环肽合成的试验研究

环肽合成的试验研究
2O06年第3期(总第32期张莉.等:环肽合成的试验研究
5月15日出版
环肽合成的试验研究
张莉李竞成李聚源高利华
(1.西安石油大学化学化工学院,陕西西安710065;2.万向集团汽车研究中心,浙江杭州310023)
摘要:采用Fmoc固相合成法得到直链肽,通过空气氧化两个半胱氨酸的巯基生成二硫键,得到一
类新型含二硫键的环肽.该环肽经ESI—MS鉴定,RP—HPLC纯化,分析后确定. 关键词:环肽;固相化学合成;二硫键;环化
中图分类号:0629文献标识码:A文章编号:1009—315X(2O06)03—0047—03
鉴于环肽的诸多优点_1],环肽的合成已成
为近几年来的研究热点.杂环肽的氨基酸(包括
非蛋白氨基酸)残基之间存在的非酰胺键主要
是酯键和二硫键_4].酯键的形成与酰胺键的形
成类似,而二硫键的形成则与酰胺键的形成相差
较大.在环肽合成中,Cys的巯基非常活泼,容
易产生副反应,多肽分子中的某些残基也易被氧
化或修饰.因此在考虑半胱氨酸残基侧链巯基保
护基的选择以及反应溶液浓度,反应时间的基础
上,还需要选择合适的氧化剂及氧化方式.本文
在合成直链肽的基础上通过温和的氧化剂(空
气)氧化两个半胱氨酸的巯基生成二硫键,得到
一
类新型含二硫键的环十四肽.
1实验部分
1.1仪器及药品
RP—HPLC分析中采用美国Waters一600E高
效液相色谱仪(150min×4.6mm),490E多功能
紫外检测器.ESI—MS使用BrukerEsquire3000离
子阱质谱仪测定,正离子模式.Wang树脂(取
代值为1mn~l/g),a—Fmoe(芴甲氧羰基)一氨
基酸,侧链保护基Cys(三苯甲基(Tn)),Lys
(叔丁氧羰基(aoe)),Asp(叔丁基(tau)),His
(Tn),Tyr(tBu)以及N,N一二甲基甲酰胺(DMF),二氯甲烷(cH2cl2),苯甲酰氯(Benzoylchloride),嘧啶(Pyridine),4一二甲氨
基吡啶(DMAP),苯骈三氮唑类缩合剂(TB—rITU),N,N'一二环己基碳二亚胺(DCC)和1
一
羟基苯并三唑(HOBT),二异丙基乙胺
(D皿A),均购自上海吉尔生化有限公司.
1.2色谱条件
梯度洗脱的缓冲液为A(0.1%三氟乙酸水
溶液)和B(0.1%三氟乙酸乙腈溶液),二者分
配的比例为:B从10%按线性梯度增至9o%,流
速为1.5mL/min,时间为60rnin;检测波长为
214nm;进样量为20.
1.3Fmoc固相法
合成H2N—Phe—Cys—Lys—Gly—Gly—Asp
—-
Pro—-Phe—-His—-Cys—-Met—-Tyr—-Asp—-V al—- COOH过程如下:
(1)C末端氨基酸与树脂结合.将溶于适量
DMF溶液中的Fmoe—V al—OH(3.401g)和
DMAP(0.1287g)与DCC(1.03g)分别加入事
先溶于DMF的树脂中,35～40℃恒温摇床中反
应3h后过滤,依次用cHsOH,DMF洗涤,之后
再加入cH2cl2,Benzoylchloride和Pyridine的混合
液(质量比为3:1.5:1),反应2h后过滤,依次
用CH2Cl2,乙丙醇,DMF洗涤.
(2)脱除氨基保护基(Fmoe一).Fmoc—V al
—
resin1.0g以二氯甲烷浸泡5min以上使之充
分溶胀,洗涤,抽干.加入50%嘧啶的二氯甲
烷溶液8mL,反应5min,抽干.再以同样的量
处理一次,反应20min,抽干.取少许树脂进行
茚三酮法检测,若溶液呈紫色,说明Fmoc一基
团没有完全出去,需重复此步骤直到完全脱出.
收稿日期:2OO5—10—20.
作者简介:张莉(1979一),女,陕西歧山人,西安石油大学化学化工学院硕士研究生.研究方向:工业催化及
生物化学.
47?
大连民族学院
JOURNALOFDALIANNANJ肛IESUNIVERSITY
(3)固相上的接肽反应.在盛有上述树脂的
反应器中加入0.70g预先活化的Fmoe—Asp(ot—
Bu)一OH的DCM溶液(若不溶,以少量的DMF
助溶,以下相同),以及0.55gTBTU的DCM溶
液,1.75mLHOBT的DCM溶液,0.30mI_DIEA
的DCM溶液.35～4ocI=恒温拖床中反应1～3h.
抽干,洗涤.同样取少量树脂进行茚三酮检验,
若反应液呈紫色,表明反应已基本完全,则进行
下一步反应.
(4)重复脱保护和接肽反应.取下一种氨基
酸,进行下一步接肽反应.反应逐步进行,最终
形成所需的多肽序列.
(5)侧链脱保护及多肽链脱离树脂(次程序
适合于0.1～1.5g肽树脂切割).所需试剂按一
定比例混合后,冰浴5rain加入树脂肽中,室温
下搅拌反应3h.过滤,用离心机沉降离心,最
后得粗肽产品若干.
1.4合成样品的纯化及分析
根据质谱确定粗品中含有目标肽后进行
HPLC纯化.取冻干品68lIIg溶解,0.45tan滤膜
过滤,收集滤液,HPLC分离纯化.根据副产物
分子量的变化及与目标肽比较相对保留时间,同时收集其他的结构信息,证实纯化后的目标肽. 1.5二硫键的合成
实验采用空气氧化法形成二硫键,从而达到直
链肽的环化.准确称取30rag纯化后样品溶于蒸馏水,加入约3IIlg活性炭,用1MNI-I3?I-hO调溶液, pH值8.0～8.5,恒温避光磁力搅拌反应48h,使其在反应中保持pH值不变,最终得成品4.4IIlg.
2结果与讨论
2.1粗品十四肽的质谱确认
合成十四肽粗产物质谱图如图1所示,样品
中主成分的m/z值为1618.4,与十四肽理论分子量1619基本相符,则样品中的主成分为目标十
四肽,其他成分为副产物.几个含量较高的副产
物的存在,说明在合成十四肽时某些不利的因素
明显干扰了多肽的正常合成.分析多肽合成过
程,洗涤树脂时采用抽气过滤的方式可能是造成
副产物产生的主要原因,因此在合成多肽序列中
有易氧化氨基酸残基存在时,应注意采取防氧化
措施,如采用惰性气体抽滤和避光操作等.
48?
May,2006
图1合成十四肽粗产物质谮图
2.2纯品质谱分析
取少量纯化后的样品进行质谱测定,样品中
的m/z值为1618.4,从而可以确定纯化样品为目
标十四肽(图略).
2.3纯化后的样品HPLC纯度分析
将所收目标样品溶解最大浓度,做纯品分
析.纯化后直链十四肽的分析谱图如图2所示,
可见,经过HPLC纯化后几乎除去了所有杂质,
样品的纯度显着提高,得到的目标产物含量达
9r7.6552%,出峰时间22.465(见表1).
逞
出
脚
图2环化后直链十四肽的分析谱图
表1纯化后直链十四肽分析数据
峰号保鲥间半峰宽分离度'拖尾因子不对黻
20o6年第3期(总第32期张莉.等:环肽合成的试验研究5月15日出版
2.4环化后质谱分析结果
环化后十四肽的质谱图如图3所示,得到的
分子离子峰为:809.5×2—2=1617.0,理论计算
值为1617.35,则样品为目标环十四肽.
图3环化后十四肽的质谱图
2.5Eellman检测
半胱氨酸可与5,5一二硫基一双(2一硝基
苯甲酸)(DTMB)发生硫醇一二硫化物交换反应,因此可用Eellman检测环化后一SH反应的完全程度.称取40mgIYI~B溶于1OM0.1mol/L磷酸钠缓冲溶液中(pH=8).取出一定量的样品
分成两份并稀释,同时加入缓冲溶液使环肽保持0.1～0.2tanol,加IYI~B试剂0.1mL到环肽溶液中,反应15min,最后在分光光度计412nm波
长下进行吸光度测定(见表2).(环十四肽m=
4.4mg,MW=1617,n=2.72*10一mol,M=2.
72×10/5×10一=1.81×10M)根据公式
[SH]=[A410(S)一A410(r)]/13650计算,
结果为O.00001.从[SH]的计算结果可以看出, 36h环化效果较好,一SH基几乎完全被氧化成R—S—S—R.
表2EeUman检测数据
3结论
从Fmoc—V al—OH氨基酸出发,经C端开
始逐步合成直链肽,最后经空气氧化得二硫键形成环肽,收到较理想产率.此合成方法原料易
得,总产率高,简便可行.主要表现在:(1)
Fmoe固相合成法以Fmoc为保护氨基,叔丁基型保护基为保护侧链,Wang树脂作为固相载体,
这样可一步完成脱除全部侧链保护基,并使脱除
反应具有较高的选择性.(2)以TBTU为肽的缩
合试剂能较好的防止外消旋化,且缩合效率高.
多肽合成中二硫键的形成一直是多肽合成中
的一个难点,目前尚无一种即简便又满意的方
法.本次实验用空气氧化法形成分子内的二硫
键,取得了较满意的效果.
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ZHANGLiLIJing一LIJu—yuanGAOLi—hua
(1.CollegeofChemistryandChemicalEflrleng,Xi'allShivouUniversity,Xi'allShanxi7100 65,China;
2.AutoResearchCenter,WanxiangGroup,Hal~ouzhejieng310(E3,China)
Abstract:Anoveldisulfidebond—
bearingeyelopepfideshasbeendesignedandsynthesizedbyIneaJ1sofair0)【ida- tionofbis(S—Acm)whichwassynthesizedthroughFmocsolid—phasesynthesis.Thereactionproductsweresep- aratedandidentifiedbyfuP—HPLCandMSspectra.
Keywords:eyelopeptide;solid—phasechemicalsynthesis;disulfidebond;cyclizafion(Or 任编辑邹永红)
49?。