t-DNA插入突变体检测

2.2.3.6.点样完成后，加上110v电压，跑胶大约30-40分钟，直到DNA大概跑到凝胶的三分之二处；
2.2.3.7.取出凝胶，放入EB（溴乙锭，强突变剂，剧毒慎碰）染液中染色10-15分钟；
2.2.3.8.之后放入凝胶成像仪中，观察DNA跑胶的情况。
3.结果
3.1.第一次
TPS法提取44号样品DNA，以DL2000为Marker。
DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应线状DNA分子分离范围不同。（如下图）
本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA插入突变纯和体。
PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本原理如右图）
4.2.实验分析
4.2.1.加液氮碾磨叶片时，最好保持离心管中始终有液体氮存在，如果碾磨一段时间后中途要加液氮继续碾磨，一定注意，液氮沸腾时极易将已经碾磨好的叶片吹走；另一点，碾磨时要迅速，避免空气中的水汽在离心管上凝结。
4.2.2.DNA有一定的物理脆性，所以在提取过程中混匀时一定要缓慢的摇晃，切忌剧烈震荡。
图1
从上图这个结果看，完全看不到特异性的DNA带，全都是非特异性的小带，长度甚至小于Marker DL2000最短的带（100bp），无法判断所测样品的纯合与否。
3.2.第二次
CTAB发提取44号样品DNA，以Lambda DNA/EcoRI+为Marker。
图2
与第一次相比，有显著的提升。此次用的DNA Marker为Lambda DNA/EcoRI+，每条带所对应DNA片段的大小已在图中标注。在Lp、Rp的引物下扩增，电泳可得到长度约1100 DNA大带，Bp、Rp引物扩增，电泳可得到800~900小带，故可以确定该样品（44号）为杂合突变体。
2.2.3.2.将加热溶解的琼脂糖凝胶稍冷却，大约到50℃，将所得溶液移入琼脂糖槽中，使之冷却成型；
2.2.3.3.将冷却凝固的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入TAE电极缓冲缓，直到液体稍浸没凝胶；
2.2.3.4.向所得的25ul PC体系中加入5ul 6×loading buffer，轻摇混匀；
2.2.3.5.以此向点样空中滴加样品，marker DNA滴加约6.5ul，其他的样品，每个点样空滴加20ul；
1.引言
Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。若将Ti质粒进行改造，把感兴趣的基因放进T-DNA序列中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
2.2.2.PCR步骤
2.2.2.1.配置反应体系：主要包括DNA模板，引物，反应缓冲液，dNTP，ddH2O，耐热聚合酶。
2.2.2.2.25ul体系：ddH2O 16ul，缓冲溶液2.5ul，镁离子2ul，dNTP 0.5ul，引物1ul，DNA模板2ul，taq酶0.2ul。
2.2.2.3.配好体系，轻摇混匀，4000rpm离心10秒钟。
3.3.第三次
CTAB法提取44号样品DNA（同第二次），以BenchTop 100bp DNA Ladder为Marker。
图3
此次的结果与第二次所得结果基本相同，也可以得到同3.2的结论。
4.分析
4.1.结果分析
4.1.1.在图1所示实验结果，是不成功的：所有DNA模板的扩增结果都显示只有非特异性小带，完全没有特异性带的痕迹；初步分析原因有两个，一个是由于PCR扩增体系没有混合均匀，所加试剂附在离心管的内壁上；另一原因考虑到DNA的物理脆性，我们在电泳前，加上样缓冲液（6×Loading Buffer）之后，为了混匀，我们用了电动震荡仪，由于震荡剧烈，可能将DNA特异性带震碎。
t-DNA插入突变体的鉴定
实验时间：2012年5月18日
摘要Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。本实验即检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。
4.1.2.图2所示结果整体效果不错，但是DNA Marker选择不是很好，能够指示目标带的Marker都挤在一起，而且1500bp以上的Marker很多，对于本实验没有指示作用。
4.1.3.图3所示结果，从DNA Marker的选取上，比图2要合适：各长度的Marker分布比较均匀，目标长度差不多在所有指示长度的中间；从DNA跑胶距离看，也比较好： 100bp左右的非特异性带接近凝胶边缘但没有跑出，而且目标带所在位置在1/2到2/3处，适合观察。
2.2.1.4.向上清液中加入2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 ℃ 下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清。
2.2.1.5.用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。
2.2.1.6.将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 min溶解DNA。
2.2.实验步骤
2.2.1.CTAB法提取DNA
2.2.1.1.用液氮100mg幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻摇混匀。
2.2.1.2.65℃水浴30min，其间轻摇混匀。
2.2.1.3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清液入新管。
4.2.3.DNA模板中蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应；模板降解会导致PCR扩增无产物；模板加量过多也会导致非特异性扩增增加。引物的长度要适当、避免二级结构和二聚体；避免反复冻融；浓度适当,过高导致非特异性增加,过低则无扩增产物。Mg2+浓度过高，非特异性增强，过低无扩增产物。
4.2.4.PCR中所需2.2.4.设定反应程序：
1)预变性：94℃，5min；
2)循环部分：变性解旋94℃，40sec；退火53℃，50sec；延伸72℃，80sec，循环35次；
3)延伸部分：72℃，10min；
4)保存：4℃下可以保存1-2天 。
2.2.3.琼脂糖凝胶电泳
2.2.3.1.配置40ml1.6%的琼脂糖凝胶：称取0.640g的琼脂糖放入锥型瓶中，加入40mlTAE加热使其溶解，注意不要使其暴沸；
2.实验材料
2.1.试验材料
待检测拟南芥植株；
液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24:1），无水乙醇，70%的乙醇，TE；
引物（Lp、Rp、Bp），反应缓冲液，dNTP，ddH2O，耐热聚合酶；
琼脂糖，TAE缓冲溶
离心机，恒温槽，PCR仪，电泳仪，电子天平，冰块；
离心管（0.2ml、0.5ml），移液枪等必要的实验器材。
4.2.5.电泳电压的确定一般是按照5V/cm来确定，此次实验中所有电泳槽长约20cm，计算的电压为100V，但是根据第一次实验结果看，30min、100V电压的电泳，DNA跑胶距离不够，所以为了提高实验速度，在DNA承受范围内，将电压提高到110V。
4.2.6.再次强调EB（溴乙锭）是一种荧光染料，能嵌入到双链核酸碱基对平面之间，250～310 nm波长的紫外光激发下发出橙红色光，常用于检测核酸分子。因此它也是一种强诱变剂，有致癌作用。染色时一定做好防护。