医学-植物细胞工程课件第三章细胞克隆与种子细胞筛选

EDTA溶液洗涤 用PBS配制1mmoll-1d EDTA ， 弃 去 原 代 培 养 的 培 养 液 ， 转 入 EDTA洗涤细胞，然后再用0.25%的胰蛋 白酶消化，次法用于贴壁性极强的细胞获 取。
原代培养 继代培养 单细胞克隆
3.3.1 原代培养primary culture
取材
培养
取材
组织解离 机械分离
• 解离一般是借助酶和鳌合剂处理组织，使 其成为分散的细胞。常用的酶有胰蛋白酶 和胶原酶，鳌合剂主要有EDTA-Na和柠檬 酸钠。
• 一般直接用镊子、解剖刀解剖组织、器官， 然后加以整理用于培养。
3.3.2 继代培养subculture
单层细胞培养 贴壁细胞再培养 悬浮培养 非贴壁细胞培养
从原代培养物中解离细胞：
震荡法 在培养瓶中加入平衡盐溶液，轻 轻震动培养瓶，可以使贴壁疏松的细胞进 入到溶液内，然后收集洗涤用于培养。
蛋白酶消化 用PBS配制0.01-0.5%的胰蛋 白 酶 消 化 液 ， 37℃ 处 理 5-15min. ， 然 后 洗涤用于培养。
动物细胞原代培养过程
培养方法
• 不同取材方法，原代细胞培养方式亦不 相同.
• 一般来讲，分离获得的材料多采用组织 块培养，而通过解离获得的细胞材料多 采用单层细胞培养和悬浮培养。
组织块培养
1. 将组织剪切成碎块 2. 用平衡盐溶液漂洗 3. 在解剖镜下切除脂肪、坏死组织等 4. 切成1mm3大小 5. 再漂洗2-3次 6. 转移到培养瓶内培养。
特点 直接切割分离的组织块，在一定程度 上保持了原有的组织结构，对于初期体外 培养的环境适应性比直接分离成单细胞要 强，因此，短期组织块培养成为动物细胞 培养的材料来源之一。
单层细胞培养
1. 将解离获得的细胞沉淀 2. 用培养液配制成需要的细胞悬液 3. 接种到培养瓶内 4. 水平放置，37℃下静止培养 5. 每隔1-2天换培养液一次 6. 培养一定时间后，细胞在培养瓶底即
3.2.2 平板培养
所谓平板培养（plating culture）是指将 一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体体培 养基中进行培养的技术。
1. 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不 能超过6个细胞，因此过滤时网筛的网眼要选择 合适。
2. 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗 涤2次以后，调整密度为5×105/ml。
3. 植板：将1份已调整好密度的但细胞悬浮液与4 份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀 的平铺与培养皿中，其厚度为5mm左右。
平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率 是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比 例。
3.2.3 看护培养
看 护 培 养 （ nurse culture ） 技 术 首 先 是 有 Muir等（1954）设计的，其操作方法是在固体培养 基上置入一块活跃生长的愈伤组织，再在愈伤组织 上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸 上。当培养细胞长出微小细胞团以后，将其直接转 至琼脂培养基上让其迅速生长。
3.2.5 其他改进培养技术
Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培养 技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法，该方法 是在培养皿中倒入琼脂培养基凝固后，先将饲养细胞 平铺在培养基上，然后在饲养细胞层上平展一张滤纸 形成看护层，再将滤纸制成的圆碟置于看护层上，然 后将培养细胞植于其中。
3.3 动物细胞克隆技术
基本方法与植物细胞的悬浮培养相似
在相应的培养容器内接种一定密度的细胞悬液。 接种密度与细胞倍增时间有关，倍增时间在2448h的细胞类型接种密度以105/ml细胞为宜， 倍 增 时 间 在 12-18h 的 细 胞 类 型 接 种 密 度 以 2×104/ml为宜。单个培养瓶的接种体积以厚度 不超过2cm为好。
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华
中
农 业
第三章
大
学 生
细胞克隆与种子细胞筛选命科学技术学
院
主要内容
细胞克隆的概念与意义 植物单细胞培养技术 动物细胞克隆技术 种子细胞筛选
3.1 细胞克隆的概念与意义
细胞系 细胞克隆
细胞株
直接从机体取材的细胞、组织或器官所做的 原代培养，进行传代培养后形成的一群生物 学 特 征 不 均 一 的 细 胞 便 称 为 细 胞 系 (cell line ) 。
形成一单细胞层。
特点 • 更换培养基容易 • 便于观察不同条件对细胞生长的影响 • 培养后期容易使用灌注技术改善营养条件 • 细胞贴附于基底质上，更容易表达产物 • 单层细胞培养可适用于许多动物细胞的原
代培养。
悬浮细胞培养
适用细胞 具有非贴壁特性的细胞，如血 细胞、腹水细胞等，或者通过机械搅拌和 振荡能够较好地维持悬浮状态的细胞。
3.2.4 微室培养
微室培养（micro-chamber culture）是为进 行单细胞活体连续观察而建立的单细胞培养技术， 运用这种技术可对单细胞的生长与分化、细胞分裂 的全过程、胞质环流的规律等进行活体连续观察。 这一方法同样也可用于原生质体培养，用于观察细 胞壁的再生与细胞分裂过程。微室培养是细胞学研 究的优良实验体系。微室培养首先是由Jones等在 1960年设计的。
• 有限细胞系（Finite Cell Line） • 无限细胞系（Infinite Cell Line）
一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁 殖而来。
分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方 法成为细胞的克隆化（cloning）。
从原代培养物或细胞系中分离单个细胞进 行培养，形成均一的细胞群，这群细胞具有 一定的生物学特性和遗传标记，并在继代培 养中仍能保持其特性和标记，这群细胞就称 为细胞株(cell strain)。
3.2 植物单细胞培养技术
愈伤组织诱导 平板培养 看护培养 微室培养
其他改进培养技术
3.2.1 愈伤组织诱导
诱导获得的愈伤组织可以用镊子或小刀分割 得到植物小细胞团，也可以将愈伤组织转移到培 养基中，加入经过杀菌处理的玻璃珠，进行振荡 培养，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞， 然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大细胞 团和残渣，得到一定体积的小细胞团或单细胞悬 浮液。