利用枯草芽孢杆菌发酵生产糖化酶的上游工艺研究

合集下载

糖化酶的研究进展

糖化酶的研究进展摘要：糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类,介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。

关键词: 糖化酶; 特性; 活力一、糖化酶的简介糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。

本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。

50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。

糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称[Glucoamylase,(EC.3.2.1.3.)](缩写GA或G), 糖化酶是一种习惯上的名称,学名为α-1,4-葡萄糖水解酶(α-1,4-Glucanglucohydrolace).糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。

（深层发酵是利用深层培养基的厌氧环境来培养厌氧细菌，但不能培养严格厌氧细菌,多用于兼性厌氧菌和微耗氧菌的培养）重要糖化酶生产菌有：雪白根霉，德氏根霉，河内根霉，爪哇根霉，台湾根霉，臭曲霉，黑曲霉等。

糖化酶是具有外切酶活性的胞外酶。

其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。

对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。

糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。

二、糖化酶的结构组成及分类糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。

不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。

枯草芽孢杆菌酶在发酵工艺上的应用

枯草芽孢杆菌酶在发酵工艺上的应用王伟王上俞志敏丛丽娜*（大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034）摘要：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今工业酶的主要生产菌种之一，由于其产酶量高、种类多、安全性好、环保等优点在现代发酵工业生产中被广泛应用，其发酵生产的酶在工业、医学、食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸、水产养殖等领域均发挥着十分重要的作用。

关键词：枯草芽孢杆菌；发酵；酶B. subtilis enzyme used in the fermentation processWANG Wei WANG Shang YU Zhi-Min CONG Li-Na*(School of Biological Engineering,Dalian polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034, China) Abstract:Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) is one of today's major producing strain of industrial enzymes,enzyme production because of its high volume,variety,safety, environmental protection,etc.are widely used in modern industrial production fermentation,fermentation enzymes produced in the fields of industry,medicine,food, feed,wash,textile,leather,paper,aquaculture and other have played a very important role. Keywords:Bacillus subtilis; fermentation; Enzyme长期以来，枯草芽孢杆菌一直是工业微生物的主力军之一，它的使用可追溯到一千多年前，早在日本平安时代（794～1192年）日本人就已经利用枯草芽孢杆菌在大豆中采用固态发酵的方法生产他们的传统食品——纳豆，开创了利用枯草芽孢杆菌的历史[1]。

糖化酶的制备工艺流程

糖化酶的制备工艺流程
糖化酶的制备工艺流程主要包括以下几个步骤：
1.菌株活体及扩大培养：
（1）制备PDA培养基使用去皮马铃薯、蔗糖和琼脂等成分，煮沸后过滤，加入其他成分定容，然后灭菌。

（2）接种：将黑曲霉菌种接种到PDA培养基上，在28摄氏度下培养3天。

2.摇瓶发酵培养：
（1）制备发酵培养基：使用玉米粉、米糠、麸皮等成分，加水搅拌均匀后装于锥形瓶中，灭菌。

（2）接种与产酶培养：将黑曲霉平板上的菌种打孔接种到锥形瓶中，在28摄氏度下培养96小时。

3.离心：
将培养好的黑曲霉发酵液通过4层纱布过滤后离心，以除菌体，得到上清液，即糖化酶粗酶液。

4.酶提取：
（1）通过采用离心、过滤、超声波及加料等方式进行酶的分离和提取。

（2）酶的稳定性也是关键问题，需要考虑加适量的抗氧化剂和保护剂，以防止酶的讲解个损失。

产木聚糖酶枯草芽孢杆菌构建及表达条件优化

而枯草芽孢杆菌W B 600在木聚糖培养基上同步培养
图 1 基因 .t>7iZF-2 的 P C R 扩增注：M : D L 1 0 0 0 D N A M a r k e r ; 1，2: P C R 扩增得到的叮 n Z F - 2 Figure 1 PCR amplification of^jnZF~2 gene Note: M : D L 1 0 0 0 D N A M a r k e r ; 1,2: x yn Z ¥ ~ 2 amplified b y P C R
238 基因组学与应用生物学
也越来越多，更多的木聚糖酶基因在不同的宿主中
M
1
2
得到表达(陈洪洋等，2016)。
10 000 bp 5 000 bp
枯草芽孢杆菌(B a c 山是一种模式生物， 3 000 bp
2 000 bp
其遗传背景清晰，具有很强的分泌能力，能够高效表 1 500 bp
对重组菌进行筛选和酶活力鉴定，再
图 2 pWB980质粒与 w ^Z F -2基因双酶切注：M : D L 1 0 0 0 0 D N A M a r k e r ; 1: 质粒 p W B 9 8 0 ; 2 : 基因巧TiZF-2 Figure 2 Double digestion o f pWB980 vector and ,r>7iZF-2 gene Note: M: D L10000 DNA Marker; 1: Plasmid pWB980; 2: Gene xynZ¥-2
1.2重组工程菌筛选
接种量为 1 % 时，工程菌酶活力达到最大，接种

草芽孢杆菌的液体发酵及其产物中糖化酶的实验之欧阳歌谷创编

本科学生综合性实验报告
欧阳歌谷（2021.02.01）
学号姓名
学院专业、班级
实验课程名称枯草芽孢杆菌的液体发酵及其产物中糖
化酶的活性测定
教师及职称
开课学期 2013至2014学年下学期
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案
MBS 菌株：在畜禽养殖中使用益生菌不仅可避免长期使用抗生素所引起的肠道微生态平衡被破坏、产生耐药性及药物残留等问题 ,还能提高动物的生产性能和免疫力。

枯草芽孢杆菌能改善肠道微生态环境 ,促进动物生长和提高抗病力 ,而且分泌各种消化酶类 (如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等 ) ,促进养分的消化、吸收 ,更重要的是枯草芽孢杆菌在不利环境条件下能形成芽孢 ,在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持较高活性。

因此 ,枯草芽孢杆菌比其他有益微生物有着更多的优点而得到广泛的研究和应用。

实验流程：
装置示意图：
1．实验设备及材料设备：
小型发酵罐的构造小型发酵罐是实验室进行小规模试验研究的必备装置，如上图所示为小型发酵罐、主要由罐体、通气系统、搅拌系统、加
蒸汽管空气灭菌装料
通
入蒸
汽对
物料
加热排空冷空气
冷却、接通风比和
控制参数
按要求进
行培养。

镜检
空气附属设备蒸
汽
蒸汽蒸汽蒸气附属设备
下游处理
二．实验报告。

中药发酵研究进展

中药发酵研究进展在现代中药发酵炮制中，研究人员逐渐开始利用现代研究成果，定向改变药物的性能，或根据药物之间的特性有目的进行组合，利用单一菌种，或用混合菌种定向发酵。

如五倍子的发酵炮制，是采用含有根霉菌和L-赖氨酸等物质的酵曲发酵五倍子，通过发酵，克服了鞣酸在肠道内与食物中的蛋白质结合的缺点，显著提高五倍子的收敛作用[7]。

中药发酵主要有液体深层发酵和固体发酵两种，其中中药的现代发酵工艺一般仍采用固体发酵炮制，且在整个发酵过程中力求准确地控制发酵菌种的种类和数量，同时对温度、湿度、酸碱度、通气等工艺因素进行动态控制，提高发酵品质量。

现代中药发酵工艺基本包含了生物发酵工程的全部环节，包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵、产品的分离、提纯等过程[8]。

二、发酵对中药活性成分的影响在中药发酵过程中，由于微生物的生长代谢和生命活动具有强大分解转化物质的能力，并能产生多种次生代谢产物，可以比一般的物理或化学手段更大幅度地改变药性，产生新的化学成分或活性更强的先导化合物。

发酵过程能完成一些化学合成难以进行的反应，主要涉及羟基化、环氧化、脱氢、氢化、水解、水合、酯基转移、酯化、胺化、脱水、异构化、芳构化等化学反应[9]。

发酵对中药活性成分的影响，可以从 4 个方面概括其途径[5]：①微生物在生长过程中产生生物活性物质，包括多种酶、抗生素等。

如米曲霉在生长过程中产生数种蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、酰胺酶、酯化酶、淀粉酶和糖化酶等，酵母在发酵时可产生蔗糖酶、淀粉酶、酒化酶、脂肪酶等。

这些酶类可以催化中药成分的分解，或转化成其他成分，如中药淡豆豉，经过发酵过程，其苷类成分发生了变化，转化为游离的苷元，具有更强的生理活性。

②微生物的次生代谢过程中产生活性化合物。

③中药所含的某些成分可以改变微生物的代谢途径，形成新的成分或改变各成分的相互比例。

④微生物的代谢可以将中药中的有效成分转化成新的化合物，同时微生物的次生代谢产物和中药中的成分发生反应，也能产生新的化合物。

枯草芽孢杆菌液态发酵的研究

枯草芽孢杆菌液态发酵的研究李情敏;何名芳;张凤英;张超凤;陈卫平【摘要】该研究选取了一株从无花果中分离出的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为试验菌株,它可以产生抗逆性强的芽孢,非常适合应用于益生菌饲料加工生产.在单因素试验基础上,进行L9(33)正交试验,获得芽孢产量高、原料成本低廉的液态发酵培养基最佳配方为碎米水解液6％、酵母粉0.7％、KH2PO40.5％;对该菌的摇瓶发酵条件进行了初步研究,确定了液态发酵的最佳条件为pH值为5,温度37℃,接种量6％,转速200 r/mm,培养时间19h.在此最佳培养基配方及发酵条件下,发酵液OD600mm值可达7.38.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2016(035)002【总页数】5页(P43-47)【关键词】枯草芽孢杆菌;液态发酵;培养基配方;培养条件;优化【作者】李情敏;何名芳;张凤英;张超凤;陈卫平【作者单位】江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;赣州农业学校食品教研组,江西赣州341100;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045【正文语种】中文【中图分类】TQ920.6益生菌的生理功能有很多，最重要的是可以促进肠道有益微生物的繁殖，降低病原菌数量，提高机体免疫的功能［1］。

益生菌制剂以无毒、无残留、无副作用、不污染环境等优点，使其成为了有效的抗生素替代物，在防治动植物疾病，促进机体发育，延缓人类衰老等方面被人们广泛使用［2］，并成为生态循环农业中的一个重要纽带。

由于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可形成抗逆性极强的芽孢，在稳定性方面具有先天优势，且枯草芽孢杆菌是我国农业部和美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）允许作为饲料添加剂的菌种［3-4］，其可以产生抑菌活性物质［5-6］，也可以作为一种理想的抗生素替代物。

糖化酶的生产流程设计方案

糖化酶的生产流程设计方案(共6页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--糖化酶的生产流程设计方案糖化酶即葡萄糖淀粉酶(1 ,4 - α- 葡聚糖葡聚糖水解酶, EC. 3. 2. 1. 3) ,是淀粉糖化工艺的主要酶类,被广泛地应用于食品、医药、发酵等工业。

目前,糖化酶的生产菌种主要为黑曲霉。

根据使用的生产菌种不同及发酵工艺不同,工业生产中,糖化酶的发酵生产水平在35 000～55 000UPmL 不等。

糖化酶的工业化生产从过去的固体发酵沿革到上世纪90 年代初,液体发酵工艺逐步取代了原固体发酵工艺。

液体发酵工艺的建立与应用极大地改善了发酵产品质量并大幅度提升了糖化酶的发酵生产水平。

但现有糖化酶发酵生产技术共同存在不足之处,其中种子制备周期和发酵生产周期很长是一个较突出的问题,如实验室的种子制备需要15d 以上,发酵周期通常200h 以上。

生产流程图一、试验菌种的分纯1、培养基（1）固体培养基，察氏培养基+1％酵母膏+1％蛋白胨；（2）初筛培养基，玉米粉：麸皮：米糠：硫酸胺=7:3:2: （3）诱变后培养基，玉米粉：麸皮：米糠：硫酸胺=8：3::2:，水80ml。

（2）原料：玉米粉、麸皮等（3）菌种分纯将麸皮采集菌种取出一部分，置入装有10mL生理盐水和若干玻璃珠的小三角瓶内，振荡15分钟，将上清液一次稀释成10-1、10-2、10-3，各取做平板划线，29℃培养5~6天，分别挑取单个菌落接入斜面，29℃培养一周。

以大连某厂的生产用菌B-11为对照，对分离菌株做摇床发酵试验，96h后测定糖化力，配合镜检，确定诱变的出发菌株。

二、试验菌株的诱变用生理盐水洗下成熟出发株的孢子、倒入5mL麦汁种1％酵母膏的三角瓶中，振荡，使孢子活化，后3500r/min.离心分离15分钟，用磷酸缓冲液洗涤一次，再用缓冲液5ML洗转入小三角瓶内（内有数枚无菌玻璃珠），振荡10分钟，使孢子分散均匀，过滤，制成单孢子悬浮液，将浓度调至106个/ml取10ml孢子悬浮液于9cm平板中，紫外线（UV）照射诱变2分钟（避光操作），紫外线动率15W，室温，搅拌，照射距离30cm。

发酵实验报告(细菌液体发酵生产淀粉酶)

2、将温度、搅拌转速、通气量等参数设定好后，进行发酵。
（六）参数监测
每隔6 h取一次样，检测其pH、生物量、酶活及残糖含量等指标。
Ⅰ. pH的测定：标准液校准pH计后，测定样品pH值。
Ⅱ.生物量的测定：每次取20-30mL的发酵液，先用大离心机(5000 rpm, 3～5 min)离心，收集上清液，用小离心机（10000rpm，1min）用来测酶活，沉淀用水清洗几次后再离心，然后将所得沉淀放入100℃烘箱中，烘干（2 h左右），然后测其干重，取平均值。
式中：
ODA——A管的吸收光度值；103——mg转换为ug；
ODB——B管的吸收光度值；180.2——葡萄糖的摩尔质量；
N——酶液的稀释倍数；10——表示酶反应时间为10min；
K：标准曲线斜率。
回归直线方程y=kx-0.0747，k=0.7023。
酶活力单位（U/ml）={[K(ODA+ ODB)]/2 + b}×N×103/10/0.2/180.2=0.794U/ml
4．罐体排汽口排汽，并保持罐内正压。
5．空气过滤系统只空消，不实消，以免罐中物料冲入过滤器内。但空消一结束，即要通入无菌空气吹干管路并保压，避免染菌。
6．进蒸汽时顺着蒸汽管路开阀门，结束时逆着进路关阀门，先开尾阀后开主阀，结束时先关主阀后关尾阀。
7．蒸汽一停，即由无菌空气充入保持罐内正压。
8．蒸汽对设备与物料灭菌中注意安全，控制时间、压力限制。
本科学生实验报告
学号104120440姓名孙永升
学院生命科学学院专业、班级10生物技术
实验课程名称发酵开课学期2012至2013学年第二学期
填报时间2013年5月15日
云南师范大学教务处编印
实验名称

完整版发酵工艺学原理复习题答案

发酵工艺学原理复习题参考答案（2011级）第二章1.比较固体培养与液体培养的优缺点。

固体培养优点：（1）酶活力高。

（因为菌丝体密度大）（2）生产过程中无菌程度要求不是很严格。

（3）对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成本。

缺点：（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。

（2）周期长。

（3）培养过程中环境条件控制较难。

（4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种菌类不纯。

液体培养优点：（1）生产效率高，便于自动化管理。

（2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全面控制。

（3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。

缺点：（1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。

（2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密度大而难以实现。

2.说明菌种扩大培养的条件。

菌种扩大培养条件因不同的菌种差异是非常大的，通常是与菌种的性质有关的，也与后续的发酵工艺有关。

但是，与发酵工艺却有着很大的差别。

1.培养基：种子培养基因不同的微生物种类差别是很大的，同一种微生物因不同的扩大培养过程（一级、二级）其培养基往往也有较大差异。

通常，对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基也不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。

2.温度种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。

需要指出的是：（1）许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30℃，而产物合成温度为32-34℃（2）种子扩大培养的温度的选择，应该考虑的是菌体的快速增殖上，一方面可以缩短周期，另一方面有利于抑制其他杂菌的生长。

3.氧的供给菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气，无论是厌氧发酵还是好氧发酵。

一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法

一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法
麦芽糖淀粉酶在食品、饲料和医药等领域具有广泛的应用价值，因此高效表达麦芽糖淀粉酶的方法备受关注。

本研究提出了一种在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶的方法。

首先，通过PCR扩增麦芽糖淀粉酶基因，将其克隆入表达载体pHT43中。

然后，将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌中，利用IPTG诱导表达。

最后，通过酶活测定和SDS-PAGE分析表达产物，确定最佳表达条件。

结果表明，使用pHT43载体、37°C培养温度和0.5 mM IPTG 诱导表达，可在枯草芽孢杆菌中高效表达麦芽糖淀粉酶，表达量可达到1.4 g/L，酶活产率为15820 U/g。

总之，该方法可为工业化生产麦芽糖淀粉酶提供一种高效、稳定的表达方式。

- 1 -。

枯草芽孢杆菌生产淀粉酶流程

枯草芽孢杆菌生产淀粉酶流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!枯草芽孢杆菌生产淀粉酶是一个生物技术生产过程，涉及到微生物的培养、诱导和提取等多个步骤。

糖化酶生产工艺

糖化酶生产工艺糖化酶是一种能够将淀粉、糖类等多糖分解成较小的糖分子的酶类。

糖化酶广泛应用于食品、饲料、发酵等行业中，对于提高产品质量、降低生产成本具有重要作用。

糖化酶的生产工艺主要包括发酵、提取和纯化等步骤。

首先是发酵步骤，发酵是糖化酶生产的关键环节。

选择合适的菌株是确保糖化酶高效产生的重要因素。

常用的菌株有曲霉、枯草芽孢杆菌等。

发酵培养基的配方需要考虑菌株的营养需求，一般包括碳源、氮源、矿物质和生长因子等。

发酵条件的调控也是关键，包括温度、pH值、搅拌速度和氧气供应等。

优化这些条件可以提高糖化酶产量和活性。

其次是提取步骤，通过合适的方法将发酵液中的酶提取出来。

常用的提取方法有搅拌提取、超声波提取和离心提取等。

其中搅拌提取是最常用的方法，通过将发酵液和混凝土搅拌，将酶分离出来。

提取液中的酶可以直接用于后续的应用，也可以进一步进行纯化处理。

最后是纯化步骤，目的是将提取液中的糖化酶纯化出来，以提高酶的纯度和活性。

纯化方法有离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析和逆流层析等。

这些方法可以根据酶的特性进行选择和组合使用，以达到最理想的纯化效果。

值得注意的是，糖化酶的生产过程中需要对各个步骤进行监控和控制，以保证产品的质量和一致性。

监测酶的产量和活性，调整发酵条件和提取条件，以及确保纯化过程中的良好操作和消毒措施等都是必要的。

此外，还需要对废水和废料进行处理，以减少对环境的影响。

总之，糖化酶的生产工艺包括发酵、提取和纯化等步骤，通过合理的条件控制和方法选择，可以提高产量和活性，提高产品质量和一致性。

糖化酶的生产工艺需要根据具体情况进行调整和改进，以满足不同行业的需求。

糖化酶研究进展

酶学糖化酶的研究进展2013年糖化酶的研究进展摘要:糖化酶是世界上生产量最大和应用范围最广的酶制剂,在工业中具有重要的应用价值。

本文从微观学角度出发，主要介绍了糖化酶的结构和催化作用机制；另外介绍了糖化酶的分离纯化手段及其功能应用；最后提出了研究中存在的问题以及解决办法，并对糖化酶应用研究的前景进行了展望。

关键词：糖化酶；结构；催化机制；分离纯化；功能STUDYING STRUCTURE AND FUNCTION OFGLUCOAMYLASEAbstract:Glucoamylase is the enzyme which has the most output and the vastest application in the world . From the perspective of microscopic science, This review introduces the structure and catalytic mechanism of glucoamylase; additionally introduced separation and purification methods and application of glucoamylase; In the end, put forward the application, the problems and solutions of glucoamylase research, provide future application prospect.Keywords: glucoamylase；structure ；Catalytic mechanism；Purification；function糖化酶又称为葡萄糖淀粉酶(glucoamylase),全称是α-（1-4）-葡聚糖—葡萄糖水解酶，它的底物是葡萄糖分子通过α-（1-4）-糖苷键连成的高分子，水解产物是葡萄糖，酶学编号是E3.2.1.3[1]。

枯草杆菌摇瓶发酵生产α-淀粉酶实验方案

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验一、实验原理以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。

通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。

淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。

芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有 6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。

通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。

二、实验材料（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（二）培养基：1、种子培养液：葡萄糖1% 、胰蛋白胨：1%, 、酵母提取物：0.5%、NaCl(氯化钠)：1%调pH7.2 ，若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。

2、产淀粉酶发酵培养液：玉米粉 2 .0 % 、蛋白胨1 .5% 、CaCl20 .02 % 、MgSO40 .02% 、NaCl 0 .25% 、K2HPO40 .2% 、柠檬酸钠0 .2% 、硫酸铵0 .075% 、Na2HPO40 .2 %调节pH 值7 .0（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0）（四）实验仪器离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管三、实验过程1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。

2、种子斜面及种子液准备A.挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养基，37℃，24h作菌种（3支/组）。

B.将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。

C.在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培养液中（每支斜面接两瓶），37℃ 120r／min振荡培养16h作种子液。

酿酒活性干酵母_AADY_的研究

酿酒活性干酵母（Ａｌｃｏｈｏｌ－ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＡｃｔｉｖｅＤｒｙＹｅａｓｔ，ＡＡＤＹ）是现代生物工程、干燥技术和酵母工业融合发展的一种高科技产品，具有含水量低（５％￣８％）、保藏期长、发酵稳定性高、能赋予酒品特殊的品质等，且能显著提高酿酒的质量和效率。１２世纪初朱翼中在《北山酒经》中论述的“ 干酵 ”可谓是世界上最早的ＡＡＤＹ雏形［１］，但真正的ＡＡＤＹ是在１８５７年法国微生物学家ＬｏｕｉｓＰａｓｔｅｒ（巴斯德）发现酒精发酵原理以后，经２０世纪２０年代面包活性干酵母的发展阶段，７０年代末在欧美发达国家的酒精、葡萄酒和蒸馏酒工业中开始普遍使用ＡＡＤＹ。我国是在２０世纪８０年代由王朝葡萄酒厂从法国引进并首先使用ＡＡＤＹ，随后，自主研制了最早的商品ＡＡＤＹ— ——用于葡萄酒酿造的ＴＱ嗜杀ＡＤＹ［２］。目前，酵母工业已在全球形成了独立的产业体系，产量约３００万ｔ，造就了Ｌｅｓａｆｆｒｅ、Ｂｕｎｓ等世界酵母企业巨舰。中国的酵母工业形成了安琪、丹宝利、梅山等１４家酵母
专论与综述
中国酿造
２００６年第１１期
总第１６４期 · ３ ·
甘油溶液、木糖醇溶液、麦芽糖醇溶液（均为３００ｇ／Ｌ）［２１］；麦芽糖（５％）、麦芽糖糊精（１．８ｋＤａ，４０％（ｗ／ｖ）［２２］和向日葵油、大豆油（０．１％￣０．４％）、磷脂（０．１％￣５％）、ＢＨＴ／ＢＨＡ（０．００５％￣０．５％）（均为占细胞干物质重）等［２３］。经研究，大分子能将菌体包埋掩蔽而减少细胞内物质的破坏，但这会使活性有不同程度地降低。而通过甘油、甘露醇、等渗透性保护剂和蔗糖、葡萄糖等非渗透性保护剂之间的联合作用实验，发现其作用方式截然不同，影响了保护剂的保护效果［２４］，这一现象有待进一步研究。３．３ＡＡＤＹ的干燥工艺

枯草芽孢杆菌发酵鱼粉产蛋白酶及其酶解效果

枯草芽孢杆菌发酵鱼粉产蛋白酶及其酶解效果卢珍华【摘要】为开发以鱼粉为原料的优质饲料蛋白源以及相关保健食品,开展了用不同鱼粉为氮源发酵枯草芽孢杆菌生产蛋白酶及其酶解效果的研究,比较了不同菌种的发酵效果,确定了最佳发酵时间.通过蛋白酶活性测定和氨基态氮含量测定分析了不同菌种的产酶能力和酶活性大小及其酶解效果.结果表明,用罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵商业化的工业菌种枯草芽孢杆菌产生的酶活性显著高于鲢鱼鱼粉（P 〈0.05）,发酵后上清液中的氨基态氮含量也显著高于鲢鱼鱼粉（P〈0.05）,即工业化的枯草芽孢杆菌对不同鱼粉的发酵效果不同,罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.%To get higher enzymatic activity of proteases produced by Bacillus subtilis by fermentation,different fish meals were used as nitrogen sources.The effects of fermentation time,as well as the difference between commercial and field strains on enzymatic activity were compared.The content of amino nitrogen in the broth of fermentation was also determined.The results suggested that commercial strain showed a better performance in the fermentation with the fish meal of tilapia and codfish compared to silver carp.During the fermentation of Bacillus subtilis using tilapia and codfish meal as nitrogen sources,higher enzymatic activity and content of amino nitrogen were observed.【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(017)004【总页数】4页(P265-268)【关键词】枯草芽孢杆菌;鱼粉;蛋白酶;氨基态氮【作者】卢珍华【作者单位】集美大学生物工程学院,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q51微生物蛋白酶均为胞外酶，与动植物源蛋白酶相比，它具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单快速的特点，具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，同时易于实现工业化生产［1］.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是生产碱性蛋白酶的传统菌株，具有产蛋白酶量大，耐高温、高碱等特点，因此，对枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究成为蛋白酶研究的热点［2］.鱼粉是动物饲料中优质的蛋白质来源，同时，随着生物技术的发展，越来越多的以鱼粉为基础的酶解发酵产物如寡肽等被证明不仅发挥营养作用［3］，而且具有提高免疫力，改善动物胃肠道菌群结构等功能.并且极有可能作为保健食品的功能因子应用于保健食品，改善人的免疫力或辅助治疗高血压、糖尿病等［4］.本文通过比较不同来源枯草芽孢杆菌及其不同发酵条件下不同鱼粉的发酵效果，以探索获得高效蛋白酶及其酶解产物的途径.枯草芽孢杆菌由集美大学生物工程学院发酵实验室提供，有工业菌种和非工业菌种2种.种子培养基(质量分数):牛肉膏1.0%，葡萄糖1.5%，NaCl 0.5%，pH=7.2，121℃蒸气灭菌20 min;发酵培养基 (1000 mL):牛肉膏0.1 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉1.0 g，葡萄糖0.5 g，氮源分别选择加工处理过的鳕鱼(Gadoux macrocephalus)、干燥的罗非鱼(Tilapia mossambica)、新鲜未干燥的鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)鱼粉各6 g，水，pH=7.2，121℃蒸气灭菌20 min.7200紫外可见分光光度计 (上海第三分析仪器厂);HH.B11型恒温培养箱 (上海跃进医疗器械厂);HQ45B型恒温摇床 (上海科学院武汉科学仪器厂);SP－DJ系列垂直净化工作台 (上海浦东伟普净化设备厂);WH－1漩涡混合器 (上海沪西分析仪器厂);PHS－2C精密酸度计 (上海雷磁仪器厂).从甘油管中取出保存的菌种，以划线形式接种于含氯霉素的固体培养基平板上，在37℃培养箱中培养约24 h.从平板上挑取单菌落接种于种子培养液内，37℃培养6 h.然后以10%接种量转接到含有50 mL培养液的250 mL三角瓶中，37℃培养. 取发酵液于4000 r/min离心20 min，取上清液，采用Folin酚法测定蛋白酶活力［5］.酶活力单位定义为:在55℃、pH=10.0条件下，1 min水解干酪素产生1 μg酪氨酸所需酶量定义为1个酶活力单位，以U表示.样品的酶活力/(U·mL－1)=4AKn/10=2AKn/5.式中:A为样品平行实验的平均吸光度值;K为吸光常数，取134;n为稀释倍数.样品液5 mL，加蒸馏水30 mL，用0.1 mol/L的NaOH溶液中和至pH=7.5，加入中性甲醛溶液10 mL摇匀，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至pH=9.2，根据消耗NaOH溶液毫升数计算氨基态氮含量.利用单因素方差分析法分析不同菌种、不同时间及不同氮源的发酵效果，差异显著则进行多重比较，应用SPSS17.0软件进行分析.以鳕鱼鱼粉为主要氮源，比较工业菌种和非工业菌种发酵后蛋白酶的活力，其结果如图1所示.工业菌种发酵44、52、60 h取样的蛋白酶活力显著高于非工业菌种(P＜0.05).以鳕鱼鱼粉为氮源，工业菌种发酵，考察发酵时间与发酵产物蛋白酶活力的关系，其结果如图2所示.由图2可见，酶活力在发酵52～56 h达到最大，显著高于发酵48 h或60 h(P＜0.05).工业菌种发酵55 h，考察对加工处理过的鳕鱼鱼粉、干燥的罗非鱼鱼粉及新鲜未干燥的鲢鱼鱼粉的发酵效果，分别测定酶活力及发酵上清液中的氨基态氮.结果表明，枯草芽孢杆菌对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵中酶活力显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05)(见图3);枯草芽孢杆菌对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉发酵后上清液中的氨基态氮含量显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05)(见图4).说明，工业化的枯草芽孢杆菌在本实验条件下，对不同鱼粉的发酵效果不同，对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉的发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.研究表明，工业化的枯草芽孢杆菌产蛋白酶的能力显著优于天然菌株，而工业化的枯草芽孢杆菌对罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉的发酵效果显著优于鲢鱼鱼粉.鱼粉是以蛋白质为主要成分的混合物，除氮源外的其他成分如碳源、添加剂等都对枯草芽孢杆菌的产酶能力有重要影响.发酵效果的主要表征即寡肽和氨基态氮的形成取决于微生物蛋白酶的产生效率及不同蛋白质基质的特性［6－7］，其中，在微生物发酵过程中，氮源的主要作用是作为微生物细胞物质和含氮代谢物的氮素来源的营养物质，氮源作为枯草芽孢杆菌发酵培养基的一个主要因素，在芽胞的形成上发挥着重要作用［8］.不同的蛋白质基质是影响发酵效果的主要因素［9］，不同豆类蛋白质的发酵研究表明，大豆和经油榨工艺后的豆饼豆粕产寡肽和氨基态氮的能力显著高于其他豆类及其副产品［10－11］.本研究表明，罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉以及鲢鱼鱼粉作为不同的氮源，经工业化的枯草芽孢杆菌发酵后，罗非鱼鱼粉和处理过的鳕鱼鱼粉相对鲢鱼鱼粉表现较高的酶活力(P＜0.05)，上清液中的氨基态氮也显著高于鲢鱼鱼粉(P＜0.05).本研究还比较了不同菌株的发酵效果，工业化的菌株发酵效果显著优于自然菌株.相关研究报道了几株经基因重组技术改造的工业化菌株表达高活性的蛋白酶，显著提高了蛋白酶的活性和产量，利用该菌种进行的发酵试验表明，寡肽和氨基态氮均显著提高［12－13］.本研究明确了枯草芽孢杆菌对不同鱼粉的发酵效果，为以鱼粉为原料的生物技术饲料和功能保健食品的开发奠定了理论基础，后续的研究需要明确发酵产物中寡肽含量及其基本结构，明确发酵产物的主要营养及保健功能.【相关文献】［1］ SAEKI K，OZAKI K，KOBAYASHI T，et al.Detergent alkaline proteases:enzymatic properties，genes，and crystal structures ［J］.J BioSci BioEng，2007，103(6):501－508. ［2］ JOO H S，CHOI J W.Purification and characterization of a novel alkaline protease from Bacillus horikoshii［J］.J Microbiol Biotechnol，2012，22(1):58－68.［3］陈洁，黄佩佩，宋茹.枯草芽孢杆菌发酵鱼蛋白制备抗氧化型发酵液工艺的初步研究［J］.浙江海洋学院学报:自然科学版，2011，30(3):254－258.［4］ ERBA D，CIAPPELLANO S，TESTOLIN G.Effect of the ratio of casein phosphopeptides to calcium(w/w)on passive calcium transport in the distal small intestine of rats ［J］.Nutrition，2002，18(9):743－748.［5］王福荣，郭风茹，田栖静，等.QB/T 1803—1993 工业酶制剂通用试验方法［S］.天津:轻工业部食品工业司，1993.［6］ÖZDEMIR S，MATPAN F，GÜVEN K，et al.Production and characterization of partially purified extracellular thermostable α－amylase by Bacillus subtilis in submerged fermentation(SmF) ［J］.Prep Biochem Biotechnol，2011，41(4):365－445.［7］ FERNANDEZ－OROZCO R，FRIAS J，MUNOZ R，et al.Fermentation as a bio－process to obtain functional soybean flours［J］.J Agric Food Chem，2007，55(22):8972－8980.［8］韦赘，江正强，李里特，等.枯草芽孢杆菌产甘露聚糖酶固体发酵条件的优化［J］.微生物学通报，2006，33(1):84－89.［9］ SOARES V F，CASTILHO L R，BON E P，et al.High－yield Bacillus subtilis protease production by solid－state fermentation ［J］.Appl Biochem Biotechnol，2005，34(2):311－319.［10］何勇锦，吴美琼，蔡聪育，等.枯草芽孢杆菌KJ发酵豆粕制备新型蛋白肽饲料的研究［J］.云南民族大学学报:自然科学版，2011，20(6):462－465，475.［11］ OUOBA L I，RECHINGER K B，BARKHOLT V，et al.Degradation of proteins during the fermentation of African locust bean(Parkia biglobosa)by strains of Bacillus subtilis and Bacillus pumilus for production of Soumbala ［J］.J Appl Microbiol，2003，94(3):396－402.［12］ ISU N R，OFUYA C O.Improvement of the traditional processing and fermentation of African oil bean into a food snack－‘ugba’［J］.Int J Food Microbiol，2000，59(3):235－243.［13］ ALI A A，ROUSHDY I M.Fermentation of milk permeate by proteolytic bacteria for protease production ［J］.Appl Biochem Biotechnol，1998，74(2):85－93.。