Ｃ分泌具有类似胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性的多种蛋白 酶，并且这些蛋白酶具有很好的适冷性，在５℃的低温条件下仍能保持良好的活力；除此之外， 这些适冷蛋白酶可以在低水活度（ｎ。＝０．９５—０．８６）及碱性条件（ｐＨ８．０—９．Ｏ）下保持活力【８ｊ。 Ｋｒｅｄｉｃｓ等旧Ｊ还研究了不同金属离子对木霉产蛋白酶的影响，研究发现汞强烈抑制木霉蛋白酶 的活力，铝、铜和铅对蛋白酶的活力有一定的抑制作用，而镍、钴、镉、锌、锰和铁没有明显的抑 制效果。综上研究表明，木霉可以产生不同类型的蛋白酶，具有复杂的胞外蛋白水解系统，而 且木霉蛋白酶可以在不利于菌丝生长的条件下长期保持活力。
３６０
万方数据
第３期
陈蕾蕾等：木霉胞外蛋白酶的研究进展
筛层析和离子交换色谱将其纯化。另有报道１种ｐＨ值依赖的天冬氨酸蛋白酶从绿色木霉中 被分离到［１ ３｜。 在过去几年，随着人们对木霉蛋白水解系统遗传背景研究的关注，部分木霉蛋白酶基因陆 续被克隆出来（表）。基因ｐｒｂｌ是最早被克隆到的木霉蛋白酶基因，编码丝氨酸蛋白酶ＰＲＢＩ， 对其启动子分析结果显示ｐｒ６１含有与氮、碳调节分别相关联的Ａｒｅａ和ＣｒｅＡ位点，以及４个重 寄生应答元素位点（ｍｙｅｏｐａｒａｓｉｔｉｃ
４５
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［２４】
Ｎｏｔｅ：Ｎ．Ｒ．。ｎｏｔ ｒｅｐｏｒｔｅｄ．
３蛋白酶在木霉抗真菌活性中的作用
病虫害是引起农作物减产的主要因素，由病原真菌引起的植物病害约占总植物病害的
３６ｌ
万方数据
中国牛物防治
第２６卷
９０％以上ⅢＪ。如多种作物的黄萎病、枯萎病、根腐病等土传病害，保护地栽培导致的霜霉和灰 霉等多种叶部病害，发病面积逐年扩大，造成的损失逐年增加…。木霉属菌株可用来防治多种 植物真萧病害，美困、以色列、意大利、西班牙、新西兰等国家都已有产品上市。同时，木霉对植 物真菌病害的牛物防治是目前植物生防领域的研究热点之一。 木霉的胞外蛋白酶是一类重要的细胞肇降解酶，是水解真菌细胞壁所必需的，在木霉抗真 菌活性中发挥重要作用，是研究木霉乍防作用的关键。早于１９６９年，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ．Ｋａｂａｎａ［２６ｊ就提 出蛋白酶在木霉拮抗作用中担任着重要角色；通过混合培养Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ和病原菌Ｓｄｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆ－ ｓ豇，发现哈茨木霉胞外酶蛋白水解能力的增强与Ｓ．ｒｏｌｆｓｉｉ胞外酶活力的Ｆ降相关。随后，Ｅｌａｄ 等坦Ｊ研究发现哈茨木霉胞外蛋白酶町以失活灰霉菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｒｌ，ｅｒｅｃｔ）分泌的水解酶类，而且含 有蛋白酶的哈茨木霉发酵上清液可以体外抑制灰霉菌的孢予萌发和菌丝生长，这一发现直接 证明了蛋白酶的乍防活性。木霉可以通过自身分泌的蛋白酶，失活钝化植物病原菌的胞外酶 从而影响其正常生长代谢。此外，木霉蛋白酶还参与木霉与病原菌的营养竞争机制，主要表现 在对蛋白类底物的强降解能力。同时，蛋白酶在木霉的莺寄生过程中通过降解细胞壁中的蛋 白成分从而协同几ｒ质酶和葡聚糖酶完成对植物病原菌细胞壁的完全降解。Ｓｉｖａｎ等［２７】报道 用哈茨木霉蛋白酶处理后的Ｆｕｓａｒｉｕｍ致病能力降低，而且其细胞壁更容易被哈茨木霉的几丁 质酶和葡聚糖酶降解。 尽管木霉蛋白酶的生防作用早已被证实，但迄今为止，仅有３种与生防作用相关的木霉蛋 白酶被分离并克隆到其基因。Ｇｅｒｅｍｉａ等¨ｏ】从哈茨木霉ＩＭｌ２０６０４０中分离到一种碱性蛋白酶 Ｐｒｂｌ；纯化后发现该酶是丝氨酸蛋白酶，分子量３１ ｋＤ，等电点９．２。编码蛋白酶Ｐｒｂｌ的基因已 被克隆，过量表达．Ｄｒ６１可提高木霉的生防效果［１０，１４ｌ。哈茨木霉ＣＥＣＴ２４１３产生的Ｔｒｙｐｓｉｎ．Ｉｌｋｅ 蛋白酶ＰＲＡｌ除对真菌细胞壁具有很高的亲和力，还能高抑制线虫卵的孵化，并且与木霉产生 的其它拮抗蛋白具有协同作用Ｌ１１｜。最近的研究表明犬冬氨酸蛋白酶ＰａｐＡ在木霉的重寄生和 与植物的共生作用中也发挥着重要作用【１９，２１ Ｊ。