HPLC法测定3种杂交翠菊花色苷的含量

HPLC 法测定3种杂交翠菊花色苷的含量陈亮1，3，李公斌2，辛秀兰3，袁其朋1，*（1．北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029；2.淄博职业学院，山东淄博255314；3.北京电子科技职业学院，北京100029）摘要：采用高效液相色谱法（HPLC ）对3种不同颜色的杂交翠菊花色苷含量进行测定。

使用1%盐酸甲醇溶液分别对3种不同颜色翠菊花色苷进行提取,以矢车菊-3-O-葡萄糖苷为对照品,使用Zorbax SB-C18柱（250mm ×4.6mm ，5μm ），以甲醇-5%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱,流速为1mL/min ，检测波长为520nm 。

结果表明，粉红色、紫红色、蓝紫色3种杂交翠菊花色苷含量分别为168.15、614.89、193.89mg/100g ，紫红色杂交翠菊具有较好的应用开发价值。

关键词：翠菊；花色苷；高效液相色谱法Determination of Anthocyanin Content in Hybrid Callistephus Chinensis by HPLCCHEN Liang 1,3,LI Gong-bin 2,XIN Xiu-lan 3,YUAN Qi-peng 1,*（1．College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing 100029,China;2.ZiboVocational College,Zibo 255314,Shandong,China;3.Beijing Vocational College of Electronic Science,Beijing 100029,Chin a ）Abstract ：To determine the content of anthocyanins in three hybrid callistephus chinensis with different colors.The sample was extracted with methanol of 1%HCl,the content of anthocyanins in three hybrid callistephus chinensis has been detected by HPLC using cyanidin-3-O-glucoside (cy-3-O-glu)as standard.The analysis was carried on Zorbax SB-C18column (250mm ×4.6mm ，5μm).The mobile phase was methanol-5%formic acid-water at the flow rate of 1mL/min,the detection wavelength was 520nm.Results and conclusion were that the anthocyanins contents in three callistephus chinensis with pink,purple and blue-violet colors were 168.15mg/100g,614.89mg/100g and 193.89mg/100g,respectively.It was valuable to exploit the hybrid callistephus chinensis with purple color.Key words ：hybrid callistephus chinensis;anthocyanin;HPLC基金项目：北京市属高等学校人才强教深化计划资助项目；山东省高等学校优秀青年教师国内访问学者项目；科研基地-生物技术在制药和农产品加工中的应用平台建设（PXM2010_014306_109857）作者简介：陈亮（1986—），男（汉），博士研究生，研究方向：天然产物分离。

*通信作者翠菊[Callistephus chinensi s （Linn．）Nees]属于菊科（Compositae ）翠菊属（Callistephus ）的单型种，一年生草本植物、浅根性、茎直立、多分枝、叶互生、头状花序、舌状花。

生长于山坡抛荒地、山坡草丛、水边或疏林荫处。

主产于我国吉林、辽宁、河北、山西、山东、云南及四川等省。

翠菊是重要的露地绿化用花卉，同时也是重要的盆栽观赏花卉[1]。

翠菊色彩丰富艳丽，有紫红、桃红、蓝紫等色,尤其是2000年刘振廷先生发现翠菊雄性不育株，并在世界上首先培育出翠菊的杂交品种，翠菊的颜色愈发的多样化，且易于人工控制，为翠菊市场的开拓与发展提供了有效的途径。

同时，花色的不同，其所含的天然水溶性色素花色苷成分的种类和含量亦有很大的不同，目前天然食用色素因其良好的安全性、天然着色效果以及抗氧化、抗衰老、抗突变等优良生理活性[2-3]，颇受人们青睐，而人工合成色素日益暴露出诸多弊病，因此，研究开发翠菊花色苷具有很重要的发展应用前景。

目前，测定花色苷的含量主要有pH 示差法、直接测定法和HPLC 法，pH 示差法是传统的、经典的、无需检测分析食品研究与开发F ood Research And Development2012年8月第33卷第8期129对照品的测定方法。

而直接测定法和HPLC法需要对照品，且对照品不易获得、较为昂贵，一度限制了方法的广泛应用，但是HPLC法可以获得更多的样品信息，除了可以测定总的花色苷含量，还可根据色谱峰的个数推断花色苷种类的数量以及相对含量，能够更为直观、快速、简便的了解样品，同时也为翠菊品种的质量控制（如：采收期、品种、储藏、加工等）提供了有效的借鉴[4-6]。

对3种不同颜色杂交翠菊花色苷的提取及测定进行了研究，为其开发利用提供科学参考。

1仪器与材料1.1主要仪器Agilent-1100高效液相色谱仪（DAD）：美国安捷伦公司；冷冻高速离心机：Sigma3K15；HZQ-Q振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司。

1.2主要材料新鲜盛花期杂交翠菊（Callistephus chinensis表观颜色：Ⅰ粉红色；Ⅱ紫红色；Ⅲ蓝紫色）：湖北富程生物技术有限公司提供；花色苷对照品（矢车菊-3-O-葡萄糖苷，纯度>98%）：成都曼思特生物科技有限公司。

2方法与结果2.1色谱条件的选择色谱柱：ZorbaxSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：溶剂A为甲醇；溶剂B为5%甲酸水溶液；梯度洗脱条件：0～10min，5%～24%甲醇（A）；10min～15min，24%；15min～30min，24%～35%；30min～35min，35%；35min～50min，35%～50%；流速：1.0mL/min；检测波长520nm；扫描波长：260nm～600nm；柱温30℃。

2.2标准品溶液的制备及线性关系考察精确称取矢车菊-3-O-葡萄糖苷对照品10mg 溶于10mL1%盐酸甲醇溶液，进样0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4μL，各重复进样3次，计算3次平均峰面积。

将峰面积Y与进样量X进行直线回归分析，对照品在0～6.4μg范围内有良好的线性关系，回归方程为：Y= 1561.1X-7.3，相关系数R2=0.9998，见图1。

2.3样品的制备称取3种不同颜色样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，捣碎，分别溶于1%（体积比）HCl甲醇溶液中，振荡器低速低温振荡提取2h，静置过夜，7000r/min高速离心10min，残渣再另加提取溶剂，振荡浸提离心洗涤至无色，合并3次上清液，分别定容至25mL，备用。

2.4精密度试验吸取一定量矢车菊-3-O-葡萄糖苷溶液，连续进样5次，测定峰面积。

测得RSD为1.27%，表明进样精密度良好。

2.5稳定性试验吸取一定量矢车菊-3-O-葡萄糖苷溶液，隔4h 进样测5次，测定峰面积。

测得RSD为1.46%，表明方法的稳定性良好。

2.6样品花色苷含量的测定取1mL提取液，过0.45μm滤膜后吸取一定量续滤液进样，测定峰面积，按照色谱条件进行测定并根据外标法计算出花色苷的总含量，见表1。

由测定峰面积及公式计算出3种不同颜色翠菊的花色苷含量，此外，通过3次重复试验，表明试验的重现性良好。

2.7回收率试验取3种不同颜色样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各3份，精密吸取矢车菊-3-O-葡萄糖苷对照品溶液1mL，按照2.3的步骤制样，测定峰面积。

结果表明：对照品的平均回收率分别为98.37%、96.85%、99.01%，RSD分别为2.33%、2.26%、2.51%，由此建立了HPLC测定翠菊花色苷含量的方法，此方法快速、简便、可靠。

3结论3.1HPLC测定方法的探讨运用HPLC法测定总花色苷的含量应注意几点问题：1.选择合适的色谱条件，色谱条件应最大限度的使各个色谱峰实现基线的分离，色谱峰的重叠将导致总花色苷的含量降低；2.选择合适的色谱柱，一般的色谱柱测定的pH范围在2～8，SB-C18色谱柱的pH范围在1～9，可以有效地避免5%的甲酸水溶液对色谱柱表13种不同颜色翠菊花色苷含量Table1The anthocyanin content of three hybrid callistephuschinensis with different colors序号表观颜色含量/（mg/100g）RSD/%（n＝3）Ⅰ粉红色168.15 2.20Ⅱ紫红色614.89 2.18Ⅲ蓝紫色193.89 1.83302010mAU010203040时间/min图1对照品的HPLC色谱图Fig.1HPLC of the standard(cyn-3-O-glu)检测分析陈亮，等：HPLC法测定3种杂交翠菊花色苷的含量130!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!的损害；3.保证对照品和供试品的测定条件相同，如pH 、温度，在不同的pH 下，花色苷的最大吸收波长和峰面积会发生变化；4.花色苷提取液经过树脂纯化将会导致花色苷含量不同程度的降低；5.根据不同的标准品计算的总花色苷结果会有差异。

3.2杂交翠菊花色苷的研究开发意义杂交翠菊生态适应性和传统翠菊无异，栽培要求条件不高，我国北方大部分地区均可种植，其亩产量可达2000kg ，本文通过对HPLC 测定发现紫红色杂交翠菊花色苷含量较高，为614.89mg/100g 鲜重，对开发高产、高效、高附加值的天然色素具有重要的意义，因此，研究杂交翠菊天然色素具有广阔的前景和重要的意义。