蛙类斯氏离体心脏灌流

姓名*** 系年级********* 学号***********科目动物生理学实验同组者***、*** 日期***********蛙类斯氏离体心脏灌流【实验目的】1. 学习斯氏离体蛙心灌流法；2. 了解心肌的生理特性；3. 观察Na+、K+、Ca2+离子等对离体心脏活动的影响。

【实验原理】心肌具有自动节律性（autorhythmicity）收缩的特性，可以用人工灌流的方法，研究心脏活动的规律及特点；还可以观察灌流液成分的改变对离体心脏活动的影响。

【实验材料】1.材料：蟾蜍。

2.器具：常用手术器械，解剖盘，蛙板（木质），毁髓针，玻璃分针，手术剪，手术镊，铁钉，蛙心套管，套管夹，双凹夹，滑轮，蛙心夹，支架，双针形露丝刺激电极，滴管，小烧杯，棉线，张力传感器，生理信号采集系统。

3.试剂：任氏液，5％NaCl溶液，1％KCl溶液，2％CaCl2溶液。

【实验步骤】1. 暴露动物心脏取一只蟾蜍，双毁髓后背位置于蛙板上，一手持手术镊提起胸骨后方的皮肤，另一只手持手术剪剪开一个小口，然后将剪刀由开口处伸向皮下，向左、右两侧下颌角方向剪开皮肤。

将皮肤掀向头端，再用手术镊提起胸骨后方的腹肌，在腹肌上剪一口，将金冠剪紧贴体壁向前伸入（勿伤及心脏和血管），并沿皮肤切口方向剪开体壁，剪断左右乌喙骨和锁骨，使创口呈一倒三角形。

一手持眼科镊，提起心包膜，另一手用眼科剪剪开心包膜，暴露心脏。

2. 斯氏蛙心插管仔细识别心脏周围的大血管。

在左主动脉下方穿一线，并打一活结备用。

左手提起主动脉上的结扎线，右手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉壁上剪一斜口。

选择大小适宜的蛙心套管，然后将成盛有少量（套管内2~3cm高度）任氏液（内含葡萄糖）的斯氏蛙心套管，由开口处插入动脉圆锥。

当套管尖端到达动脉圆锥基部时，应将套管稍稍后退，使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进，经主动脉瓣插入心室腔内（于心室收缩时插入，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管口）。

此时可见血液冲入套管，并使液面随心脏搏动而上下移动，表明操作成功（否则需退回并重新插入）。

用滴管吸取套管中的血液，更换新鲜任氏液。

稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管用双线紧紧扎紧（不得漏夜），再将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上方的血管。

轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏的联系，使心脏离体。

（切勿损伤静脉窦）。

用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血液。

保持套管内液面高度一致（1.5~2cm），即可进行实验。

图1 斯氏蛙心插管法3. 连接实验装置将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部的肌肉（不可夹得过多，以免因夹破心室而漏液）。

在将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连。

注意：勿使灌流液滴到传感器上。

打开生理信号采集系统，接通张力传感器输入通道。

调节系线的拉力，使心脏的收缩活动在显示屏上出现。

调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。

调整扫描速度，使心搏曲线的幅度与宽度适中。

图2 实验装置示意图4. 实验观察（1）记录正常心搏曲线。

（2）向套管内滴加2-3滴5％NaCl溶液，做好加药记号，观察心搏曲线的频率及振幅变化当曲线出现明显变化时，应立即吸去套管中的灌流液，并做好冲洗标记，迅速用新鲜任氏液清洗，待心搏恢复正常。

（3）同法向套管内加入1-3滴2％CaCl2溶液，观察并记录心搏曲线的变化。

当出现明显变化时，立即更换任氏液，待心搏恢复正常（如果恢复迟缓，可多次冲洗）。

（4）向套管中加入1-2滴1％KCl溶液，记录心搏曲线的变化。

【实验结果及分析】背景知识：心肌细胞动作电位和主要离子活动（以心室肌细胞为例）。

心室肌细胞的动作电位由除极化过程和复极化过程所组成，共分为五个时期：图3 心室肌细胞动作电位和主要离子活动1. 除极化过程（0期）：当心肌细胞接受一个阈上刺激时，膜内电位由静息状态时的-90mV 去极化并反极化到+20mV~+30mV，构成动作电位的上升相，称为0期。

历时仅1~2ms。

其正电位部分称为超射。

形成机制：当心室肌细胞受到刺激产生兴奋时，首先引起Na+离子通道（快Na+通道）的部分开放和少量Na+离子内流，膜局部去极化。

当去极化到阈电位水平（-65mV）时，大大增加膜上Na+离子通道开放的数量，出现再生性Na+离子内流，使膜进一步去极化，最终使膜内外电位发生反转，趋近于Na+离子的平衡电位。

2. 复极化过程：当心室肌细胞去极化达到顶峰后，开始复极化过程。

根据膜电位变化曲线的形状及其形成的离子机制不同，可将其可分为4个时期：（1）快速复极化初期（1期）：膜电位由+30mV迅速下降至0mV左右，历时约10ms。

与0期去极化组成了锋电位。

形成机制：Na+离子通道失活，Na+离子内流停止。

同时K+离子通道被激活后形成K+离子瞬时外流，引起膜电位初期的快速复极化。

（2）平台期（2期）：表现为膜电位变化较小，电位接近于0mV水平，持续100~150ms。

此期为心室肌细胞区别于神经或骨骼细胞动作电位的主要特征。

形成机制：在早期平台期，Ca2+离子的内流和K+离子的外流所负载的跨膜电荷量几乎等，膜电位稳定于1期复极化所达到的零电位水平。

随后，慢钙通道逐渐失活，而K+离子外流逐渐增加，出膜的正电荷量逐渐增加，结果膜内电位逐渐下降，形成晚期平台期。

（3）快速复极化末期（3期）：继平台期之后，细胞膜复极化速度加快，膜内电位由0mV 逐渐下降到-90mV的静息电位水平。

历时100~150ms。

形成机制：外向K+离子流逐渐增强，超过内流的Ca2+离子。

（4）静息期（4期）：膜复极化完毕，膜电位恢复并稳定在-90mV的静息电位水平。

形成机制：由于此期膜内、外各种正离子浓度的相对比例尚未恢复，细胞膜的离子转运机制加强，通过Na+- K+泵的活动和Na+- Ca2+交换作用，将内流的Na+离子和Ca2+离子排出膜外，将外流的K+离子转运入膜内，使细胞内外离子分布恢复到静息状态水平，从而保持心肌细胞正常的兴奋性。

实验结果：1. 正常心搏曲线图4 蟾蜍离体心脏正常心搏曲线2. 5％NaCl溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响实验结果：滴加5％NaCl溶液，蟾蜍离体心脏收缩力显著减弱，洗去NaCl溶液，蟾蜍心脏收缩力逐渐恢复正常。

图5 5％NaCl溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响结果分析：心肌细胞的收缩对细胞外Ca2+的浓度有很高的依赖性。

在任氏液中滴加NaCl溶液，Na+与Ca2+内流的竞争性抑制导致Ca2+内流减少，心肌的收缩活动也随之减弱。

3. 2％CaCl2溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响实验结果：滴加2％CaCl2溶液，蟾蜍离体心脏收缩力显著增强，洗去CaCl2溶液，蟾蜍心脏收缩力逐渐恢复正常。

图6 2％CaCl2溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响结果分析：向任氏液中滴加CaCl2溶液，细胞外Ca2+浓度上升，内流增加，肌质网Ca2+的储存量和释放量增加，心肌收缩力增强。

当肌浆中的Ca2+浓度不断升高，Ca2+与肌钙蛋白结合数量不断增加，甚至达到只结合不解离的程度，心肌将会处于持续收缩状态，称为“钙僵”。

4. 1％KCl溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响实验结果：滴加1％KCl溶液，蟾蜍离体心脏收缩力显著减弱，洗去NaCl溶液，蟾蜍心脏收缩力逐渐恢复正常。

洗涤过程中动作过于剧烈，对心搏曲线造成了影响图7 1％KCl溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响结果分析：向任氏液中滴加KCl溶液，细胞外K+离子浓度升高，而K+与Ca2+有竞争性拮抗作用，K+可抑制细胞膜对Ca2+的转运，使进人细胞的Ca2+减少，心肌的“兴奋--收缩耦联”过程减弱，心肌收缩力降低。

细胞外K+浓度较高时，膜内外K+浓度梯度减小，静息电位的绝对值减小，Na+通道失活，心肌的兴奋性丧失，心肌不能兴奋和收缩，停止于舒张状态，此时，仅由Ca2+来构成动作电位，钙通道激活慢，去极化上升幅度小而缓慢，因此兴奋传导性降低。

【思考题选作】1. 本实验说明心肌的哪些生理特性？答：（1）自动节律性；（2）兴奋性；（3）传导性；（4）收缩性。

2. 用本实验说明内环境相对恒定的重要意义。

答：多细胞动物机体内，全部细胞的新陈代谢，都必须通过内环境才能进行。

内环境中各种理化因素维持在相对恒定的状态，即使外坏境有强烈的变化，机体的内环境仍可以保持相对恒定。

当内环境的相对恒定被破坏时，机体的生命过程就会遭到损坏，包括心脏的节律性跳动，等。

3. 试分析任氏液中适量的钠、钙与钾离子对心肌的作用。

答：略。

4. 为何强调实验中保持灌流液面的恒定？灌流量对心肌活动有什么影响？答：保持灌流液面恒定，是为了保证对心脏的压力保持恒定，否则，不能说明心搏曲线的变化是由药物引起还是由压力的变化引起。

灌流量大，对心肌的压力大，心脏所承受的负荷大，心肌活动能力会略微减弱；反之，心肌活动能力会略有加强。

【注意事项】1. 暴露心脏的过程中要小心，不要将血管剪断；2. 用棉线结扎血管时要扎紧，避免漏液；3. 插管时，不要插得过深，以免心室壁堵住套管口；4. 将左、右主动脉连同插入的套管用双线紧紧扎紧，避免漏夜，再将结线固定在套管的小玻璃钩上，避免脱落；5. 于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏的联系，使心脏离体时，切勿损伤静脉窦。

6. 用蛙心夹夹心尖部肌肉时要小心，不要损坏心肌组织；7. 向套管内加药和更换任氏液时，动作不要太剧烈，以免对心搏曲线造成大的影响；8. 在实验过程中，要不断用任氏液湿润心肌组织，避免干燥。

参考文献[1]解景田，刘燕强，崔庚寅.蛙类斯氏或八木氏离体心脏灌流.生理学实验，79-83[2]王玢，左明雪.心脏生理.人体及动物生理学（第3版）.高等教育出版社，209-213。