实验室常用几种细胞实验的实验步骤和细胞荧光染色方法小结

4 关于细胞冻存
a 10%的DMSO、40%胎牛血清、50%培养 基 b 4℃,40分钟;-20 ℃,30分钟;-80 ℃ ,24h 后液氮罐保存 c 如果冻存细胞多要先把冻存液配好放四 度冰箱(因为DMSO放热，刚加进去和容易损伤细胞，
常温DMSO对细胞毒性也大。)
d 冻存的原则是慢冻快苏
关于荧光染色
不建议使用酒精，此步骤以前各步在保证无菌操作情况 下可避免染菌
10 将剪断的骨髓，用5ml的注射器吸取无血 清培养基反复冲洗骨髓腔。收集骨髓悬液 的培养基。 11 在50ml离心管内加入Ficoll人淋巴细胞分 离液，将细胞悬液小心的铺在分离液上层
注意：在操作此步骤时，要戴好手套，口罩，在Ficoll液面上铺细胞 时眼睛要与页面平齐
注意：一般本步消化时间为10分钟左右， Ⅱ型胶原酶的温度保证在 37℃左右消化能力最好。特别提醒的是在消化过程中要用手来回揉搓 脐带外壁，有助于内皮细胞的脱落，此细节至关重要，决定了实验成 败
此细节至关重要
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6 终止消化，将静脉内含有EC细胞的消化液 注入含有小牛血清的离心液里终止消化， 两者比例为1:1，并用离心液冲洗静脉血 管两次，并将收集的细胞悬液装入离心管， 封口 7 离心，将离心管放入离心机，设定离心速 度和时间。一般1200r/min,8分钟。 8 待离心机完全停稳后，打开，取出离心管。 小心取放，避免震动幅度过大，倒去上清 液，将贴壁细胞用新鲜的培养基全液吹打 垂悬，放入细胞培养瓶（一般5ml/瓶）
细胞如果低密度长期培养，容易出现老化， 分化
6 剥离血管外膜，小心用一眼科直镊夹住血 管一端，用另一把弯镊轻轻向下牵拉血管 外壁，直到明显可见一层状组织与内层组 织分离。此时应夹紧该层组织，迅速向下 剥离。
注意：此步骤最为关键，直接决定细胞组织的增殖活力
7 将剩下的血管组织再次转移到另一孔内， 孔内加入少许NS.,用弯镊夹住血管一端轻 轻地套在眼科剪前端，渐次将组织依次剪 开，用一灭菌脱脂棉轻轻擦拭血管内壁， 除去血管内皮细胞
实验步骤 1 细胞取出固定2h后，也可4℃保存多日后 一起染色 2 将孔板内固定液（2.5%戊二醛或者4%多 聚甲醛）吸出，用PBS清洗3次，每次5分钟 3 用triton脱细胞液（ 0.1%浓度）包被样 品5分钟，目的是增加细胞通透性，后用 PBS清洗3次
4 BSA 封闭液封闭（具体看抗体的种属来选 择包被液) 37℃ 4h ,也可以4℃过夜 5 Ⅰ抗 30um/well即可 ，37℃ 30分钟 6 取出样品清洗3次，每次5分钟，加一次封 闭30分钟 7 加荧光Ⅱ抗 （需避光） 30um/well 37℃ 30分钟 注意：此步骤不用清洗 8 上清液吸干 ，加DAPI（40ng/ml）浓度较 好 4分钟即可 清洗5次 9 荧光拍照
2 将实验过程中需要的用到的器械依次摆放在 酒精灯周围 3 取出脐带（5CM即可），放入半月盘内，用 灭菌后脱脂棉擦去脐带周围血迹
注意：个体差异性大，选取脐带时无明显水肿，淤血，无结节现象
4 观察脐带纵面，找到脐带内两根动脉，从 中间小心剪一豁口。用组织剪牵拉两部分， 直至分离出动脉血管。 5 将剖离的动脉转移到一干净的6孔板内,孔 内加入少许NS.
操作前进行医用酒精擦拭消毒，当脐带过短时，只要一端插入圆头针， 另一端用止血钳夹死。
4 用无菌NS.,将脐带静脉血管内的淤血冲洗 干净，直到冲出的NS.无色为止，接着将血 管内的空气抽空，两端固定。
5 将Ⅱ型胶原酶注入脐带静脉血管内，此步 骤操作时，注意两端的注射器要来回做活 塞运动以便使血管内壁与Ⅱ型胶原酶充分 接触，注入的Ⅱ型胶原酶比例为8ml/15cm。
7 用第三套器械，小心剥离老鼠的胫骨和股 骨
注意：此步骤很关键，在分离四肢股骨、胫骨时要格外 小心，最好用眼科剪，不可暴露骨髓腔
8 将股骨和胫骨转移到小培养皿内，里面倒 入少许NS.，用眼科剪和眼科镊将骨头周围 的肌肉组织剥离 9 将剥离后的股骨和胫骨转移到一新的培养 皿内，小心并迅速用大号组织剪剪断骨头 两端，暴露骨髓腔。
目前实验室常用几种细胞实验的实 验步骤和细胞荧光染色方法小结
几种细胞实验步骤
一 EC原代的培养
实验前准备
器械 消化酶 M199培养基 其他
大号止血钳10把， 肾形盘2个，圆 二型胶原酶 头不锈钢针头若 （1mg/ml） 干，细胞培养瓶 若干，50ml离心 胰酶 管若干，大号组 织剪2把，弯镊1 Try(2.5mg/ml) 把，弯头组织剪 1把，酒精棉球 若干,巴氏吸管若 干，胶头若干
胰酶 Try(2.5mg/ml)
FD-12培养原液 85ml FBS 15ml L-Glu 1ml浓度为 200mmol/L
细胞培养瓶
NS.
6孔板
SMC 细胞来源
采用方法：组织贴壁法
实验操作步骤
1 将灭菌后的实验物品按操作顺序摆放在超净 工作台内（超净工作台内事先UV灭菌）
注意：紫外灭菌时应关闭日光灯，送风机，人员要离开生化间，30分钟后 返回关闭紫外灯，打开日光灯，风机。5分钟后进行实验
3 将老鼠引颈处死，放入事先配好的医用酒 精内浸泡15分钟后，转移到超净室内。 4 用大号止血钳夹住鼠尾，用无菌NS.将大鼠 身上的酒精冲洗干净后，放入无菌半月盘 内，转移至超净台内。剪去鼠尾。 5 用第一套器械，小心剥离老鼠四肢表皮， 露出肌肉层。 6 用第二套器械，小心剥离老鼠四肢上的肌 肉层，露出股骨和胫骨
四 EPC的原代培养 方法同MSC，培养基内加 入VEGF诱导因子即可 五 SPC的原代培养 方法同上 ，培养基内加入 PDGF-BB诱导因子即可 六 外周血来源的EPC的培养同MSC的操作步 骤（11—17） 七 人脐带间充质干细胞的培养同SMC组织贴 壁法。去除动脉血管和静脉血管后组织贴 壁即可
8 将血管中层再次转移到一孔内,孔内加入少 许培养基，用眼科剪（直）将组织尽数剪 成1mm×1mm的小组织块
9 将剪好的组织块用一弯头吸管吸出来放进 细胞培养瓶内，小心将培养基吸出来，将 组织块轻轻地均匀的贴在细胞瓶底。 10 加入新鲜的培养基，小心不要将瓶底的组 织块冲刷掉。 11 将细胞培养瓶放入37℃,5%，CO2孵箱培养
9 37℃,5%，CO2孵箱培养，第二天换液，去 除未贴壁细胞，继续培养。待细胞几乎铺满 瓶底时传代约为3/4。
一 传 二
二 SMC的原代培养
实验前准备
器械 大号止血钳：2把 小号止血钳：2把 小号培养皿：2个 眼科剪（直）：2 把 眼科剪（弯）：2 把 眼科镊（直）：2 把 眼科镊（弯）：2 把 消化酶 FD-12培养基 其他
M199培养原液 离心液 85ml FBS 15ml L-Glu 1ml浓度为 细胞培养瓶 200mmol/L ECGS 1ml浓度为 15-20ng/ml NS.
人脐带纵剖面和直观图
实验操作步骤
1 将灭菌后的实验物品按操作顺序摆放在超净 工作台内（超净工作台内事先UV灭菌）
注意：紫外灭菌时应关闭日光灯，送风机，人员要离开生化间，20分钟后 返回关闭紫外灯，打开日光灯，风机。5分钟后进行实验
注 ：细胞染色有多重方法，本实验仅是抗-αactin染色实验。其他染色方法有很多相近 之处
本总结有许多不足之处，需要不断完善，制 定统一实验方法
• 做流式检测，一般阳性指标可以检测 CD73,29,105，阴性指标可以检测34,45等。 阳性 • 细胞活力取决于很多因素，例如大鼠的年 龄，体外分离的时间，是否有酒精的污染， 胎牛血清的浓度，换液技巧等。推荐用15 －20％FBS，头24小时后换液指标大于95%, 阴性指标小于5%,比较纯
八 细胞试验中注意的要点
1 关于传代问题 a try配置时PH=7.4时效果较好 b try使用时的温度 37度时效果较好，过低 不易消化，导致细胞死亡 c try消化后离心重新垂悬细胞活性高
d 细胞传代时要充分混匀
上图为传代时没有充分混匀导致细胞团聚严重
2 关于血清问题 a EC 培养时血清含量不要高于20%。否则 老化速度过快 b smc培养时原代血清含量控制在15%， 传代后控制10%左右，可有效控制其老化 速度 c 干细胞培养时同SMC， 在细胞旺盛期血 清含量可进一步下调至5%
注意：此时的细胞培养瓶是倒置的，第二天翻转培养瓶时才使得组 织块浸入培养基里
12 培养到第六天时可见组织块周围有细胞攀 爬出来，此后两天便可进行初次传代
三 MSC的原代培养
实验前准备
器械 大号止血钳：2把 小号止血钳：2把 小号培养皿：2个 大号组织剪：2把 眼科剪（直）：1 把 眼科镊（直）：2 把 消化酶 FD-12培养基 其他 SD 大鼠一只 胰酶 Try(2.5mg/ml) α- MEM培养原液 85ml FBS 15ml L-Glu 1ml浓度为 200mmol/L 细胞培养瓶
NS. 5ml注射器
培养方法
全骨髓培养法和密度梯度离心法
实验步骤
1
将灭菌后的实验物品按操作顺序摆放在超净工 作台内（超净工作台内事先UV灭菌）
注意：紫外灭菌时应关闭日光灯，送风机，人员要离开生 化间，30分钟后返回关闭紫外灯，打开日光灯，风机。5 分钟后进行实验
2 将实验过程中需要的用到的器械依次摆放在酒精 灯周围
2 打开NS. ，点燃酒精灯（不建议使用）， 将酒精棉铺开在操作台中央，方便将所有 器械和瓶盖的摆放。
3 将半月盘内倒入少许无菌NS.,取出新鲜脐带 轻轻放入半月盘内，用灭菌后的脱脂棉球 将脐带外周的血迹擦干，将脐带两端血迹 擦干以便暴露静脉血管。将圆头不锈钢针 头轻缓的插入两端静脉血管内，并顺势用 止血钳夹死固定。注意：本实验操作时要戴好橡胶手套，
12 小心封口离心管，离心机内离心，设定为 2000r/min, 30分钟 13 离心后 取出离心管，小心吸取离心管内中 间白色云雾层，用无血清培养基混匀后再 次离心，设定为1500r/min,10分钟