Cas9培训技术讲座-2014-09-18
CRISPR-Cas 9靶向基因操作技术
3 靶向：对特定目标(分子、细胞、个体等)采取的行动。如外源基因在宿主 细胞基因组DNA预期位置上的定向插入；药物分子对效应靶组织或细胞的定 向传送或作用 。
CRISPR-Cas系统的发现
1 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸 进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。
Cas 9
TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9 蛋白(分子质量很大的多功 能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA 或是外源质粒。
Cas9 蛋白包含两个功能结构域，一个在N端，有类似于Ruc 核酸酶的活性， 一个在中部有类似HNH 核酸酶的活性。
嗜热性链球菌具有典型的TypeⅡ CRISPR/Cas 系统，它的CRISPR/Cas 系 统编码tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指导RNaseⅢ和Cas9 完成前体 crRNA 的成熟。随后tracrRNA 还能与成熟的crRNA 的重复序列配对形成 RNA 二聚体，进而和Cas9 蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解 入侵的外源DNA 功能[36]．
Cas9才会对DNA进行剪切。
2、可实现对靶基因多个位点同时敲除。
3、实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。
Lecture-CRISPR -Cas9
Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23.
张锋 Zhang Feng
1983年生于中国，幼年时随家庭移民到美国艾奥瓦州，在此长大。 美国神经生物学家，现任麻省理工学院助理教授。 2004年，在哈佛大学取得化学及物理学士。 2009年，在斯坦福大学取得化学及生物工程博士。 2013年，他的实验室发展出CRISPR/Cas系统，可以用来编辑DNA，敲除指定的基因。 2014年，被《自然》杂志评选为2013年年度十大科学人物之一。
terminators
The nucleotide sequence of P. aeruginosa PAO1 rsmB. Research in Microbiology 156 (2005) 7–16
The nucleotide sequence of P. aeruginosa PAO1 rsmZ. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 2004, 2936–2945
N NNNNNGAGCAAAAGTCTCN NNNNN NNNNN NCTCTGTTTCAGAGNNNNN N
BsmAI …… TGATAGAGATACTG AGCACgagcaaaagtctcg ttttagagctaGAAAtagcaagtt…… …………………………CTCGTG gctctgtttcagagCAAAA tctcgat……………………
1. First and foremost, they should not be followed by a PAM.
2. Second, their global sequence similarity to the target sequence should be minimized, and guide sequences with genomic off-target loci that have fewer than three
crispr cas9工作原理
crispr cas9工作原理
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，其工作原理可以分为三个主要步骤：适应、切割和修复。
1. 适应：CRISPR-Cas系统最初通过识别和适应外源DNA的
序列来开始工作。
这一步骤发生在细菌或古细菌中，它们利用Cas蛋白和一段短的RNA序列来识别和保存外源DNA序列。
2. 切割：一旦适应完成，CRISPR-Cas系统可以进行基因编辑。
在这一步骤中，细菌通过产生一种叫做sgRNA (单导RNA)的RNA分子，该分子拥有与目标基因序列相匹配的部分。
sgRNA与Cas9蛋白结合形成复合物，这个复合物可以前往细
胞核。
sgRNA和Cas9复合物会识别和结合到目标基因的特定DNA
序列上。
一旦结合成功，Cas9蛋白便会发挥剪刀的作用，切
割目标DNA，并形成双链断裂。
3. 修复：当DNA双链断裂发生时，细胞会尝试修复这一伤口。
通常有两种修复机制：
- 非同源末端连接（NHEJ）：这是一种快速但不精确的DNA
修复机制。
在NHEJ中，细胞会直接连接断裂的DNA末端。
这种修复方式可能会导致插入缺失或碱基改变，从而导致基因功能的改变。
- 同源重组（HDR）：这是一种较慢但更精确的修复机制。
在
HDR中，细胞会利用一个同源的DNA模板来修复断裂的DNA。
这种修复方式可用于插入、删除或修改目标基因的具体部分。
通过CRISPR-Cas9技术，我们可以精确地切割和修改基因，进而研究和改变生物体的特性和功能。
这项技术在基因治疗、农业改良和生命科学研究等领域具有广泛的应用前景。
Cas9技术
CRISPR-Cas结构
CRISPR-Cas主要由两部分组成：
切割活性域
Cas
序列识别区域 CRISPR
Cas家族
• Cas（CRISPR associated）：
• 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与Folk酶功能类似，但是它并不需 要形成二聚体才能发挥作用。
• 新技术（ Cas9）
通过特异性RNA序列（gRNA for Cas9）,引导核酸内切（ endonuclease）在靶基因处切割，引起靶基因产生DSB（双链缺口） ，机体修复DSB的方式有两种:NHEJ，HDR。 NHEJ用于Cas9 KO项目，HDR用于Cas9-CKO,KI项目
Cas9与KI
基因打靶小鼠制作流程
2.5-3 mouth
设计
•打靶载体 •鉴定方案
ES打靶
• 药物筛选 • 中靶鉴定
注射
• 囊胚注射 • 胚胎移植Βιβλιοθήκη 繁育• 繁育 • 建系
鉴定
• 基因型鉴定 • 突变检测
胚胎冷冻
37-54 day
sgRNA筛 选
囊胚打靶测 试
注射
• 囊胚注射 • 胚胎移植
繁育
• 繁育 • 建系
鉴定
2.
缺点：
1. TALEN、Cas9等进行CKO/KI技术目前仍处于研发测试阶段，目前出 现阳性鼠的项目比例为5/25，故目前主推Cas9-CKO/KI可能出现项目 不能完成的风险。
基因敲除 Knock-out
基因敲除 Knock-out
通过sgRNA引导核酸内切酶Cas9在靶基因处产生DSB（双链缺口），机体以 NHEJ修复DSB损伤，修复会产生indel，从而使目的基因移码造成基因功能缺 失。
CRISPR-Cas9技术原理
CRISPR/Cas9概述技术原理：CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。
CRISPR/Cas系统的高效基因编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物。
此系统的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA)，足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。
作为一种RNA导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，它能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。
将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9 nuclease-null)融合，并表达适当的gRNA，即可靶定任何dsDNA 序列，而RNA 可连接到gRNA 的末端，不影响Cas9 的结合。
因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
CRISPR/Cas9技术特点：1）可实现对靶基因多个位点或多个基因同时敲除；2）可对基因进行定点修饰（Tag、GFP、RFP、点突、条件性敲除），效率高。
3）实验周期短，价格低；4）可应用于大、小鼠等，无物种限制。
CRISPR-Cas9文库技术原理及应用
CRISPR-Cas9文库技术原理及应用CRISPR-Cas9技术原理CRISPR-Cas9技术凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR-Cas9技术迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手，是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。
CRISPR-Cas9系统最初在大肠杆菌基因组中被发现，是细菌中抵抗外源病毒的免疫系统。
CRISPR-Cas9系统由两部分组成，一部分是用来识别靶基因组的，长度为20bp左右的sgRNA 序列，另外一部分是存在于CRISPR位点附近的双链DNA核酸酶——Cas9，能在sgRNA的引导下对靶位点进行切割，最终通过细胞内的非同源性末端连接机制（NHEJ）和同源重组修复机制（HDR）对形成断裂的DNA进行修复，从而形成基因的敲除和插入，最终实现基因的（定向）编辑。
与前两代技术相比，CRISPR-Cas9技术最大的突破是不仅可以对单个基因进行编辑，更重要的是可以同时对多个基因进行编辑，这也为全基因组筛选提供了有效的方法。
目前比较常见的文库类型包括：●CRISPR-Cas9 knock out文库●CRISPR panal文库●CRISPRa/i文库●psgRNA文库CRISPR-Cas9文库建库流程●靶位点确认及sgRNA文库设计●sgRNA文库芯片合成●sgRNA文库构建●QC验证文库质量●sgRNA文库慢病毒包装●感染稳定细胞株●药物筛选实验●细胞表型筛选●NGS测序验证功能基因CRISPR-Cas9文库应用方向1、药物靶点确定与验证CRISPR-Cas9筛选技术可以应用于药物靶点筛选中，通过大规模筛选技术，可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因，从而为疾病治疗提供相关数据。
SCIENCE发表文章[1]，研究人员利用CRISPR-Cas9文库筛选人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选，最终发现NF2、CUL3等4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。
CRISPRCas9ppt
CRISPR/Cas系统在植物上也取得了重 大突破
2013年8月8日, 《 Nature Biotechnology 》上 同时报道了在重要农作物水稻、小麦以及模 式植物拟南芥和本生烟中取得了多个基因的 成功定点敲除、插入等基因组定点编辑的操 作,首次证实CRISPR/Cas系统能够用于作物基 因组定点编辑, 该技术的突破有望加速重要农 作物水稻、小麦性状改良与分子定向育种。
CRISPR-Cas系统靶向要求
• 最主要的要求： • PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。
• Cas9蛋白来源于细菌，因此要让Cas9蛋白高
• 效地转运到哺乳动物细胞核内，需要在Cas9 蛋白的N端或是C端加上真核细胞的核定位 信号。从目前发表的论文来看，在Cas9蛋白 的C端添加核定位信号，似乎是提高Cas9蛋 白的核转运最有效的方法。
可以对任何后面紧随NGG(PAM)的20 bp的序列进行编辑; 能同时作用于多个靶位点。
更容易在实验室中得到推广和应用。
局限性
• 脱靶效应 • Cas9蛋白对于目标序列的切割不仅仅依靠
crRNA序列的匹配，在目标序列(protospacer) 附近必须存在PAM。 • CRISPR/Cas9系统所靶向的序列仅需十余个 碱基对精确配对，这可能会降低 CRISPR/Cas9系统切割的特异性。 • CRISPR/Cas9系统也面临着如何控制双链断 裂之后的非同源末端连接修复可能随机产 生细胞毒性的问题。
2005年，三个研究小组均发现CRISPR的间隔序列(spacer)与宿主菌的 染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传 物质入侵的免疫系统有关
2007年，Barrangou等首次发现并证明细菌可能利用CRSPR系统对抵 抗噬菌体入侵
CRISPR-Cas9系统原理应用及发展ppt课件
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1 CRISPR-Cas概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌 编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时， 发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA 片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的 两端还存在一段不太长的特有的序列。
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2 CRISPR-Cas系统的发现
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2 CRISPR-Cas系统的发现
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2 CRISPR-Cas系统的发现
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免 疫, 而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主 防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌 进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是 由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔 序列（spacer）来实现的。
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3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换
2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的 《RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems》一文中，作者利用CRISPR-Cas系 统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向 修饰。
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1.1 CRISPR结构
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1.2 Cas家族
Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在
guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似， 但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
CRISPR-Cas9基因敲除技术原理
CRISPR-Cas9基因敲除技术原理这是一篇针对实验室萌新写的关于CRISPR-Cas9技术的详细介绍，对于实验室老手也建议收藏转发给师弟师妹，这样省心省力，又能节省大量讲解时间，这不香么？原核生物的“免疫系统”人体有着一套复杂且高效的免疫系统，时刻保护着我们免受病毒和细菌的攻击。
但是，对于弱小又无助的原核细胞而言，它们也是急切需要被保护的。
为此，经过几亿年的进化，细菌和大部分古细菌衍生出了CRISPR-Cas系统，用于保护它们免受外源DNA和噬菌体的侵染。
到目前为止，科学家们发现50%的细菌和超过90%的古细菌均携带有CRISPR-Cas系统。
CRISPR是一段高度重复的DNA序列，两端重复序列之间存在着各不相同的spacer序列，表达Cas蛋白家族的基因簇位于CRISPR位点的上游，其表达翻译的几种类型的Cas蛋白作为原核生物免疫应答的效应器发挥着重要作用。
当细菌受到噬菌体的侵染时，被释放到细菌细胞质中的噬菌体基因组的某段DNA序列被识别并整合到CRISPR的spacer区域，随后转录出相应的crRNA前体（pre-crRNA）。
crRNA前体经过修饰和加工，生成向导RNA（guide-RNA）。
由于gRNA中存在一段来源于噬菌体基因组的序列，因此gRNA可以通过碱基的互补配对原则识别噬菌体的基因组。
同时存在于细胞质中的gRNA和Cas蛋白特异性结合，并靶向到噬菌体基因组参与DNA的切割与降解。
CRISPR-Cas9技术简单来讲，CRISPR-Cas9是一种分子生物学技术，通过这种技术科研人员可以对细胞和生物体内的基因进行编辑。
所谓的基因编辑就是通过某种生物手段和技术，对生物体内的遗传物质进行修改。
基于原核生物的获得性免疫系统研发出的CRISPR-Cas9技术只包含两种重要的成分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgRNA（single guide RNA）。
基因编辑技术的CRISPRCas9系统的使用方法与注意事项
基因编辑技术的CRISPRCas9系统的使用方法与注意事项基因编辑技术是一项革命性的技术，可以精确地修改生物体的基因组，对于研究基因功能、开发新药和治疗遗传病等方面具有重大意义。
其中，CRISPR-Cas9系统是最常用的基因编辑工具，它具有操作简单、效率高和成本低廉的优势。
本文将介绍CRISPR-Cas9系统的使用方法和注意事项。
使用方法：1. 设计gRNA序列：gRNA（guide RNA）是CRISPR-Cas9系统中用于识别和定位特定基因序列的RNA分子。
根据需要编辑的基因序列，设计合适的gRNA序列。
良好的gRNA设计可以提高编辑效率和特异性。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白：合成和纯化gRNA序列和Cas9蛋白，或购买商业化的CRISPR-Cas9试剂盒。
确保获得高质量的gRNA和稳定活性的Cas9蛋白。
3. 细胞培养和转染：根据实验需要，选择合适的细胞系进行培养。
将合成的gRNA和Cas9蛋白导入到目标细胞中，常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体介导的转染法。
4. 检测CRISPR-Cas9介导的基因编辑效果：在转染后的细胞中，通过DNA测序、聚合酶链反应（PCR）或荧光显微镜观察目标基因的编辑效果。
选择适当的检测方法进行检测。
注意事项：1. 设计合适的gRNA序列：良好的gRNA设计对于系统的特异性和编辑效率至关重要。
避免设计具有高度相似序列的gRNA，以减少非特异性切割的风险。
使用在线工具或软件来优化gRNA序列的设计，同时考虑基因组的特异性和可能的非特异性靶向。
2. 选择合适的细胞系：不同的细胞系对基因编辑的敏感性和编辑效率有所差异。
在进行实验之前，了解目标细胞系的特点，并选择合适的细胞系进行实验。
确保细胞系的完整性和纯度，以提高编辑效果的可靠性。
3. 优化转染条件：有效的转染是保证CRISPR-Cas9系统成功应用的重要步骤。
优化转染条件，以确保gRNA和Cas9蛋白在细胞内能够有效导入并发挥作用。
CRISPR-Cas9-基因编辑技术简介ppt课件
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2.CRISPR/Cas系统结构
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
Cas9蛋白不具特异性 CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10-
12bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
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6.降低脱靶效应
Cas9切口酶
通过点突变的方 法，使Cas9只有 单链切割活性， 类似于切口酶
2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列 CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).
2013年之后，研究者们在《science 》和《nature》等国际著 名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、 小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。
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4.CRISPR/Cas9系统
酿脓链球菌
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4.CRISPR/Cas9系统
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4.CRISPR/Cas9系统
gRNA 在线设计工具：
CRISPR Design Tool: / E-CRISPR: ZiFiT: / Cas9 Design: http://cas9 /index.jsp Cas-OFFinder: /cas-offinder/ CCTop: http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/
CRISPRCas9系统工作原理
一、简介
• 2、简介：
• 人工核酸酶的原理是一样的，都是由DNA结合蛋白与核酸 内切酶融合而成。 • 2013年初，一种全新的人工核酸内切酶 CRISPR/Cas9 • 它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特 点是制作简单、成本低、作用高效。
一、简介
• CRISPR • 全名：clustered regularly interspaced short palindromic repeats 即 成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复 序列的位点，这种位点在细菌和古细菌胞内起到了一种获得性免疫（ acquired immunity）的作用。 • CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA进行序列特异 性降解。 • 目前已经发现了3种 CRISPR/Cas系统， TypeI，TypeII，TypeⅢ3 ， 其中TypeII系统是目前改造最为成功的人工核酸酶，因为其只需一个 Cas9蛋白就能够发挥CRISPR系统的免疫作用
谢谢
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• 噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为 protospacer，通常protospacer的5'或是3'端延伸几 个碱基序列很保守，被称为PAM，它的长度一般为 2～5碱基，一般与protospacer相隔1～4碱基。
二、作用过程
• CRIPSR基因座的表达与crRNA 的成熟 • CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPR
三、应用与前景
• CRISPR/Cas系统作为一种新型的基因组定点修饰技术， 它的出现大大推动了对基因功能的研究。但作为一种新兴 的技术，它的基础理论研究还远远不够，很多分子机制尚 不明确，技术也不够成熟。尽管现在还存在诸如如何将构 建的系统成功导入人体内、脱靶现象以及切割特异性略低 于TALEN等问题，但是相信在不久的将来一定可以找出解 决的方案。总之，CRISPR-Cas系统研究时间虽短，但发 展迅猛，以后一定会有更广泛的应用。
CRISPRCas9技术(高中生物教材解惑训练)
CRISPR/Cas9技术（高中生物教材解惑训练）1．CRISPR/Cas9技术敲除掉部分基因原理(1)CRISPR/Cas9是细菌的一种后天免疫防御机制——CRISPR序列示意图如下(其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列)，其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。
(2)病毒或外源质粒上存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。
“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM(原间隔序列临近基序)。
(3)当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。
这就是“间隔序列”产生的过程。
(4)当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。
同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。
CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA 和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA 的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。
这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。
2．CRISPR/Cas9技术的运用和发展(1)具体运用如下图所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA(指导RNA)，将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。
对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。
(2)CRISPR/Cas9基因魔剪：当研究人员要用基因魔剪来编辑一个基因组时，他们会人工构建一个指导RNA，它与将要被切割的DNA代码相匹配。
cas9技术实验流程
Cas9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程一、CRISPR/cas9技术简介及原理2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。
CRISPR/Cas9是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。
CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。
在这一系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。
CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑，目前已经成功应用于大小鼠基因的KO/KI模型制备。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。
融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。
通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作二、Cas9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程1、设计识别靶位点的一对DNA Oligos选择PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。
(PAM，Protospacer adjacent motifs 原间隔序列临近基序。
一般形式为NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的DNA 序列中)原则：选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。
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基因打靶(Gene Targeting)
基因打靶是利用同源重组原理改变细胞或生物体内源 性基因的遗传学技术
【Gene targeting is a genetic technique that uses homologous recombination to change an endogenous gene.
/life-science/functional-genomics-and-rnai/zinc-finger-nuclease-technology/learning-center/what-is-zfn.html
ZFN：zinc-finger nuclease Doyon et al, 2008. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. NATURE BIOTECHNOLOGY published online 25 May 2008; doi:10.1038/nbt1409
Figure 1: Each Zinc Finger Nuclease (ZFN) consists of two functional domains: a.) A DNA-binding domain comprised of a chain of two-finger modules, each recognizing a unique hexamer (6 bp) sequence of DNA. Twofinger modules are stitched together to form a Zinc Finger Protein, each with specificity of ≥ 24 bp. b.) A DNA cleaving domain comprised of the nuclease domain of Fok I. When the DNA-binding and DNA-cleaving domains are fused together, a highly-specific pair of 'genomic scissors' are created.
/wiki/Gene_targeting
】
特点（基因修饰精确、遗传背景清晰干净）： 1、删除基因 2、去除外显子 3、定点插入一个基因（Knock in） 4、引入点突变 5、就制作删除基因或外显子而言，可实现永久性(conventional, 全身性)或条件性（ conditional, 组织或时空）特异性的基因敲除
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Winners of 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine
Mario Renato Capecchi
Martin John Evans
Oliver Smithies
传统的基因打靶（Gene Targeting）的技术瓶 颈
1、需要胚胎干细胞 只有小鼠上能建立胚胎干细胞 大鼠的胚胎干细胞虽有报道，但没有后续的工作 2、极低的同源重组率 干细胞同源重组发生率较高，但也只有百万分之 一
Non-homologous end joining (NHEJ)
NHEJ (coined in 1996 by Moore and Haber) is referred to as "non-homologous" because the break ends are directly ligated without the need for a homologous template. It is a error-prone repair. NHEJ typically utilizes short homologous DNA sequences called microhomologies to guide repair. These microhomologies are often present in single-stranded overhangs on the ends of DSB. When the overhangs are perfectly compatible, NHEJ usually repairs the break accurately. Imprecise repair leading to loss of nucleotides can also occur, but is much more common when the overhangs are not compatible.
Methods to Create DSB nearby the Target Gene
(Restriction enzyme: an enzyme that cuts DNA at specific recognition nucleotide sequences known as restriction sites. )
（conditional KO）
敲降
（RNAi）
2002年Science十大科学进展之首
基因敲除 (Gene Knockout)
基因敲除 :将生物体（或细胞）中的基因改变成无功能性基因（无效等位基因：null allele）的一种遗传学技术 【A gene knockout (KO) is a genetic technique in which one of an organism‘s genes is made inoperative. /wiki/Gene_knockout 】
ES Cells – Species Limitation
Germline transmission
• Mouse ES Cells（inner cell mass） rat ？ • PGCs（primordial germ cell） • iPS （induced pluripotent cells）
CRISPR/Cas9: 生物体和细胞基因组编辑的革命性 技术
南京尧顺禹生物科技有限公司
2014年4月3日
基因功能的研究
功能获得（过多） （gain of function)
过表达
功能缺失（过少） （loss of function)
敲除 敲降
（overexpression) （knock out）
Genome Editing Using ZFN Technology What Is ZFN Technology ? Zinc finger nucleases (ZFNs) are a class of engineered DNA-binding proteins that facilitate targeted editing of the genome by creating double-strand breaks in DNA at user-specified locations.
Gene targeting depends on DSB sites spontaneous occurring in target genes. Increasing DSB sites definitely improve the efficiency of gene targeting or gene knockout.
Inappropriate NHEJ can lead to translocations and telomere fusion, hallmarks of tumor cells.
/wiki/Non-homologous_end_joining
The NHEJ and HR Occurring nearby the DSB sites
Double-strand Breaks and Repair
Double-strand breaks (DSBs), in which both strands in the double helix are severed, are particularly hazardous to the cell because they can lead to genome rearrangements. Three mechanisms exist to repair DSBs: 1) non-homologous end joining (NHEJ) 2) microhomology-mediated end joining (MMEJ), 3) homologous recombination (HR)
全身性过表达
（knock down）
RNA干扰
（RNAi）
(ubiquitous transgenic)
全身性敲除
（conventional KO）
组织特异性过表达
(tissue specific transgenic)
基因位点特异性过表达
（knock in）
MO敲降
赖于胚胎干细胞的传统的基因打靶
百万分之一的同源 重组率；打靶载体 含正负筛选标记。
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通过将基因敲除的个体或细胞与正常的个体或细胞相比较， 研究者可以揭示特定基因的功能。 基因敲除技术特点：在基因组水平上将目标基因修改成无 效等位基因，遗传背景干净清晰，是研究基因功能的金标 准。 敲降（RNAi 或MO KD）的缺点： 1、仅部分抑制该基因的功能； 2、在转录后（包括翻译）水平上下调基因表达，不能遗传 3、非特异性强；脱靶效率高
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