蛙类斯氏离体心脏灌流

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科目动物生理学实验同组者***、*** 日期***********

蛙类斯氏离体心脏灌流

【实验目的】

1. 学习斯氏离体蛙心灌流法；

2. 了解心肌的生理特性；

3. 观察Na+、K+、Ca2+离子等对离体心脏活动的影响。

【实验原理】

心肌具有自动节律性（autorhythmicity）收缩的特性，可以用人工灌流的方法，研究心脏活动的规律及特点；还可以观察灌流液成分的改变对离体心脏活动的影响。

【实验材料】

1.材料：蟾蜍。

2.器具：常用手术器械，解剖盘，蛙板（木质），毁髓针，玻璃分针，手术剪，手术镊，

铁钉，蛙心套管，套管夹，双凹夹，滑轮，蛙心夹，支架，双针形露丝刺激电极，滴管，小烧杯，棉线，张力传感器，生理信号采集系统。

3.试剂：任氏液，5％NaCl溶液，1％KCl溶液，2％CaCl2溶液。

【实验步骤】

1. 暴露动物心脏

取一只蟾蜍，双毁髓后背位置于蛙板上，一手持手术镊提起胸骨后方的皮肤，另一只手持手术剪剪开一个小口，然后将剪刀由开口处伸向皮下，向左、右两侧下颌角方向剪开皮肤。将皮肤掀向头端，再用手术镊提起胸骨后方的腹肌，在腹肌上剪一口，将金冠剪紧贴体壁向前伸入（勿伤及心脏和血管），并沿皮肤切口方向剪开体壁，剪断左右乌喙骨和锁骨，使创口呈一倒三角形。一手持眼科镊，提起心包膜，另一手用眼科剪剪开心包膜，暴露心脏。2. 斯氏蛙心插管

仔细识别心脏周围的大血管。在左主动脉下方穿一线，并打一活结备用。左手提起主动脉上的结扎线，右手用眼科剪在结扎线下方、沿向心方向将动脉壁上剪一斜口。选择大小适宜的蛙心套管，然后将成盛有少量（套管内2~3cm高度）任氏液（内含葡萄糖）的斯氏蛙心套管，由开口处插入动脉圆锥。当套管尖端到达动脉圆锥基部时，应将套管稍稍后退，使尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进，经主动脉瓣插入心室腔内（于心室收缩时插入，但不可插得过深，以免心室壁堵住套管口）。此时可见血液冲入套管，并使液面随心脏搏动而上下移动，表明操作成功（否则需退回并重新插入）。用滴管吸取套管中的血液，更换新鲜任氏液。稳定住套管后，轻轻提起备用线，将左、右主动脉连同插入的套管用双线紧

紧扎紧（不得漏夜），再将结线固定在套管的小玻璃钩上，然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏，看清静脉窦的位置，于静脉窦下方剪断有牵连的组织，仅保留静脉窦与心脏的联系，使心脏离体。（切勿损伤静脉窦）。用任氏液反复冲洗心室内余血，使套管内灌流液不再有残留血液。保持套管内液面高度一致（1.5~2cm），即可进行实验。

图1 斯氏蛙心插管法

3. 连接实验装置

将插好离体心脏的套管固定在支架上，用蛙心夹夹住少许心尖部的肌肉（不可夹得过多，以免因夹破心室而漏液）。在将蛙心夹上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连。注意：勿使灌流液滴到传感器上。打开生理信号采集系统，接通张力传感器输入通道。调节系线的拉力，使心脏的收缩活动在显示屏上出现。调节显示器上心脏收缩曲线的幅度适中。调整扫描速度，使心搏曲线的幅度与宽度适中。

图2 实验装置示意图

4. 实验观察

（1）记录正常心搏曲线。

（2）向套管内滴加2-3滴5％NaCl溶液，做好加药记号，观察心搏曲线的频率及振幅变化当曲线出现明显变化时，应立即吸去套管中的灌流液，并做好冲洗标记，迅速用新鲜任氏液清洗，待心搏恢复正常。

（3）同法向套管内加入1-3滴2％CaCl2溶液，观察并记录心搏曲线的变化。当出现明显变化时，立即更换任氏液，待心搏恢复正常（如果恢复迟缓，可多次冲洗）。

（4）向套管中加入1-2滴1％KCl溶液，记录心搏曲线的变化。

【实验结果及分析】

背景知识：心肌细胞动作电位和主要离子活动（以心室肌细胞为例）。

心室肌细胞的动作电位由除极化过程和复极化过程所组成，共分为五个时期：

图3 心室肌细胞动作电位和主要离子活动

1. 除极化过程（0期）：当心肌细胞接受一个阈上刺激时，膜内电位由静息状态时的-90mV 去极化并反极化到+20mV~+30mV，构成动作电位的上升相，称为0期。历时仅1~2ms。其正电位部分称为超射。

形成机制：当心室肌细胞受到刺激产生兴奋时，首先引起Na+离子通道（快Na+通道）的部分开放和少量Na+离子内流，膜局部去极化。当去极化到阈电位水平（-65mV）时，大大增加膜上Na+离子通道开放的数量，出现再生性Na+离子内流，使膜进一步去极化，最终使膜内外电位发生反转，趋近于Na+离子的平衡电位。

2. 复极化过程：当心室肌细胞去极化达到顶峰后，开始复极化过程。根据膜电位变化曲线的形状及其形成的离子机制不同，可将其可分为4个时期：

（1）快速复极化初期（1期）：膜电位由+30mV迅速下降至0mV左右，历时约10ms。与0期去极化组成了锋电位。

形成机制：Na+离子通道失活，Na+离子内流停止。同时K+离子通道被激活后形成K+离子瞬时外流，引起膜电位初期的快速复极化。

（2）平台期（2期）：表现为膜电位变化较小，电位接近于0mV水平，持续100~150ms。此期为心室肌细胞区别于神经或骨骼细胞动作电位的主要特征。

形成机制：在早期平台期，Ca2+离子的内流和K+离子的外流所负载的跨膜电荷量几乎等，膜

电位稳定于1期复极化所达到的零电位水平。随后，慢钙通道逐渐失活，而K+离子外流逐渐增加，出膜的正电荷量逐渐增加，结果膜内电位逐渐下降，形成晚期平台期。

（3）快速复极化末期（3期）：继平台期之后，细胞膜复极化速度加快，膜内电位由0mV 逐渐下降到-90mV的静息电位水平。历时100~150ms。

形成机制：外向K+离子流逐渐增强，超过内流的Ca2+离子。

（4）静息期（4期）：膜复极化完毕，膜电位恢复并稳定在-90mV的静息电位水平。

形成机制：由于此期膜内、外各种正离子浓度的相对比例尚未恢复，细胞膜的离子转运机制加强，通过Na+- K+泵的活动和Na+- Ca2+交换作用，将内流的Na+离子和Ca2+离子排出膜外，将外流的K+离子转运入膜内，使细胞内外离子分布恢复到静息状态水平，从而保持心肌细胞正常的兴奋性。

实验结果：

1. 正常心搏曲线

图4 蟾蜍离体心脏正常心搏曲线

2. 5％NaCl溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响

实验结果：滴加5％NaCl溶液，蟾蜍离体心脏收缩力显著减弱，洗去NaCl溶液，蟾蜍心脏收缩力逐渐恢复正常。

图5 5％NaCl溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响

结果分析：心肌细胞的收缩对细胞外Ca2+的浓度有很高的依赖性。在任氏液中滴加NaCl溶液，Na+与Ca2+内流的竞争性抑制导致Ca2+内流减少，心肌的收缩活动也随之减弱。

3. 2％CaCl2溶液对蟾蜍离体心脏活动的影响

实验结果：滴加2％CaCl2溶液，蟾蜍离体心脏收缩力显著增强，洗去CaCl2溶液，蟾蜍心脏收缩力逐渐恢复正常。