猪瘟E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗在非典型猪瘟病例中的控制效果

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猪瘟E2亚单位疫苗攻毒保护效力研究

猪瘟E2亚单位疫苗攻毒保护效力研究王遵宝;李俊辉;豆智华;郑侃;李森江;寇春;贺笋【摘要】猪瘟E2亚单位疫苗是一种用杆状病毒载体系统表达的猪瘟病毒E2重组蛋白,与油佐剂按比例混合、乳化制成的新型灭活疫苗,可区分感染和接种疫苗动物,有助于猪场的猪瘟净化.为评价该疫苗免疫效力,本研究用猪瘟E2亚单位疫苗与猪瘟兔化弱毒疫苗(传代细胞源)分别免疫靶动物,二免后2 w用强毒人工感染试验动物,连续测温16 d,并记录试验猪临床症状,结合病理剖检、组织器官病毒含量测定结果,比较不同疫苗保护力.结果显示:对照组猪攻毒后体温高热稽留,表现出典型猪瘟症状,攻毒后11 d内5/5发病死亡,尸检剖检呈典型猪瘟病理解剖学变化;免疫猪全部健活,未表现任何猪瘟症状,组织器官剖检无病变.结果表明,猪瘟E2亚单位疫苗与活疫苗保护效力相当,可为靶动物提供可靠的免疫保护效力.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2018(026)004【总页数】6页(P18-23)【关键词】猪瘟病毒;E2重组蛋白;亚单位疫苗;保护效力【作者】王遵宝;李俊辉;豆智华;郑侃;李森江;寇春;贺笋【作者单位】天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032;天康生物股份有限公司,乌鲁木齐 830032【正文语种】中文【中图分类】S852.651猪瘟（classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的猪的高度致死性、接触性传染病，是OIE规定的必须通报的A类动物传染病之一，在我国列为一类传染病，常给养猪业带来巨大的经济损失，历来是各国研究的热点。

场间种猪群猪瘟E2蛋白灭活疫苗与猪瘟活疫苗免疫效果对比

收稿日期：2019-03-28作者简介：刘浩（1976-），男，硕士，长期从事动物疫病防控、医政药政监督管理工作，E-mail：543966445@*通讯作者：韩永刚（1976-），男，陕西汉中人，执业兽医师，高级兽医师，主要从事动物疫病防控、实验室监测、疫情监测及网报等工作，E-mail：543966445@场间种猪群猪瘟E2蛋白灭活疫苗与猪瘟活疫苗免疫效果对比刘浩1丁小成2韩永刚3*王峰4(1陕西省动物卫生与屠宰管理站,陕西西安710000;2陕西省勉县黑河猪种猪场,陕西勉县723000;3陕西省汉中市汉台区畜牧兽医技术推广中心,陕西汉中723000;4陕西省城固县莲花街道办事处经济综合服务站,陕西城固723000)摘要:为准确了解、比对不同种猪场猪群免疫猪瘟E2灭活疫苗与猪瘟C 株(脾淋源、ST 传代细胞源)活疫苗效果。

对A 、B 、C 、D 、E 、F 6家猪场1672头母猪免疫对应猪瘟疫苗后,分别采集6家猪场的20头、30头、10头、20头、10头、10头共计100头母猪的血清样品进行间接ELISA 检测。

结果显示100份样品中猪瘟抗体阳性率100%;其中免疫猪瘟C 株(脾淋源、ST 传代细胞源)活疫苗组A 、B 、C 场抗体效价OD 均值分别为2.0662、2.0029、1.8147,离散度分别为41.86%、28.89%、43.85%;免疫猪瘟E2灭活疫苗D 、E 、F 场抗体效价OD 均值分别为2.6587、 2.2537、2.4862,离散度分别为21.75%、7.72%、9.76%;经两样本均数比较T 检验分析,2个试验组内抗体效价OD 值差异不显著,2个试验组间抗体效价OD 值差异极显著。

关键词:猪瘟;E2蛋白;疫苗;ELISA ;免疫效果中图分类号:S828;S852.65文献标识码:A文章编号:1673-4645(2019)05-0066-04猪瘟（Classical swine fever，CSF ）是由猪瘟病毒引起猪的一种高度接触性、出血性和致死性传染病，该病传染性强，致死率高，严重威胁养猪业的发展。

猪瘟e2基因工程亚单位疫苗使用效果分析

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率为70.64%，离散度为28.88%。（2）猪瘟E2免疫后母猪猪瘟血清抗体值发生了
很大的改变，猪场一阳性率从55.88%升高到100%，血清抗体平均阻断率从44.93%升高到81.71%，离散度从 55.72%降低到14.09%；猪场二阳性率从85.71%上升到 100%，平均阻断率从70.64%上升到93.33%，离散度从 28.88%降低到7.32%。
（3）猪场一猪瘟E2组猪瘟血清抗体阻断率不但比免疫前效果好，而且与ST组对比也产生了很好的效果，阳性率：猪瘟E2组为100%，ST组为84%；平均阻断率：猪瘟E2组为81.71%，ST组为64.32%；离散度：猪瘟E2组为14.09%，ST组为31.07%。
（4）猪场一和猪场二猪瘟E2免疫猪瘟抗体阴性猪只，猪场一猪瘟E2免疫后检测的25头猪，其中12头为猪瘟E2免疫前检测的阴性猪，12头全部转阳，并且平均阻断率达到76.65%，离散度只有16.31%；猪场二3 头阴性猪也全部转阳，平均阻断率达到95.68%。
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图5 猪瘟E2免疫前后血清抗体阻断率对照
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图6 免疫前后平均阻断率和离散度对照
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3 小结
图7 免疫前w 后阳性率对照
（1）通过检测结果来看，猪场一和猪场二在使用
原有疫苗免疫的基础上免疫效果均不理想，猪场一的
阳性率只有55.88%，血清抗体平均阻断率为44.93%，
散离度为55.72%；猪场二阳性率为85.71%，平均阻断
猪瘟E2基因工程亚单位疫苗可以有效改善目前猪瘟的防控现状。从猪瘟E2基因工程亚单位疫苗免疫前后检测结果得出，猪场阳性率从55.88%升高到 100%，平均阻断率从44.93%升高到81.71%；离散度从55.72%降低到14.09%，并且和ST组对比也有显著提高。阳性率：猪瘟E2组为100%，ST组为84%；平均阻断率：猪瘟E2组为81.71%，ST组为64.32%；离散度：猪瘟E2组为14.09%，ST组为31.07%。猪场二阳性率从85.71%上升到100%，平均阻断率从70.64%上升到 93.33%，离散度从28.88%降低到7.32%。

非典型猪瘟用注射猪瘟疫苗来治疗的怀疑

2023-11-08CATALOGUE目录•背景介绍•非典型猪瘟的流行病学•猪瘟疫苗的种类与作用机制•非典型猪瘟用注射猪瘟疫苗来治疗的怀疑•争议与讨论•参考文献01背景介绍•非典型猪瘟是一种由猪瘟病毒引起的传染病，其主要特征是猪只出现隐性感染和轻微的病症。

这种病症通常不会引起严重的经济损失，但仍然会对养猪业造成一定的影响。

非典型猪瘟的概述•猪瘟疫苗是预防和控制猪瘟的重要手段。

随着疫苗技术的不断发展，猪瘟疫苗已经经历了多个阶段的发展，包括灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗等。

这些疫苗都能够有效地预防和控制猪瘟的流行。

猪瘟疫苗的发展历程•非典型猪瘟与典型猪瘟在临床症状和病理变化上存在明显的区别。

非典型猪瘟通常不会引起严重的出血和器官损伤，而典型猪瘟则会出现这些明显的症状。

此外，非典型猪瘟的发病率和死亡率也较低，通常不会引起大规模的流行。

02非典型猪瘟的流行病学直接接触传播患病猪或带毒猪与健康猪直接接触，通过口鼻、眼睛分泌物等途径传播病毒。

间接传播通过污染的饲料、饮水、圈舍、医疗器械等媒介物，以及运输工具、人员等途径传播病毒。

非典型猪瘟的传播途径不同品种、年龄的猪均易感，但以3-18周龄的仔猪最为易感。

妊娠母猪感染后可经胎盘垂直传播给胎儿。

病猪和带毒猪是主要的传染源。

非典型猪瘟的易感群体非典型猪瘟主要在某些地区或养殖场呈地方性流行，与其他地区相比，流行强度较低。

非典型猪瘟的流行特点地方性流行非典型猪瘟的发病和流行无明显季节性，但冬季由于气温较低，病毒存活时间较长，感染几率相对较大。

季节性变化部分感染猪不表现出明显的临床症状，呈隐性感染，成为潜在的传染源。

隐性感染03猪瘟疫苗的种类与作用机制这种疫苗通常是在疫病暴发时使用，以控制疾病的传播。

地方性猪瘟疫苗这种疫苗是通过对病毒进行减毒处理而制成的，它能够刺激免疫系统产生针对全病毒的免疫力。

弱毒疫苗传统猪瘟疫苗基因工程疫苗这种疫苗是通过基因工程技术将病毒的基因片段插入到其他载体中制成的，它能够刺激免疫系统产生针对病毒特定抗原的免疫力。

猪瘟疫苗在猪瘟防治上的应用技术

猪瘟疫苗在猪瘟防治上的应用技术猪瘟疫苗是一种预防和控制猪瘟病的常见方法。

猪瘟是一种病毒性疾病，会影响猪的健康和生产能力。

疫苗的使用可有效减少猪瘟的发病率和死亡率，提高养猪业的生产效益。

猪瘟疫苗的类别和技术猪瘟疫苗可分为活疫苗和灭活疫苗两类。

活疫苗是由病毒培养所得的复合疫苗，通过肌注或口服的方式给予猪。

在猪体内，病毒会引发病理反应，从而刺激免疫系统，并促进抗体的产生。

活疫苗的效果较好，但需要特殊的管理和控制。

灭活疫苗是由猪瘟病毒经过特殊处理后的疫苗，通常是通过辐射和化学方法灭活的。

灭活疫苗的使用比活疫苗更安全，也更容易被商业化生产和销售。

为了提高疫苗的效果，猪瘟疫苗的制备需要遵循一些关键的技术和方法。

疫苗的筛选和质量控制、疫苗的保管和运输、疫苗的给予方式以及疫苗的接种程序等都需要仔细考虑和实践。

在猪瘟的防治中，疫苗的应用技术是至关重要的。

以下是几种常见的技术和方法：1. 疫苗接种时间：疫苗接种的时间和频率对于疫苗的效果至关重要。

一般来说，疫苗应在幼猪时期进行接种，以便提高其抗体水平。

此外，疫苗还需要按照规定的程序和频率进行接种，以确保免疫效果。

2. 疫苗运输和贮存：疫苗的运输和贮存必须在恒定的温度下进行，以确保疫苗的质量。

疫苗的质量主要取决于其活性水平和纯度，这些因素都会受到疫苗的温度和贮存条件的影响。

3. 疫苗接种方法：疫苗接种方法通常有肌注、口服、喷雾等多种方式。

肌注是其中最常用的方式，可通过肌肉或皮下注射进行。

口服疫苗的优点在于方便易行，但效果可能略有降低。

喷雾方式适用于群体性接种，可以大规模有效。

4. 疫苗接种程序：疫苗接种程序是确保疫苗效果的必要步骤。

针对不同的养殖条件和疫情情况，疫苗接种程序也会随之调整。

常见的接种程序包括初次接种、复种和加强注射等。

猪瘟病毒糖基化E2蛋白和E0蛋白的协同免疫保护作用

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇｄｉｓｅａｓｅｓｆｏｒｐｉｇｉｎｄｕｓｔｒｙａｎｄｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｉｓｃｒｉｔｉｃａｌｏｒｆｄｉｓ —
（江苏省农业科学院兽医研究所／农业部兽用生物制品工程技术重点实验室／国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京２１００１４）摘要：为了研究杆状病毒表达的糖基化亚单位疫苗的协同免疫保护作用，将重组杆状病毒感染Ｓｔ９细胞制备猪瘟Ｅ２、Ｅ０重组蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测蛋白表达和糖基化情况。用重组蛋白单独或联合免疫家兔，检测血清中抗
中图分类号：￥８５８．２８５．３文献标识码：Ａ文章编号：１０００４４ｄ０（２０１５）０２－０３５７－０５
ＳｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｅｆｅｃｔｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄＥ２・ａｎｄＥ０－ｂａｓｅｄｓｕｂｕｎｉｔｖａｃｃｉｎｅｏｆｃｌａｓ－ｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ
江苏农业学报（ＪｉａｎｇｓｕｏｆＡｇ２）：３５７～３６１
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｎＹｘｂ．ｔｏｍ

猪瘟e2基因工程疫苗的制备

猪瘟e2基因工程疫苗的制备猪瘟是一种对猪群造成严重危害的传染病，传统的疫苗有一定的应用局限性。

随着基因工程技术的发展，猪瘟e2基因工程疫苗逐渐成为一个新的治疗方案。

猪瘟e2基因工程疫苗是通过基因重组技术制备而成的。

首先，科研人员将猪瘟病毒的e2基因克隆到表达载体中，并利用各种转化技术将其导入到宿主细胞中。

在宿主细胞内，该基因会被表达，并进一步结合到载体中的免疫原，形成“猪瘟e2基因工程疫苗”。

研究表明，猪瘟e2基因工程疫苗对猪群具有很高的保护作用。

这种疫苗不仅能够防止猪瘟病毒的感染，而且还可刺激机体产生针对猪瘟病毒的免疫应答，从而增强免疫力。

总的来说，猪瘟e2基因工程疫苗的制备是一个复杂的过程，但其具有明显的优点，是预防和控制猪瘟病毒感染的一种新颖的手段。

猪瘟病毒糖基化E2蛋白和E0蛋白的协同免疫保护作用

猪瘟病毒糖基化E2蛋白和E0蛋白的协同免疫保护作用李文良;毛立;杨蕾蕾;张纹纹;江杰元【摘要】为了研究杆状病毒表达的糖基化亚单位疫苗的协同免疫保护作用,将重组杆状病毒感染Sf9细胞制备猪瘟E2、E0重组蛋白,Western blot检测蛋白表达和糖基化情况.用重组蛋白单独或联合免疫家兔,检测血清中抗体水平变化.在首免后4周用猪瘟兔化弱毒疫苗C株攻毒家兔,监测其体温变化,并运用RT-PCR检测家兔脾脏中病毒RNA.结果表明,E2、E2+E0免疫组兔均可诱导产生高水平的抗体和中和抗体,但两组间差异不显著.攻毒后E2免疫组2/5兔出现轻热症状,1/5兔脾脏病毒阳性;E2+E0组兔均未出现发热症状,也未检测到C株病毒RNA.E0组不能诱导兔产生中和抗体,但也能提供部分保护(2/5).可见,基于E2、E0的亚单位疫苗具有良好的免疫原性,且两者联合使用具有协同作用,有望成为新型亚单位疫苗的候选抗原.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2015(031)002【总页数】5页(P357-361)【关键词】猪瘟;亚单位疫苗;E2蛋白;E0蛋白;协同作用【作者】李文良;毛立;杨蕾蕾;张纹纹;江杰元【作者单位】江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】S858.285.3猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病,对世界养猪业造成了严重危害[1-3]。

猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定

江苏农业学报(Jiangsu J.of Agr.Sci.),2013,29(2):341~345h ttp://www.js n y x 李文良,毛　立,张纹纹,等.猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定[J].江苏农业学报,2013,29(2):341⁃345.doi:10.3969/j.issn.1000⁃4440.2013.02.019猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定李文良,　毛　立,　张纹纹,　杨蕾蕾,　王小敏,　江杰元(江苏省农业科学院兽医研究所,农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,江苏南京210014)收稿日期:2012⁃07⁃02基金项目:江苏省农业科技自主创新基金项目[DCX(10)4129]作者简介:李文良(1984⁃),男,河南开封人,博士,助理研究员,主要从事动物传染病防治和诊断技术研究㊂(E⁃mail)kfliwen⁃liang@通讯作者:江杰元,(Tel)025⁃84391135;(E⁃mail)jieyuanj @hotmail.com 摘要:　为获得糖基化的重组猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白,通过PCR 扩增出去除C 端跨膜区的猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2蛋白基因,前面包含糖基化信号肽,末端引入StrepⅡ标签序列,将其克隆到Bac⁃to⁃Bac 杆状病毒表达系统pFastBac TM HT B 载体中,筛选获得阳性重组质粒pF⁃ge2,转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac 感受态大肠杆菌中,经蓝白菌落筛选和PCR 鉴定,获得重组表达载体rBac⁃ge2㊂在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rAc⁃gE2㊂Western⁃blot 试验结果表明,重组蛋白得到正确表达,具有良好的抗原性;用糖苷酶PNGase F 处理后重组蛋白分子量减小到40000,证明重组蛋白为糖基化蛋白㊂这为进一步研究E2蛋白的功能及CSFV 新型亚单位疫苗的开发奠定了基础㊂关键词:　猪瘟病毒;E2蛋白;糖基化;杆状病毒表达系统中图分类号:　S858.28 文献标识码:　A 文章编号:　1000⁃4440(2013)02⁃0341⁃05Expression and identification of the glycosylated E2protein of classical swine fever virus (CSFV )in recombinant baculovirusLI Wen⁃liang,　MAO Li,　ZHANG Wen⁃wen,　YANG Lei⁃lei,　WANG Xiao⁃min,　JIANG Jie⁃yuan(Institute of Veterinary Medicine ,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences /Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology ,Ministryof Agriculture /National Center for Engineering Research of Veterinary Bio⁃products ,Nanjing 210014,China ) Abstract :　In order to get the glycosylated E2protein of classical swine fever virus (CSFV),the gene which con⁃tains glycosylation signal at 5′terminal and StrepⅡmarker sequence at 3′terminal of hog cholera lapinized virus (HCLV)without transmembrane region (TMR)was amplified by RT⁃PCR.The RT⁃PCR product (ge2)was cloned into the donor vector pFastBac TM HT B of Bac⁃to⁃Bac baculovirus expression system.After PCR,enzyme digestion and sequencing analy⁃sis,the purified recombinant plasmid pF⁃ge 2was transformed into Escherichia coli competent cells DH10Bac containingbaculovirus shuttle vector.After twice blue⁃white selections,the white colonies were selected and the recombinant bacmidrBac⁃ge2was verified by PCR.After the transfection of recombinant bacmid into Sf9insect cells,the recombinant baculov⁃irus rAc⁃gE2was obtained and was further confirmed by Western blot with antibodies against Strep Ⅱmarker and E2protein.After treated with PNGase F ,the molecular weight of recombinant protein reduced to 40000,which suggested that it was glycosylated protein.Key words :　classical swine fever virus (CSFV);E2protein;glycosylation;baculovirus expression sys⁃tem1. All Rights Reserved. 猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病,是世界动物卫生组织(OIE)规定的必须报告的疫病,对世界养猪业造成严重危害㊂CS⁃FV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivir⁃us),基因组为单股正链RNA,长约12.3kb,编码1个由3900个氨基酸组成的多聚蛋白[1]㊂在宿主和病毒蛋白酶作用下裂解成4个结构蛋白[C㊁E0(E rns)㊁E1㊁E2]和8个非结构蛋白(N pro㊁p7㊁NS2㊁NS3㊁NS4A㊁NS4B㊁NS5A㊁NS5B)[1]㊂其中囊膜糖蛋白E2介导病毒的感染,诱导机体产生中和抗体,保护机体抵抗病毒的感染,是重要的保护性抗原之一[2⁃4]㊂因此,E2蛋白是研制新型活载体疫苗㊁亚单位疫苗的候选抗原[1,5⁃8]㊂E2蛋白是糖基化蛋白,最近有研究结果表明,E2㊁E0的糖基化对其免疫保护作用起决定作用,未糖基化的蛋白质不具有免疫保护作用[9]㊂这为新型亚单位疫苗的研制提供了重要的理论依据㊂杆状病毒表达系统具有表达水平高,表达产物可进行翻译后加工,其抗原性㊁免疫原性和功能等生物活性与天然蛋白相似等特点㊂国内外许多学者采用该系统对E2蛋白进行了表达,目前国外已有商品化疫苗上市,如拜耳公司的BAYOVAC®CSF Mark⁃er和英特威公司的Porcilis®Pesti,这两种疫苗还有配合使用的ELISA抗体鉴别检测方法[1]㊂国内许多单位都利用杆状病毒表达系统进行E2蛋白表达鉴定工作,但多为单独表达E2蛋白,没有考虑引入信号肽和重组蛋白糖基化水平的检测[7⁃8,10⁃11],也很少有对其进行糖基化水平的研究[12]㊂本研究试图利用Bac⁃to⁃Bac杆状病毒表达系统构建表达猪瘟病毒糖基化E2蛋白的重组杆状病毒,并对目的蛋白的表达特性及其抗原性进行鉴定,旨在为其免疫学特性和CSFV新型亚单位疫苗的研究奠定基础㊂1　材料与方法1.1　材料与试剂Bac⁃to⁃Bac杆状病毒表达系统(包括转移载体质粒pFastBac TM HT B㊁DH10Bac细菌和Sf9昆虫细胞)由本实验室保存;限制性内切酶㊁T4DNA连接酶购自大连宝生物工程有限公司;Trizol试剂购自Invitrogen公司;反转录试剂盒㊁Taq酶㊁大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自杭州Axygen公司;转染试剂购自Promega公司;HRP标记的兔抗猪IgG和羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术有限公司;DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;兔抗StrepⅡ标签多抗购自南京金斯瑞生物科技有限公司;PNGase F购自New England BioLabs公司㊂1.2　引物设计和ge2基因的扩增参照文献[9]并根据HCLV E2基因序列设计RT⁃PCR扩增用引物,gE2F:5′⁃AT GGATCCATG⁃GTCGTGCAAGGTGTGATATGGCTGTTACTGGTAACTGG GGCACAAGGC CGGCTAGCCTGCAA⁃3′;gE2R:5′⁃GGA CTCGAGTCA CTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCA TTCT⁃GCGAAGTAATC⁃3′,上下游引物分别引入糖基化信号肽序列和StrepⅡ标签序列(斜体部分)以及Bam H I和Xho I位点(下划线部分),引物由南京思普金生物科技有限公司合成㊂取200μl猪瘟兔化弱毒疫苗毒(南京天邦生物科技有限公司提供),加入1ml Trizol试剂,振荡混匀,静置10min,加入200μl氯仿,剧烈振荡,12000 r/min㊁4℃离心10min,小心吸取上清,加入等体积异丙醇混匀,-20℃放置2h,12000r/min㊁4℃离心15min,弃上清,加入75%乙醇洗涤,干燥,加入10μl无Rnase的双蒸水溶解RNA㊂按照反转录试剂盒操作说明用引物gE2R进行反转录,具体为:2×ES reaction mix10μl,EasyScript RT/RI enzyme mix1μl,引物gE2R1μl,RNA5μl,无Rnase的双蒸水补足至20μl㊂42℃反应45min, 85℃加热5min灭活反转录酶,以反转录产物为模板,进行PCR扩增㊂PCR反应体系为:gE2F㊁gE2R (10pmol/L)各1μl,dNTPs(2.5mmol/L)2μl,10×PCR buffer2.5μl,模板4μl,Taq酶(5U/μl)0.5μl,灭菌双蒸水补至25μl㊂循环参数:94℃5min; 94℃30s,56℃30s,72℃1min,35个循环;72℃10min㊂10g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物㊂1.3　重组载体质粒pF⁃ge2的构建与鉴定将回收的目的基因用Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切,回收纯化之后克隆入同样酶切处理的转移载体质粒pFastBac TM HT B中,转化E.coli DH5α感受态细胞㊂对PCR和Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定为阳性的质粒进一步测序,将序列正确的阳性重组质粒命名为pF⁃ge2㊂243江苏农业学报　2013年第29卷第2期. All Rights Reserved.1.4　重组质粒rBac⁃ge2的构建按照Bac⁃to⁃Bac杆状病毒表达系统操作说明,将阳性质粒pF⁃ge2转化含Bacmid质粒的感受态细胞DH10Bac,经两次蓝白菌落筛选,挑取白色菌落培养,提取Bacmid质粒,利用gE2F和M13R进行PCR鉴定,获得含ge2基因的重组质粒rBac⁃ge2㊂1.5　重组杆状病毒的获得㊁PCR鉴定与病毒扩增按照转染试剂的操作说明将重组质粒rBac⁃ge2转染Sf9细胞,27℃静置培养,每天观察细胞病变情况㊂在转染后第5d收获细胞培养上清, 500g离心10min得到上清,获得第1代重组杆状病毒,命名为rAc⁃gE2,置4℃避光保存㊂提取第1代杆状病毒DNA,用引物gE2F和gE2R PCR扩增目的基因,以鉴定外源基因是否整合进重组杆状病毒基因组㊂将第1代病毒继续接种对数生长期的Sf9细胞,27℃培养3~4d至细胞出现明显病变时,即可收获上清得到第2代病毒,用同样的方法获得第3代病毒,每一代病毒均置4℃避光保存㊂1.6　重组E2蛋白在Sf9细胞中的表达与West⁃ern⁃blot鉴定将第3代重组杆状病毒感染Sf9细胞,同时设野生型杆状病毒感染Sf9细胞作为对照,72h后收获细胞培养物,弃去细胞培养上清,加入预冷的PBS (0.01mol/L㊁pH7.2),反复冻融3次,超声裂解细胞,4℃㊁12000r/min离心15min,吸取上清,加入2×Loading buffer煮沸10min㊂取20μl样品进行SDS⁃PAGE,Western⁃blot鉴定采用StrepⅡ标签多抗和CSFV阳性猪血清(购自中国兽医药品监察所)进行㊂SDS⁃PAGE电泳结束后,采用半干转印法将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上,50g/L脱脂乳室温封闭4h,分别加入1∶1000稀释的StrepⅡ标签多抗和1∶200稀释的CSFV阳性猪血清,37℃孵育2h, PBST洗涤3次,加入1∶2000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG和兔抗猪IgG,37℃孵育1h,PBST洗涤3次,加入DAB显色液,观察特异性蛋白条带㊂1.7　重组蛋白糖基化检测参照PNGase F操作说明书,取重组蛋白18μl,加入2μl10×变性缓冲液,100℃处理10min,然后加入3μl10×反应缓冲液㊁3μl10%NP⁃40和4μl 糖苷酶PNGase F,37℃作用1h㊂与野毒蛋白㊁未处理蛋白一起,以StrepⅡ标签多抗为一抗进行West⁃ern blot,操作同方法1.6,观察处理前后蛋白质分子量的变化㊂2　结果2.1　基因扩增与重组转移载体的构建将PCR扩增的目的基因(图1A)克隆入pFast⁃Bac TM HT B中,转化E.coli DH5α感受态细胞,挑单菌落提取质粒,进行PCR鉴定㊂取PCR阳性质粒进行Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切,获得一条约1100bp 的片段(图1B)㊂测序结果证实ge2基因正确克隆入pFastBac TM HT B,且序列与原有序列完全一致,符合原有阅读框,将该重组质粒命名为pF⁃ge2㊂1:PCR产物;2㊁3:Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切pF⁃ge2;M:DNA marker DL2000㊂图1　ge2基因的RT⁃PCR扩增(A)和重组质粒pF⁃ge2的酶切鉴定(B)Fig.1　Amplification of ge2gene(A)and identification of the recombinant plasmid pF⁃ge2(B)2.2　重组质粒rBac⁃ge2的构建与鉴定将pF⁃ge2转化含Bacmid质粒的感受态细胞DH10Bac,发生位点特异性的转座,经3种抗生素(卡那霉素㊁四环素㊁庆大霉素)抗性筛选和蓝白菌落筛选,挑白色菌落培养,提取质粒,用gE2F和M13R进行PCR鉴定,扩增出大小约1800bp的条带(图2),而以Bacmid为模板的对照中未扩出条带,证明成功获得重组质粒rBac⁃ge2㊂2.3　重组病毒的获得与重组蛋白的Western⁃blot 鉴定用rBac⁃ge2转染第1代Sf9病毒细胞病变出现不明显,第2代接种后3d就可看到明显的细胞病变:细胞变大㊁变圆㊁脱落㊂提取重组病毒rAc⁃gE2基因组DNA,采用PCR方法用引物gE2F和gE2R 扩增ge2基因,在1100bp左右可见明显条带㊂取343李文良等:猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定. All Rights Reserved.1:野生型Bacmid;2㊁3:重组质粒rBac⁃ge2;M:DNA marker DL2000㊂图2　rBac⁃ge2的PCR鉴定Fig.2　Identification of rBac⁃ge2by PCR感染后72h细胞裂解上清用StrepⅡ标签多抗和CSFV阳性猪血清对重组蛋白进行Western⁃blot鉴定,结果如图3所示㊂两种抗体均能与重组蛋白产生特异性结合,而野生型病毒感染的细胞无此染色反应条带㊂A:一抗为StrepⅡ多抗;B:一抗为阳性猪血清;1:野生型杆状病毒接种Sf9细胞后72h收获样品;2:重组病毒rAc⁃gE2接种Sf9细胞后72h收获样品;M:蛋白质分子量标准㊂图3　重组病毒rAc⁃gE2的Western⁃blot鉴定Fig.3　Western⁃blot analysis of gE2protein expressed in rAc⁃gE22.4　重组蛋白糖基化水平的检测将重组蛋白用PNGase F处理后与野毒蛋白㊁未处理蛋白一起进行Western⁃blot㊂如图4所示,未处理蛋白分子量约50000,处理后蛋白分子量减为40000,符合E2蛋白的预计分子量,表明成功获得糖基化的E2重组蛋白㊂3　讨论杆状病毒表达系统是目前常用的真核表达系统1:蛋白质分子量标准;2:野生型杆状病毒感染对照;3:未处理的gE2;4:PNGase F处理的gE2㊂图4　重组蛋白糖基化水平的检测Fig.4　Detection of glycosylation of gE2protein之一,其表达外源蛋白具有产量高㊁抗原性好㊁操作简便快速等优点,已在多种疫病研究中得到广泛应用㊂此外,杆状病毒表达系统具有与动物细胞相似的转录翻译及翻译后加工等功能,包括糖基化㊁磷酸化㊁酰基化㊁信号肽切除等,外源蛋白在细胞内可以进行正确的折叠而基本保持原有的生物活性㊂因此,杆状病毒表达系统经常用来表达具有特定结构功能的糖蛋白㊂E2蛋白76位氨基酸含有1个O⁃糖基化位点,在116㊁121㊁185㊁229㊁260和297位氨基酸含6个N⁃糖基化位点[9,13⁃14]㊂对于病毒的糖蛋白来说,糖基化会影响蛋白质的构象和中和抗体的产生,去除这些糖基化位点对其抗原性影响可能有3种结果:增强㊁降低或无关㊂研究结果表明E2蛋白76㊁116㊁121㊁185㊁229位氨基酸的突变会明显降低重组E2蛋白诱导中和抗体产生的滴度[9]㊂因此,获得正确糖基化的E2蛋白对于CSFV诊断方法的建立和新型疫苗的研制至关重要㊂本研究克隆了包含信号肽的E2蛋白基因,采用StrepⅡ多抗和阳性猪血清进行Western blot检测证明获得了糖基化的重组E2蛋白,且2种抗体检测均可见2个明显条带,这可能是蛋白糖基化程度不同所致㊂而采用针对杆状病毒表达载体N端His标签的单抗鉴定未见目的条带,表明成熟的蛋白质不包含信号肽和融合的载体蛋白部分㊂用PNGase F处理重组蛋白,蛋白质分子量减小到40000,进一步证明表达的重组E2蛋白是糖基化蛋白㊂443江苏农业学报　2013年第29卷第2期. All Rights Reserved.E2蛋白的羧基端含有约40个氨基酸组成的跨膜区(Transmembrane region,TMR),该区域中疏水性氨基酸的比例高达65%以上,尤其是第356~375位的氨基酸,疏水性极强,它的存在对重组蛋白的表达有影响,而该区域不含有关键的抗原表位㊂研究结果表明去掉跨膜区可明显提高蛋白质的表达量和可溶性[15]㊂本研究在去除跨膜区的基础上在蛋白质末端引入8个氨基酸的StrepⅡ标签序列,利于切除信号肽后的E2糖蛋白的鉴定和纯化,且可以作为亚单位疫苗的阳性标记与非结构蛋白的阴性标记共同用于野毒感染抗体的检测㊂总之,本研究结果表明E2蛋白在重组杆状病毒中得到正确表达,且可以糖基化,具有良好的抗原性,可以与相应抗体发生特异性反应,这为CSFV基因工程亚单位疫苗的研制和诊断方法的建立奠定了基础㊂参考文献:[1]　DONG X N,CHEN Y H.Marker vaccine strategies and candidateCSFV marker vaccines[J].Vaccine,2007,25(2):205⁃230.[2]　WEILAND E,STARK R,HAAS B,et al.Pestivirus glycoproteinwhich induces neutralizing antibodies forms part of a disulfide⁃linked heterodimer[J].J Virol,1990,64(8):3563⁃3569. [3]　WANG Z,NIE Y,WANG P,et al.Characterization of classicalswine fever virus entry by using pseudotyped viruses:E1and E2 are sufficient to mediate viral entry[J].Virology,2004,330(1): 332⁃341.[4]　DONG X N,CHEN Y H.Candidate peptide⁃vaccines induced im⁃munity against CSFV and identified sequential neutralizing deter⁃minants in antigenic domain A of glycoprotein E2[J].Vaccine, 2006,24(11):1906⁃1913.[5]　SUN Y,LIU D F,WANG Y F,et al.Generation and efficacy e⁃valuation of a recombinant adenovirus expressing the E2protein of classical swine fever virus[J].Res Vet Sci,2010,88(1):77⁃82.[6]　LIN G J,DENG M C,CHEN Z W,et al.Yeast expressed classi⁃cal swine fever E2subunit vaccine candidate provides complete protection against lethal challenge infection and prevents horizontal virus transmission[J].Vaccine,2012,30(13):2336⁃2341.[7]　查云峰,徐兴然,肖　昌,等.猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞中的分泌表达及活性检测[J].畜牧兽医学报,2005,36(10): 1100⁃1105.[8]　范学政,徐　璐,王　琴,等.猪瘟病毒E2基因密码子优化后在昆虫细胞中的表达[J].中国兽医杂志,2011,43(5):560⁃568.[9]　GAVRILOV B K,ROGERS K,FERNANDEZ⁃SAINZ I J,et al.Effects of glycosylation on antigenicity and immunogenicity of clas⁃sical swine fever virus envelope proteins[J].Virology,2011,420(2):135⁃145.[10]韩建强,信爱国.猪瘟病毒E rns和E2基因在昆虫细胞中的表达研究[J].西南大学学报:自然科学版,2011,33(2):23⁃27.[11]周向阳,万　婧,廖　迅,等.猪瘟病毒石门株E2蛋白在杆状病毒系统中的表达[J].动物医学进展,2012,33(1):28⁃32. [12]彭伍平,夏照和,侯　强,等.猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析[J].病毒学报,2007,24(5):389⁃393.[13]RISATTI G R,HOLINKA L G,FERNANDEZ⁃SAINZ I J,et al.N⁃linked glycosylation status of classical swine fever virus strain Brescia E2glycoprotein influences virulence in swine[J].J Virol, 2007,81:924⁃933.[14]VAN RIJN P A,MIEDEMA G K,WENSVOORT G,et al.Anti⁃genic structure of envelope glycoprotein E1of hog cholera virus [J].J Virol,1994,68:3934⁃3942.[15]HULST M M,WESTRA D F,WENSVOORT G,et al.Glycopro⁃tein E1of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera[J].J Virol,1993,67:5435⁃5442.(责任编辑:汪恒英)543李文良等:猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定. All Rights Reserved.。

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究陈晓;李伟国;宋欢欢;苏晓蕊;王同燕;谭菲菲;田克恭【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2024(32)2【摘要】为建立一套表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺,提高反应器上猪瘟病毒E2蛋白的表达量,以商业化培养基为基础,通过对关键营养组分添加量的DOE试验设计优化,获得一种组合补料配方,并在3 L反应器上对补料方式进行优化,以最大限度提高细胞密度。

进一步在反应器上摸索了通气策略,以精确调控猪瘟E2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡,解决副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题。

首次使用半连续补料工艺与渗透压动态平衡相结合的补料策略以及定向调节通气的工艺模式,使猪瘟病毒E2蛋白的表达量由130 mg/L增加至520 mg/L,提高了3倍。

将3 L反应器工艺在100 L反应器上进行了连续3个批次的验证,结果猪瘟病毒E2蛋白的表达量均大于500 mg/L,收获猪瘟E2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳,且抗体水平持续上升,接种后8周抗体阻断率仍维持在80%左右。

综上,3 L反应器工艺能够稳定放大至100 L反应器,建立了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒100 L反应器工艺,且100 L反应器上重组蛋白的表达量稳定、免疫原性良好。

【总页数】9页(P49-57)【作者】陈晓;李伟国;宋欢欢;苏晓蕊;王同燕;谭菲菲;田克恭【作者单位】国家兽用药品工程技术研究中心;普莱柯生物工程股份有限公司【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.猪瘟病毒糖基化E2蛋白在重组杆状病毒中的表达与鉴定2.猪瘟E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗在非典型猪瘟病例中的控制效果3.信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响4.昆虫细胞-杆状病毒系统分泌表达的猪瘟病毒E2蛋白及其免疫原性研究5.教师角色定位对幼儿表演游戏水平发展的作用因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪瘟病毒基因2型流行毒株和疫苗C株抗血清与相应E2蛋白交叉免疫反应性分析

猪瘟病毒基因2型流行毒株和疫苗C株抗血清与相应E2蛋白交叉免疫反应性分析廖迅;王作欢;曹统;谷元兴;李肖梁;方维焕【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2017(039)003【摘要】To investigate the difference of cross-reactivity of E2 proteins in classical swine fever vius (CSFV) vaccine C-strain and field isolates with corresponding antisera,the recent and early CSFV Zhejiang isolates of QZ-14,JH-14,QZ-07 and HZ-08 as well as C-strain were compared on the variations of their E2 genes.The antisera to C-strain and field isolates (QZ-14,QZ-07 and HZ-08) were prepared in pigs with recombinant E2 proteins (rE2) of CSFV expressed from baculovirus expression systems and used to examine cross-reactivity with rE2.The monoclonal antibody (MAb) 4F4 prepared against E2 of field isolates was used for detection of CSFVs in cells in vitro.The phylogenetic analysis based on E2 gene sequences of CSFV shown that isolate of QZ-14 and JH-14 belonged to subgroup2.1d,and the isolates of QZ-07 and HZ-08 were subgroup 2.1b,which were 82-84％ nucleotide identity to C-strain.lmmunofluorescence assay indicated that MAb 4F4 recognized the 4 field isolates,but not the C-strain.All pigs inoculated with field isolates displayed certain degree of clinical symptoms and their antisera had lower level of reactivity with E2 of C-strain.ELISA showed that reactivity of anti-C-strain sera collected at day28 post inculcation with E2 of subgroup 2 isolates was only 27％-49％ of its homologous E2,while that of antisera from field isolates to the C-strain E2 was 34％ -50％ of the homologous E2 proteins.Western blot detection also had the similar results.These results suggest that the variations of the E2 proteins between the group 2 CSFV isolates and C-strain could affect cross-reactivity with heterolgous antisera.Further research is needed to examine if such decreased immuno-reactivity is related to reduce protection of C-strain-based vaccine.%为研究猪瘟病毒(CSFv)2.1基因亚型病毒株和疫苗C株E2蛋白与相应抗血清的免疫反应性差异,本研究在分析4株CSFV 浙江流行株(QZ-14、JH-14、QZ-07和HZ-08)与疫苗C株E2变异程度的基础上,制备了流行病毒株和疫苗C株全病毒猪抗血清以及针对流行株E2的单克隆抗体(MAb) 4F4,比较了它们与同源株和异源株重组杆状病毒表达的E2蛋白的亲和性.结果显示,4株浙江分离株中2株(QZ-14和JH-14)属于亚型2.1d,另2株(QZ-07和Hz-08)为亚型2.1b,它们与C株E2的核苷酸同源性在82％～84％;间接免疫荧光鉴定显示MAb 4F4能够识别4株流行株,但不与C株反应;接种流行株的动物均出现不同程度临床症状;ELISA分析显示疫苗C株血清与流行株E2蛋白的反应性约为C株E2蛋白的27 ％～49％,2株流行株感染血清与C株E2蛋白反应性约为流行株E2蛋白的34％～50％,免疫印迹分析显示类似结果.以上结果表明CSFV基因2型流行株与疫苗C株E2蛋白的差异显著影响其与相应抗血清的交叉免疫反应性,这一现象是否与C株猪瘟疫苗免疫保护效果下降有关还有待于进一步研究.【总页数】5页(P172-176)【作者】廖迅;王作欢;曹统;谷元兴;李肖梁;方维焕【作者单位】浙江大学动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058;浙江大学动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058;浙江大学动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058;浙江大学动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058;浙江大学动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058;浙江大学动物预防医学研究所/浙江省动物预防医学重点实验室,浙江杭州310058【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.人脑乙酰胆碱酯酶的化学合成抗原十肽与电Yao乙酰胆碱酯酶抗血清的交叉免疫反应性 [J], 张兴梅;刘刚;等2.猪瘟E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗在非典型猪瘟病例中的控制效果 [J], 韩永刚;刘浩3.场间种猪群猪瘟E2蛋白灭活疫苗与猪瘟活疫苗免疫效果对比 [J],4.表达猪瘟病毒E2蛋白的重组PRRSV疫苗株rPRRSV-E2的水平传播能力研究[J], 高飞;姜一峰;李国新;张玉娇;虞凌雪;周艳君;李丽薇;郑海红;童光志5.猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析 [J], 彭伍平;夏照和;侯强;李娜;孙元;童光志;仇华吉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

3种佐剂对猪瘟病毒E2蛋白免疫效果的影响

3种佐剂对猪瘟病毒E2蛋白免疫效果的影响陈玉梅;刘运超;祁艳华;梁超;周景明;王爱萍【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2024(45)3【摘要】为筛选猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)亚单位疫苗高效佐剂,将杆状病毒表达系统制备的重组CSFV E2蛋白分别与铝佐剂(胶状)、50V佐剂(W/O)和201佐剂(W/O/W)3种不同佐剂配伍后免疫Balb/c小鼠,经间接ELISA 和阻断ELISA测定抗体效价及血清IL2、IL4、IL10和IFN-γ细胞因子水平。

结果显示,经Ni-NAT亲和层析纯化获得的重组E2蛋白纯度约95%;免疫后28 d,无佐剂的E2蛋白免疫Balb/c小鼠后抗体效价达到1∶3200,但血清抗体阻断率小于30%;加入佐剂后,抗体效价明显提升,血清抗体阻断率也随之升高,3种不同的佐剂免疫血清抗体阻断率大于40%。

其中50V佐剂组抗体效价最高可达1∶204800,其抗体阻断率大于80%,且50V佐剂组免疫血清中IL-4表达量最高为892.23pg/mL,说明50V佐剂可以有效激发以Th2型免疫应答为主的细胞免疫反应。

综合B细胞和T细胞免疫应答结果,50V佐剂对E2蛋白的免疫效果提升明显优于其他佐剂,试验结果为进一步研究高效猪用CSFV亚单位疫苗奠定了基础。

【总页数】6页(P22-27)【作者】陈玉梅;刘运超;祁艳华;梁超;周景明;王爱萍【作者单位】郑州大学生命科学学院;河南省农业科学院动物免疫学重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S855.3【相关文献】1.大肠埃希菌外膜囊泡递呈猪瘟病毒E2蛋白的表达及其免疫效果评价2.场间种猪群猪瘟E2蛋白灭活疫苗与猪瘟活疫苗免疫效果对比3.信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响4.猪瘟病毒E2亚单位蛋白与集落刺激因子的融合表达及其免疫效果分析5.3种不同类型佐剂的猪瘟E2基因工程亚单位疫苗免疫效果的比较研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒遗传稳定性和免疫剂量研究的开题报告

猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒遗传稳定性和免疫剂量研究的开题报告题目：猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒遗传稳定性和免疫剂量研究研究背景和意义：猪瘟是一种由猪瘟病毒引起的高度传染性和致死性疾病，在养猪业中造成了严重的经济损失。

目前，猪瘟的防控主要是通过疫苗来实现。

然而，传统的猪瘟疫苗存在许多不足，比如制备周期长、免疫效果不稳定等问题。

因此，寻找一种新型的猪瘟疫苗具有重要意义。

鸡痘病毒是一种非致病的鸡致病毒，经过基因重组可以用于制备免疫性良好、安全性高的疫苗。

研究表明，将猪瘟病毒E0-E2基因重组到鸡痘病毒中，可以获得一种具有很好免疫效果的疫苗。

目前还缺乏对于猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性和免疫剂量的研究，对于该疫苗的进一步应用和推广都具有重要意义。

因此，本文旨在通过实验探究猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒在不同免疫剂量下的免疫效果和其遗传稳定性，为该疫苗的研发和应用提供有力的实验依据。

研究内容和方法：1.构建猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒采用分子克隆技术构建猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒，并通过PCR、Western blot等技术验证其准确性和表达情况。

2.评价重组病毒在体内的免疫效果选用小鼠模型，分别给予不同剂量的猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒接种，观察其免疫效果，包括血清中特异性抗体水平和小鼠免疫保护率等指标。

3.检测重组病毒的稳定性收集体内或者体外繁殖的病毒，通过PCR和测序技术检测其遗传变异和稳定性。

预期成果和意义：本研究可以评估猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒在小鼠免疫中的免疫保护效果和免疫剂量，并对其在体内的遗传稳定性进行研究。

预期可以为该疫苗的研发提供有力的实验依据，为其在养猪业中的应用和推广提供技术基础。

同时，探讨基因重组技术在病毒病疫苗研发中的应用，对于推动病毒疫苗研究和应用具有重要意义。

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养猪SWINE PRODUCTION2019第2期猪瘟E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗在非典型猪瘟病例中的控制效果韩永刚1，刘浩2（1.陕西省汉中市汉台区畜牧兽医技术推广中心，陕西汉中723000；2.陕西省动物卫生与屠宰管理站，西安710000）中图分类号：S858.282.5+2文献标志码：A文章编号：1002-1957(2019)02-0097-04猪瘟是由猪瘟病毒引起的高度接触性传染病，最早发现于美国俄亥俄州。

世界动物卫生组织（OIE）将其列入OIE疫病名录，为必须申报的（No－tifiable）动物传染病，我国也将其列为一类动物传染病[1]。

该病在世界范围内流行，以流行范围广、发病率和致死率高为主要特征，给世界养猪业造成严重危害。

近年来，猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势，一些已宣布消灭了猪瘟的国家（如法国、荷兰、德国等）又见猪瘟复发的报道[2]。

王琴等对我国流行的不同临床致病力和不同基因亚型的9株猪瘟病毒流行毒株进行了免疫保护效力研究，结果表明，以C株疫苗种毒生产的猪瘟活疫苗（传代细胞源）对我国目前流行的猪瘟高、中、低致病力毒株及不同基因亚型（1.1、2.1、2.2）流行毒株均具有很强的保护力，且免疫猪接种不同流行毒株后不排毒[3]，研究结果为我国继续使用猪瘟兔化弱毒活疫苗进行全面免疫提供了重要科学依据。

但是，C株疫苗具有一定局限性，不能区分免疫和自然感染动物，为了净化、消灭猪瘟，新型猪瘟标记疫苗将发挥重要作用[4]。

随着CSFV病毒学的发展研究者们逐渐认识到CSFV在感染中诱导产生的抗体主要是与结构蛋白Erns、E2和非结构蛋白NS3结合的。

由于NS3所含有的抗原表位在瘟病毒属具有很高的保守性[5]，使得Erns和E2成为进行标记疫苗候选毒株构建的首选。

中国台湾研究者利用巴斯德比赤酵母系统成功表达了重组E2蛋白，并在其后的动物试验中取得成功[6]。

中国大陆对亚单位疫苗的研究比较深入，已有一个杆状病毒表达的E2亚单位疫苗被注册使用，还有正在研究的如CHO表达E2等。

为准确了解、把握猪瘟E2蛋白灭活疫苗免疫对临床猪瘟病毒感染的控制效果，在某规模猪场发生的非典型猪瘟病例中，笔者使用已在国内上市的该疫苗进行了疫苗临床免疫保护试验，取得了良好的控制效果。

现将该猪场发病、诊断及免疫保护试验结果整理如下，供临床兽医技术人员参考，为今后规模猪场非典型猪瘟病例的防控提供技术支撑。

1基本情况A场为某省级生猪标准化示范场，种猪繁育场，存栏母猪数量332头，其中能繁母猪为278头。

圈舍条件较好，生产工艺先进并执行程序化免疫。

但该场人员素质偏低，管理不够规范，措施具体执行过程缺乏有效监督。

B场为A场新建合作肥育场，圈舍条件较好，肥育猪总存栏规模500头，但饲养管理人员生产防疫理念、技术素养均有待提高。

上述两场发病前一直使用某厂生产的猪瘟（ST 传代细胞源）活疫苗和猪瘟（脾淋源）活疫苗。

其中种猪每年免疫猪瘟疫苗4次，每次注射2头份/头，使用猪瘟（ST传代细胞源）活疫苗、猪瘟（脾淋源）活疫苗交替免疫；仔猪采用在30日龄、60日龄各免疫猪瘟（ST传代细胞源）活疫苗1~2头份/头的免疫方案。

猪瘟E2蛋白灭活疫苗为新疆天康生物制品厂提供的正式上市产品，批号20171120，有效期20181119，50毫升/瓶，2毫升/头份。

猪瘟免疫抗体间接ELISA检测试剂盒由北京试剂元亨动物防疫技术有限公司提供，批号：CSF20180918E，有效期20190917；猪瘟免疫抗体液相阻断ELISA检测试剂盒由美国爱德仕公司提供，批号：L871。

2发病情况（1）A场自2018年8月中旬保育猪和肥育猪陆续出现死亡。

临床症状主要表现为：精神高度沉郁，体温升高（41~42℃），稽留热，严重时不能行走、站收稿日期：2019-01-04作者简介：韩永刚（1976-），男，陕西汉中人，执业兽医师，高级兽医师，长期从事动物疫病防控、实验室监测、疫情监测及网报工作.E-mail:543966445@ 97DOI:10.13257/ki.21-1104/s.2019.02.0374实验室血清学及病原学检测结果通过流行病学调查、现场解剖诊断，初步判定怀疑A 、B 两场发病猪均为猪瘟病毒感染。

2018年9月对A 场保育猪分别采集同群假定健康猪血清8份、发病猪血清4份，对B 场采集发病死亡猪病料两套（包含扁桃体、淋巴结、脾脏、肾脏、肺脏），送相关级别实验室进行血清学和病原学诊断。

同时对母猪免疫猪瘟E2蛋白灭活疫苗所产的30日龄断奶仔猪（未首免猪瘟）采血样8份，进行母源抗体监测。

（1）血清学检测。

某BLS-2级实验室采用进口爱德仕猪瘟液相阻断ELISA 试剂盒对20份血清学进行血清抗体阻断率检测；某县级BLS-1级实验室对其中的5份同群假定健康猪血清和4份发病猪血清采用免疫后早期抗体检测中敏感性明显高于进口阻断ELISA 试剂盒，而特异性与之没有明显差异的国产猪瘟间接ELISA 试剂盒[7-8]，按试剂盒说明操作步骤进行了检测。

检测结果见表1和表2。

（2）病原学检测。

某BLS-2级实验室在病原学检测中对上述样品进行了合并，其中B 场两套病料合并为样品B ，假定健康群8份血清合并为样品A1，4份发病猪血清合并为样品A2，采用荧光PCR 检测方法进行检测，检测结果显示样品B 、A1、A2均为猪瘟病原学阳性。

立困难、扎堆。

有明显结膜炎，部分猪拉黄绿色稀便，病猪在耳部、颌下、颈部、腹部、四肢等处出现淤血、出血斑点，病程稍长，约1~2周。

保育猪、肥育猪群体死亡率5%~11%。

（2）B 场2018年9月中旬自A 场转入外观健康、60日龄左右保育猪106头（未进行猪瘟二次加强免疫），进圈3日后即表现临床症状，发病猪只日渐增多。

临床症状主要表现为：精神高度沉郁，体温升高达40.5~42℃，稽留热，扎堆，有明显结膜炎，部分猪拉黄绿色稀便，病猪在耳部、颌下、颈部、腹部、四肢等处出现淤血、出血斑点，个别猪死亡后从鼻孔、嘴角流出大量白色或血色泡沫，甚至有的直接流出血液。

病程约3~7天。

至10月底，群体死亡率69.8%。

3剖检变化分别对A 、B 两场4头死亡猪只进行病理解剖：尸体外表耳部、颌下、颈部、腹部、四肢等处出现淤血、出血斑点，其中一头气管和支气管充血，腔内充满白色或淡红色泡沫，肺门淋巴结水肿，特征性变化为脾脏稍肿大、有出血性梗死，肾脏表面及肾盂内有大量针尖大小出血点，肠系膜、腹股沟淋巴结切面成大理石样出血斑纹，膀胱、喉头会厌软骨内点状出血，回盲口有扣状溃疡。

胃底黏膜有片状出血，大小肠各部多见充血、出血。

心耳、心冠多有出血点或斑，1个病例心内膜有出血斑。

A 场剖检典型病变见图1—图4，B 场剖检典型病变见图5—图8。

图1A 场脾脏出血性梗死图8B 场肺脏表面出血斑图7B 场会厌软骨出血图6B 场肾脏土黄色、表面有出血点图5B 场脾脏出血性梗死图4A 场会厌软骨出血图3A 场肠系膜淋巴结大理石样出血图2A 场肾脏表面有出血点2019养猪SWINE PRODUCTION (2)98表1猪瘟抗体液相阻断ELISA （爱德仕）检测结果统计序号样品编号OD 值阻断率/%结果判定序号样品编号OD 值阻断率/%结果判定1保育-1 1.322314.71－13断奶-10.684355.86＋2保育-20.114792.61＋14断奶-20.629759.38＋3保育-3 1.208422.06－15断奶-30.33578.39＋4保育-4 1.367511.80－16断奶-40.619360.06＋5保育-5 1.4486 6.57－17断奶-50.331778.61＋6保育-60.662957.25＋18断奶-60.083694.61＋7保育-70.589561.98＋19断奶-70.536565.40＋8保育-8 1.239520.05－20断奶-80.08994.26＋均值35.88离散度26.059病保-90.93239.89可疑10病保-10 1.020434.19可疑11病保-110.794148.78＋12病保-120.898842.03＋均值38.19均值73.32离散度 4.18离散度13.1510.1105阴性对照1 1.5302阳性对照0.1119阴性均值 1.5504阳性均值20.11332 1.57065结论由表1液相阻断ELISA 检测数据可见，保育猪假定健康群血清样品阴性率为62.5%（5/8），症状明显猪只样品却没有阴性样品，且数据离散度降低至4.18%，应为抗体阴性猪受猪瘟野毒感染抗体逐渐上升，抗体阳性猪受野毒感染中和，抗体水平降低从而拉低了群体检测数据的离散度。

结合现场流行病学调查、病理解剖及实验室血清学、病原学检测结果判断上述两场猪群发生死亡的主要原因为猪瘟病毒感染。

同时注射过猪瘟E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗母猪所产的30日龄断奶仔猪检测数据体现了良好的母源抗体水平和整齐度。

6处理措施（1）A 场2018年8月中旬经对保育、肥育猪进行现场临床解剖诊断后，立即采用猪瘟E2蛋白灭活疫苗对母猪普免1次；同时加强了断奶仔猪30日龄猪瘟（ST 传代细胞源）活苗首免工作的管理和监督，并对肥育猪紧急接种猪瘟（ST 传代细胞源）活苗1次，剂量为3头份/头，但直至9月底保育及肥育阶段的发病情况依然没有明显改观。

结合9月底B 场发病及实验室诊断情况，兽医技术人员建议，10月份开始母猪采用猪瘟E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗产前45天跟胎免疫，剂量为2毫升/头；且自10月2日起将30日龄仔猪猪瘟初免疫苗也调整为猪瘟E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗，并对所有肥育早期（120日龄以内）猪只普免猪瘟E2蛋白灭活疫苗1次，剂量均为2毫升/头。

自10月20日以后，保育及肥育猪群恢复稳定，再未出现批量死亡。

（2）B 场猪群9月底经现场和实验室诊断后，采用猪瘟（脾淋源）活疫苗进行了紧急接种，剂量为4头份/头，病情没有得到有效控制，至10月下旬总死亡率达69.8%。

7讨论（1）猪瘟C 株活疫苗被誉为控制猪瘟的“金标准”疫苗，能诱导针对不同强毒株和各种基因群的免疫保护[9]，临床保护率可达100%[10]。

但笔者在长达表2猪瘟抗体间接ELISA （北京世纪元亨）检测结果统计样品编号类别OD 值检测结果备注均值离散度/%判定标准保育1保育猪（假定健康）0.6840-0.597632.73阳性>0.851；0.851≥可疑样品≥0.709；阴性<0.709保育2 1.1890＋保育30.2400-保育40.7380可疑保育50.1370-病保9保育猪（症状明显）0.2360-0.781566.23病保100.4410-病保11 2.1060＋病保120.343-韩永刚，等.猪瘟E2蛋白重组杆状病毒灭活疫苗在非典型猪瘟病例中的控制效果2019第2期992019养猪SWINE PRODUCTION(2)10余年的20余次重大动物疫病春、秋季强制免疫病种抗体水平监测和50余个规模养殖场日常商业送检过程中，均有一定比例的免疫个体抗体阴性样品检出。