环境工程微生物学实验顾彦1
《环境工程实验Ⅰ》(环境工程微生物)教学大纲
《环境工程实验Ⅰ》（环境工程微生物）教学大纲一、基本信息1二、教学目标及任务环境工程微生物学实验是一门操作技能较强的课程。
通过一系列的实验操作，强化学生无菌操作的理念，使学生掌握微生物实验的基本方法。
通过观察不同的实验材料，进行各项实验操作、分析实验结果、完成实验作业等环节，配合课堂教学，以验证和巩固课堂讲授的微生物学的理论知识。
本课程支撑环境工程专业毕业要求1、2、4和6。
三、学时分配教学课时分配四、实验内容及教学要求实验一:光学显微镜的使用及细菌形态的观察实验目的：学会光学显微镜的使用方法，观察细菌的形态。
本实验教学要求：了解光学显微镜的构造，理解光学显微镜成像原理，掌握显微镜的操作和保养方法。
观察细菌的个体形态，学会生物图的绘制。
本实验重点、难点：显微镜的操作和保养方法，油镜观察细菌的形态，生物图的绘制。
实验二:细菌的简单染色和革兰氏染色实验目的：学会细菌染色的操作技术。
本实验教学要求：了解细菌的图片及染色在微生物实验中的重要性，理解革兰氏染色的原理，掌握细菌染色的操作技术。
本实验重点、难点：掌握微生物的一般染色和革兰氏染色方法。
实验三:真菌的形态观察实验目的：学会用显微镜观察真菌的个体形态本实验教学要求：进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法，掌握制作水浸片的方法，观察真菌（酵母、霉菌）的个体形态。
本实验重点、难点：学习制作水浸片的方法，观察真菌的个体形态实验四:微生物细胞的计数和测量实验目的：学会用血球计数板对微生物计数本实验教学要求：了解血球计数板的结构，理解血球计数板计数计微生物的原理和掌握计数方法。
学习测微技术，测量细胞（酵母菌）的大小。
本实验重点、难点：测微技术原理，测量细胞（酵母菌）的大小实验五:培养基的配制，器皿的包扎，灭菌方法实验目的：学习培养基的配制及灭菌方法本实验教学要求：了解配制培养基的过程，理解配制培养基的原理，掌握配制方法。
学会各种各种器皿的包扎，灭菌技术。
本实验重点、难点：培养基配制的原理及方法。
环境工程微生物学操作实验报告 范例
培养基的配制和灭菌细菌的纯种分离、培养接种技术及菌落形态的观察姓名：***学号：************ 课程名称：环境工程微生物实验一、实验目的1、熟悉玻璃器皿的洗涤与灭菌前的准备工作。
2、了解微生物培养基的基本原理，掌握配制、分装培养基的方法。
3、学习各类物品的包装、配制、灭菌技术。
4、从环境中分离、培养微生物，掌握一些常用微生物和纯化微生物的方法。
5、学会几种接种技术。
6、平板菌落计数。
7、抗Cu菌的筛选。
8、观察实验分离出来的几种细菌的个体形态及与其相应的菌落的形态特征。
9、通过观察和比较细菌，放线菌，酵母菌及霉菌的菌落形态，达到初步鉴别微生物的能力。
二、实验原理1、培养基原理：培养基是微生物生长的基质，是按照微生物营养、生长繁殖的需要，有碳、氢‘氧、氮、磷、硫、钾、钙、钠、镁、铁、等微量元素和水，按一定的体积分数配制而成。
调整适合的pH，经高温灭菌后以备培养微生物之用。
由于微生物的种类及代谢类型的多样性，因而培养基放入种类也多，他们的配方及配制法也有所差异，但一般的配置过程大致相同。
本实验采用肉汤蛋白胨培养基、查氏培养基（筛选霉菌）、高氏1号淀粉琼脂培养基（筛选放线菌）。
2、灭菌原理:本次实验中培养基、移液枪头等采取加压蒸汽灭菌法。
加压蒸汽灭菌器是能耐一定压力的密闭金属锅，加压灭菌的原理在于提高灭菌器内的蒸汽温度来达到灭菌的目的。
培养皿等玻璃器皿用具采用干热灭菌法，另外还有膜过滤灭菌法。
接种时对接种针等采用灼烧灭菌。
3、分离纯化原理：本实验使用的平板表面涂布法，是把聚集在一起的群体分散成能在培养基上长成单个菌落的分离方法。
此法加样量不宜太多，只能在0.5mL以下，培养时起初不能倒置，现正置一段时间等水分蒸发后倒置。
平板划线法也可以分离从而获得单一菌落以观察其形态特征。
4、微生物的接种原理：接种就是将一定量的微生物在无菌操作条件下转移到另一无菌的并适合该菌生长繁殖所需的培养基中的过程。
本次实验采取斜面接种法、穿刺接种法，使用到的接种工具是接种环，接种针。
环境工程微生物学实验指导书
实验报告要包括以下内容： 1．实验名称、学生姓名、学号、班号和实验日期； 2．实验目的和要求； 3．实验仪器、设备与材料； 4．实验原理；
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武汉科技大学实验指导书
5．实验步骤； 6．实验原始记录； 7．实验数据计算结果； 8．实验结果分析，讨论实验指导书中提出的思考题，写出心得与体会。
二、实验内容
掌握细菌的革兰氏染色方法；掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养，以观 察菌种的个体，学会生物图的绘制。
三、实验仪器、设备及材料
显微镜、载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、石碳酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、革氏 碘液、95%乙醇、蕃红染液、接种钩、酒精灯、已培养好的菌株。
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实验三 微生物的接种技术
一、实验目的
掌握从环境中分离培养微生物和对微生物进行扩大培养的方法，从而获得若干种微生物的纯培养 技能。
二、实验内容
以微生物的斜面接种技术为例，掌握微生物的各种接种技术中需要注意的问题。
三、实验仪器、设备及材料
无菌斜面培养基、已培养好的待接种微生物、酒精灯、接种钩、无菌操作台。
七、实验注意事项
必须严格掌握乙醇脱色程度，如果脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够时，阴性菌被误 染为阳性菌。
八、思考题
1、光学显微镜的操作方法？ 2、微生物的染色原理是什么？ 3、绘制细菌的形态图，并说明革兰氏染色的结果。 4、通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？
主要参考文献： 周群英 高廷耀编著，环境工程微生物学（第二版）中第三部分“环境工程微生物实验”，高等教育出版 社，北京，2000
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环境工程微生物学试验试验课程教学大纲1课程概况课程代码
《环境工程微生物学实验》实验课程教学大纲1.课程概况2．实验课程内容3.实验的主要仪器设备(可根据需要自行添加行)4.实验指导书具体要求（环境工程微生物学实验课程共设9个实验，包括显微镜的使用及放线菌、真菌、藻类等微生物形态的观察，活性污泥中原生及微型后生动物的观察和数量的测定，大肠杆菌生长曲线的测定，细菌淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定、空气中微生物的检测、水中细菌菌落总数（CFU）的测定、水源水中粪便污染指示菌的检测—多管发酵法、环境中特殊微生物的分离、筛选及鉴定。
自编的实验指导书必须包括这9项实验内容，每个实验内容包含实验目的及原理，实验材料，实验内容或步骤，结果分析或实验作业等四部分组成。
具体要求如下：（1）实验目的及原理，注意强调“通过本实验的学习，使学生了解或掌握什么知识，训练或培养什么技能，为今后继续哪方面的学习奠定基础”。
实验原理、方法和手段，对于设计性实验，应根据“由学生自行设计实验方案并加以实现的实验”内涵要求，注意省略由学生自主设计的“实验方案”。
（2）实验材料，包括仪器设备条件、物质条件、相关文献资料等。
（3）实验内容或步骤，对于综合性实验，注意直接或间接指明本实验涉及了哪几个具体的知识点。
对于设计性实验，应根据“由学生自行设计实验方案并加以实现的实验”内涵要求，注意省略与学生自行设计的实验方案相关联的实验步骤。
（4）结果分析或实验作业，根据各实验内容要求学生记录实验结果并分析，完成各实验内容相关的思考题。
必要时对上述相关内容进行补充，或告知学生实验室管理的相关规定及安全事项等内容。
5.实验报告内容及要求实验报告中，每项实验报告内容包括实验目的及原理、实验材料、实验步骤、指导书中实验作业。
写实验报告时：（1）按照实验指导书的格式简述实验目的及原理、基本要求。
（2）简洁表述实验中所用的实验材料和实验方法，如何操作，在实验中遇到的问题以及如何解决。
（3）按照实验要求操作，记录实验结果，并进行分析。
环境工程微生物学实验
（1）试管编号；
（2）2只试管分别穿刺接种大肠杆菌和变形杆菌； （3）37 ℃ ，培养24h 3、柠檬酸盐利用试验
（1）试管编号；
（2）2只试管分别划线接种大肠杆菌和枯草杆菌； （3）37 ℃ ，培养24h
四、实验结果观察与记录
1、将实验结果填入下表，＋表示阳性，－表示阴性。 2、思考题：微生物生理生化反应的意义何在？
三操作步骤1微生物大小的测量1枯草杆菌标本片的制作2目镜测微尺的标定放置镜台测微尺放置目镜测微尺校正目镜测微尺计算不同放大倍数下目镜测微尺每格代表的长度3枯草杆菌大小的测量四实验报告1将目镜测微尺校正结果填入下表接物镜接物镜倍数目镜测微尺目镜测微尺每格代表的长度2在高倍镜下测量枯草杆菌大小的实验结果填入下表菌体编号长度的目镜测微尺格数宽度的目镜测微尺格数平均值菌体大小平均值m3分析实验结果一实验目的明确显微镜计数的原理
酵母菌的形态构造
线 粒 体 芽体液泡 芽 体 核 液 泡 膜 细 胞 壁 细 胞 膜
根霉（Rhizopus)
青霉（Penicillum):
曲霉(Aspergillus)
四、实验报告
1. 分析实验结果，绘制酵母菌、青霉、黑曲霉的形
态图，并注明各部位名称，。 2. 怎样才能观察到较为完整的霉菌形态，各种霉菌 制片过程中分别有哪些注意事项？
121℃,灭菌20~30min
使用时, 将培养基加热融化, 待温度降至50 ℃左右时在 100mL培养基中加入1%链霉素0.3mL
糖发酵培养基：
蛋白胨2g，葡萄糖10g， K2HPO4 0.2g, NaCl 5g, 琼脂5～6g， pH7.0～7.2 ，蒸馏水1L ， 1%溴百里酚蓝 3ml. 分装试管，每管4～5cm， 112℃,灭菌30min.
《环境工程微生物》实验指导书
《环境工程微生物》实验指导书《环境工程微生物》实验指导书一、实验目的本实验指导书旨在让学生了解和掌握环境工程微生物实验的基本原理、实验方法、实验步骤和实验技巧，培养学生对环境工程微生物的观察、分析和解决问题的能力，提高学生的实践能力和综合素质。
二、实验原理环境工程微生物实验是环境工程学科中重要的实验课程之一，主要涉及微生物的生长、代谢、分离、鉴定等实验技术。
本实验指导书将涵盖以下内容：1.微生物的生长和繁殖：通过观察微生物的生长过程，掌握微生物的生长条件和繁殖规律。
2.微生物的分离与纯化：学习使用各种方法从环境中分离微生物，并进行纯化培养。
3.微生物的鉴定：学习使用形态学、生理学等方法对微生物进行鉴定。
4.微生物的代谢：通过测定微生物的代谢产物，了解微生物的代谢过程和代谢途径。
5.微生物的生长曲线：通过绘制生长曲线，掌握微生物的生长规律和生长动力学。
三、实验步骤与操作方法1.实验准备：进行实验前，需要准备好各种实验器材、试剂和培养基等。
2.样品采集：选择具有代表性的环境样品，如水样、土壤样、垃圾样等，进行采集。
3.样品处理：将采集的样品进行处理，以备后续实验使用。
4.微生物分离：采用适当的分离方法，将微生物从样品中分离出来。
5.微生物培养：将分离得到的微生物进行培养，观察其生长情况。
6.微生物鉴定：根据微生物的形态学和生理学特征，对分离得到的微生物进行鉴定。
7.数据分析：整理实验数据，进行统计分析，得出实验结论。
8.实验总结：对实验结果进行总结，分析实验中存在的问题和不足之处，提出改进措施。
四、注意事项1.实验过程中要保持实验室的清洁卫生，避免污染和交叉感染。
2.使用试剂和培养基时要严格按照规定进行配制和使用，确保实验结果的准确性和可靠性。
3.在进行实验操作时要注意安全问题，避免发生意外事故。
例如，在处理危险性化学品时要佩戴个人防护用品；在使用高压灭菌锅时要遵守操作规程，避免发生爆炸等事故。
4.实验结束后要及时清理实验场地和器材，保证实验室的整洁和卫生。
环境工程微生物学实验
实验注意事项
一、实验须知
教学实验是教学实践的重要组成部分，是不断提高学 生动手能力及操作技能的主要教学形式。环境工程微生物 学实验是一门操作技能较强的课程，通过实验，掌握微生 物学实验的一套基本技术，树立严谨、求实的科学态度， 提高观察、分析问题和解决问题的能力。为了更好地进行 实验，保证实验教学质量和实验室的安全，必须注意以下 事项：
5. 实验报告
实验结束后，整理现场记录的有关内容，对实验结 果作实事求是地总结、综合，完成实验报告。
二、实验规则
规范实验，遵守学生实验守则及实验室安全工作各项 规定，确保实验正常进行。
1. 预习
做到认真阅读有关的实验教材，பைடு நூலகம்实验的主要内容、 目的和方法等有所了解，并初步熟悉实验的主要环节，做 好各项准备工作。
2.记录
实验课开始，教师对实验内容的安排及注意问题进 行讲解，学生必须认真听讲并作必要的记录，实验中更 要及时、准确地做好现场记录，作为完成实验报告的重 要依据。
3.示教
实验中有示教内容，尤其是形态学实验，可帮助学 生了解实验的难点，加深印象，以便能在有限的时间内 获得更多感性知识的机会。
4.操作与观察
实验应按要求独立操作与观察，包括显微镜的使用 技术、微生物的染色和纯培养等技术，都必须做到规范 操作。还有微生物学实验中最重要的环节之一就是无菌 操作，必须严格要求，反复练习，以达到一定的熟练程 度。实验中要认真注意观察实验现象和实验结果，结合 微生物学理论知识，去比较、分析、说明问题。
环境工程微生物学实验
第十三章 环境工程微生物学实验
目录
实验一、光学显微镜的使用及原核生物的个体形态观察 实验二、真核微生物的个体形态观察 实验三、细菌的简单染色和革兰氏染色 实验四、细菌淀粉酶的测定 实验五、培养基的配制与灭菌 实验六、活性污泥中细菌的纯种分离和培养 实验七、纯培养菌体和菌落形态的观察 实验八、总大肠菌群数的测定 实验九、综合性实验：校园河水中的生物检测与水体水 质评述 实验十、应用API 20E细菌鉴定系统鉴定肠杆菌科和其他 革兰氏 阴性杆菌
环境工程微生物学实验答案
1.使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察油镜指的是为了减少高倍镜的折光，在物镜和玻片之间滴上松节油等。
所以油镜其实就是给高倍镜物镜和玻片之间加油。
而所有高倍镜从前都先要用低倍镜观察，是因为低倍镜下好找目标。
低倍镜放大10 倍，高倍镜放大40 倍，油镜放大100 倍，先用低倍镜、高倍镜，既便于找到目标，又方便调焦距。
要使显微镜视野光明，除采用光源外，还可以够采用哪些措施加大聚光器光圈，同样设置下低倍物镜比高倍物镜视野亮把资料切薄一点透光较好使用滤光片，增加反差和清楚度。
向上调理聚光器。
2.怎样差异活性污泥中的几种固着型纤毛虫大多数情况下，会遇到钟虫、柄纤毛虫、累枝虫等。
三种虫形态均近似钟的形状，钟虫每个都是独立的，互相之间没有连接；柄纤毛虫近似钟虫，量很大，可是在根部汇聚在一根柄上，能够理解成一根柄上分出很多个钟虫；而累枝虫就像是树，一根柄上分出很多个柄，尔后很多个柄上又分出很多个“钟虫”。
用压滴法制作标本片晌注意什么问题1. 使用的载玻片和盖玻片都要干净；2. 制成的标本片不能够有气泡4. 涂片为什么要固定，固准时应注意什么问题若是不固定的话你进行染色后水洗去节余染料的同时会将菌体一并冲走注意的就是不要弄死细胞咯！不知道你用什么方法，若是是用火，那就是不要烧死它们，用载玻片背面凑近火源，过两次就好。
Over一般我都是用酒精灯的外焰烤的但是要注意温度。
温度过高挥出现变形细胞。
温度已载玻片接触手背，手背不感觉烫为宜。
加热只水分蒸发完好后，再在酒精灯外焰上经过两到三次，就成了。
革兰氏染色法中若只做1~4 步，不用番红染液复染，能否分辨出革兰氏染色结果为什么能。
在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。
最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。
革兰氏染色原理和番红复染自己并没关系。
但是，但是，你能指着一片空白的照片说这些细菌没有被结晶紫染色所以是阴形吗鬼知道那处有没有细菌。
中国地质大学 环境工程微生物学试验
环境工程微生物实验中国地质大学（武汉）二○○九年三月目录环境工程微生物实验注意事项................................................................... 错误！未定义书签。
实验一光学显微镜的操作及细菌个体形态的观察 ............................... 错误！未定义书签。
一、目的............................................................................................... 错误！未定义书签。
二、显微镜的结构和光学原理及其操作方法 ................................... 错误！未定义书签。
三、显微镜的保护注意事项............................................................... 错误！未定义书签。
四、细菌的个体形态观察................................................................... 错误！未定义书签。
实验二微生物的染色.. (4)一、目的 (4)二、染色原理 (4)三、染色方法分类 (4)1．简单染色法 (4)2．复染色法 (5)3．芽孢染色法............................................................................. 错误！未定义书签。
4．荚膜染色法............................................................................. 错误！未定义书签。
5．鞭毛染色法............................................................................. 错误！未定义书签。
环境工程微生物实验大纲
《环境工程微生物》实验教学大纲大纲制定（修订）时间： 2017年 7月课程名称：环境工程微生物课程编码：080231050课程类别：专业基础课课程性质：必修适用专业：环境工程课程总学时：56实验（上机）计划学时： 16开课单位：环境与化学工程学院一、大纲编写依据1.环境工程专业2017-2020版教学计划；2.环境工程专业《环境工程微生物》理论教学大纲对实验环节的要求；3.近年来《环境工程微生物》实验教学经验。
二、实验课程地位及相关课程的联系1.《环境工程微生物》是环境工程专业重要的专业基础课程；2.本实验项目是《环境工程微生物》课程基础知识的运用；3.本实验项目是理解环境污染微生物修复的基础；4.本实验以《普通化学》、《物理化学》等为先修课。
5.本实验为后续的《环境工程综合实验周》和毕业设计等有指导意义。
三、本课程实验目的和任务1.掌握常见的微生物形态，包括细菌、真菌等；掌握革兰氏染色方法；掌握培养基的配制及灭菌；掌握微生物细胞数的计数；掌握科学的实验方法；2.培养学生观察问题、分析问题和独立解决问题的能力；培养学生基本的微生物实验的操作技能；3.通过本课程学生能掌握基本微生物镜检技术，微生物染色技术，微生物的培养技术，微生物计数方法，微生物接种技术以及物品和器具的灭菌和消毒技术等。
4.通过实验使学生能够正确使用光学显微镜的油镜、高压蒸汽灭菌锅等设备；5.培养正确记录实验数据和现象，正确处理实验数据和分析实验结果的能力以及正确书写实验报告的能力。
四、实验基本要求1.实验项目的选定依据教学计划对学生工程实践能力培养的要求；2.巩固和加深学生对微生物学基础知识的理解，提高学生综合运用所学知识的能力；3.通过实验，要求学生做到：（1）能够预习实验，能够独立操作实验并撰写实验报告；（2）要求学生掌握显微镜的结构和操作原理；掌握显微镜的操作技术；掌握油镜的使用；掌握微生物观察技术；要求学生绘制观察的结果。
环境工程微生物学综合实验-
环境工程微生物学综合实验- 功能菌（絮凝菌）的分离、筛选与性能研究实验须知*一、环境工程微生物学实验目的1. 通过实验进一步加深理解课堂讲授的理论内容。
2. 训练学生掌握微生物学最基本的操作技能，建立无菌概念并掌握无菌操作技术。
通过实验，培养学生分析问题、解决问题的能力及创新能力，提高学生的综合素质，为将来能够独立工作打下坚实的基础。
二、环境工程微生物学实验基本要求1. 每次实验前必须对实验内容进行充分预习，弄清实验目的、原理及操作步骤，以免手忙脚乱，影响实验课效果。
2. 实验前，按内容要求仔细检查所需仪器、药品是否齐全，若有问题及时提出。
3. 整个实验过程要严格按操作步骤进行，不得马马糊糊，否则会造成错误，甚至出现事故。
4. 实验过程中要做好记录，特别是对于连续观察的实验，必须认真记下每次观察到的现象与结果，然后进行整理分析，写出实验报告。
5. 使用贵重精密仪器时要特别小心，注意保护，用毕要复原，并进行登记。
实验使用的一切物品实验完毕均放回原处。
损坏仪器照价赔偿。
6. 实验室要保持整洁、干净，不准大声喧哗，勿随意走动，严禁吸烟，不许吃东西，不准随便乱丢废物。
7. 实验过程中，一些易燃品如乙醇、丙酮等切勿接近火焰。
如遇火险，要先切断火源，再用沙土或湿布灭火，必要时应使用灭火器。
8. 使用过的废液及琼脂培养基不得直接倒入水池内，应先进行灭菌处理，然后再将废液倒入下水道，将琼脂培养基埋掉。
9. 离开实验室前要将桌面擦净，清扫卫生，检查电源、火源、自来水、门窗是否关闭，以确保安全。
实验一、絮凝菌分离、筛选准备实验（器皿的包装、无菌水、培养基的制备与灭菌）一、器皿的包装（一）实验目的学会微生物技术实验中所用器皿的包装方法及意义。
（二）包装方法1.培养皿的包装用牛皮纸或旧报纸进行包装。
包好后灭菌备用。
2. 吸管的包装在已干燥的吸管的平头端距0.5cm处，塞长约1.5cm的棉花，松紧要合适。
过松，棉花易脱出；过紧，吹吸费力，甚至吹吸不动。
环境工程微生物实验安排
实验一环境工程微生物综合实验：水中细菌总数和大肠菌群的测定一实验目的1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2、了解水源水的平板菌落计数的原则。
3、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。
二、实验原理水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
我国规定1ml自来水中细菌总数不得超过100个。
大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，其在37℃培养24~28h能发酵乳糖产酸产气。
它们普遍存在于肠道中，且具有数量多，与多数肠道病原菌存活期相近，易于培养和观察等特点。
大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。
大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法两种。
本实验采用多管发酵法，它被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查出大肠菌群的近似值。
我国规定：每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。
三、实验材料和用具：1、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，乳糖蛋白胨培养基，三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基，伊红美兰培养基（EMB培养基）。
2、试剂：无菌水、结晶紫染液、卢氏碘液、95%乙醇、番红染色液。
3、器皿：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，德汉氏小管，载玻片，无菌空瓶，移液管，接种环，酒精灯，注射器，玻璃涂布器、显微镜等。
四、实验步骤第一次实验——水中细菌总数和大肠菌群的测定（初发酵试验）【实验试剂：（乳糖蛋白胨培养基）1、牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、琼脂、乳糖；2、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液、1N NaOH溶液和1N HCl溶液试验器皿：2个200 ml三角瓶/组、10支能装20ml溶液的试管/组、12支德汉氏小管/组、1支移液管（10ml）/组、1支移液管（1ml）/组、3个培养皿/组、1个涂布器/组】1、制备无菌水：取4支试管，向每支试管中加入9ml自来水。
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1
② 右手拿接种环，在火焰上先将环端烧 红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部 位也过火灭菌。
③ 将两支试管的上端并齐，靠近火焰， 用右手小指、无名指和手掌将两支试管的 棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然 后让试管口缓缓过火焰。 2
血球计数板的构造
血球计数板的计算方法
血球计数板上刻有一长宽各为1毫米的方形大格，其 体积为0.1mm3。计数板有两种刻度，一种是每大格分为16 个中格，而每中格又分25个小格，每大格为16×25小格 =400小格，而另一种，则是每大格分为25个中格，而每中 格又分为16个小格，则每大格为25×16=400小格（计数板 上的标识为XB· K25） 计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对 角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格（即100个 小格）的酵母菌数。如果使用25 格× 16格规格的计数室 除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80 个 小 方 格 ) 的 酵 母 菌 数 。 (6)当遇到位于大格线上的酵母菌，一般只计数大方格的 上方和左方线上的酵母细胞(或只计数下方和右方线上的 酵母细胞)。
湿热灭菌：高压蒸气灭菌法
高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 注意：器物不能装得太满。 3. 接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待 温度计指示温度为100℃时关闭排气阀；或当排 出的蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。
10mL试样
90mL蒸馏水
稀释液的制备
3. 平板的制作
① 取10套无菌培养皿编号， 10－4、10－5、10－6各3个，另一个 为空气对照。 ② 取1支1mL无菌移液管从浓度小的菌液开始，以10－6、10－5、 10－4为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内(每次吸取 前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。
实验步骤
一、玻璃器皿的洗涤和包装
清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。
棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。
2-1棉塞制作方法
2-2移液管灭菌前的包装
二、培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基的配制 （一）培养基配方： 牛肉膏2.5g 蛋白胨5.0g、 NaCl2.5g、琼脂10.0g、自来水500mL、pH7.2~7.4。 （二）操作步骤： 1. 取一个1000mL烧杯，装500mL蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶 解。 注意：a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成 分 b. 蛋白胨、肉膏可加热促进溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并 适当补充因蒸发而损失的水量。
（三）稀释平板涂布法
1.稀释样品：方法同稀释平板分离法 2.倒平板：将融化并冷至50℃左右的培养基倒入无菌培养皿中， 冷凝后即成平板 3.用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板 上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀 4.将培养皿正摆在恒温箱中，调节一定温度进行培养。如果培 养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。
7. 灭菌备用：灭菌条件：1210C（相当蒸汽压力0.103MPa）培 养基灭菌后必须在37℃下恒温培养24h，确定无菌生长，方可 使用。
图
例
图2－3培养基分装
图2－4 斜面制作
三、稀释水的制备
1.取一个250mL的锥形瓶装90(或99)mL蒸 馏水，放30颗玻璃珠(用于打破活性污泥、 菌块或土壤颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包 扎，待灭菌。
操作步骤
1. 镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物， 则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能 进行计数。 2. 加样品 在血球计数板上盖上盖玻片, 用滴管 将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会 自动进入计数室，静置5分钟。 3. 计数 将血球计数板置于载物台上，先用低倍 镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。 25个中格的 取计数板四角和中间位置的五个中方格计菌数。重复 计2-3次，取其平均值，按公式计算每毫升酵母菌液中 菌体的个数。 4.清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲 洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必 须重复洗涤干净为止。
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④ 将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却， 而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并迅速伸 入待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线。抽 出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再 次烧红接种环，则接种完毕。
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（二）液体接种和穿刺接种
1.液体接种法(从斜面菌种接入培养液)：用接种环挑取斜面菌 种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将 环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试 管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环 烧红灭菌。 2.穿刺接种法(从斜面菌种接入(半)固体培养基)：用接种针经火 焰灭菌后，挑取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心 至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针 灭菌，则接种完毕。
③ 加热培养基，当其冷至45℃左 右时，右手拿装有培养基的锥形 瓶，左手拿培养皿，以中指、无 名指和小指托住皿底，拇指和食 指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖 掀开，倒入培养基后将培养皿平 放在桌上，顺时针和逆时针来回 转动培养皿，使培养基和菌液充 分混匀，冷凝后即成平板，倒置 于30℃培养24～48h，然后观察 结果。
2.另取5支18mm×180mm的试管，分别装 9mL蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。 无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的 材料。
四、灭菌
加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调 节至160℃并维持2h； b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度 降到50℃左右，才能将物品取出。
3. 调pH值：用10％ NaOH调pH至7.2~7.4，用精密pH试纸对 照。
4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁 热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可 省略。
5. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部倒入250mL锥形 瓶中，分别塞上棉塞。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口 或瓶口上面造成污染(见图2－3)。分装量：固体培养基约为试 管高度的1／5，灭菌后制成斜面（图2－4）。分装入锥形瓶内 以不超过其容积的3/5为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为 宜．灭菌后垂直待凝。注意不要污染棉塞和瓶口。 6. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。
过滤除菌法：
不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清），一般可用 细菌过滤器进行除菌。
用于除菌的滤器：a.蔡氏滤器，b.注射器装置滤器
思考题
1.配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意 些什么问题?为什么? 2.培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不 能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培 养基进行无菌检查？ 3.高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么 在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸 汽才能打开锅盖?
环境工程微生物学实验
实验一 微生物细胞的计数
目的要求
1.了解血球计数板的结构及计数 原理。 2、掌握使用血球计数板进行微 生物计数的方法。
实验原理
测定微生物数量方法很多，通常采用的有显 微镜直接计数法、平板计数法和光电比浊计数法。
显微镜直接计数法
将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具 有确定面积和容积的载玻片上，又称血球计数板， 于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的 方法。
其它：接种环、酒精灯、恒温箱。
实 验 步骤
一、细菌的纯种分离
(一)稀释平板法
1. 取样 用无菌锥形瓶到现场取一定量的湖水，迅速带回实验室。 2. 稀释水样 将1瓶90mL和5管9mL无菌水排列好，用记号笔依次编上 10－1、 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。在无菌操作 条件下，用10mL的无菌移液管吸取10mL水样(或其它样 品)加入编号为10－1无菌水(内含玻璃珠)中，将移液管吹洗 三次，用手摇10min将颗粒状样品打散。即为10－1浓度的 菌液。用1mL无菌移液管吸取1mL 10－1浓度的菌液于编 号为10－2无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10－2 浓度菌液。同样方法，依次稀释到10－6 。
结果记录
第一个 第二个பைடு நூலகம்第三个 第四个 第五个
中格
第一次 测定 第二次 测定 第三次 测定
中格
中格
中格
中格
平均
思考题
1.使用血球计数板应注意什么问题?
2.试分析影响本实验结果的误差来源并提出 改进措施
实验二 培养基的配制和灭菌
实验目的
1.熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 2.掌握培养基和无菌水的制备方法。 3.掌握高压蒸气灭菌技术。
间歇灭菌法：
即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培养基的灭 菌。 操作方法： a. 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1 次，每次在100℃煮沸30～60min，连续3d重复进 行。 b. 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在 37℃恒温条件下培养24h，这样可以使每次蒸煮后 未杀死残留的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时 杀灭。 c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要 放在 37℃恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。
平板划线分离的划线方法
左：连续划线法（1，2依次划线的起点）右：分区划线法（1，2，3，4依次划线的起点）
二、细菌的接种技术
接种方法：常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接种法、 试管深层固体培养基的穿刺接种法。 接种工具：常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接 种铲或接种锄、玻璃涂棒等。