免疫共沉淀试剂盒说明书

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免疫沉淀磁珠及试剂盒

免疫沉淀磁珠及试剂盒（Beads Protein A(or A/G)Immunoprecipitation Kit）货号：M2400规格：20T保存：2-8℃产品内容：Beads Protein A/G Matrix免疫沉淀磁珠及试剂盒系列产品是利用纳米表面技术使Protein A/G高密度定向包被到超顺磁性微球表面，与当前国际免疫磁珠市场上同类产品相比，该产品具有更多的抗体结合位点，磁珠使用量更少，非特异性结合率低，可便捷高效地进行免疫沉淀实验。

每毫升免疫沉淀磁珠结合Human IgG的能力可达到300μg以上，单个沉淀反应仅需25μL磁珠即可完成检测。

微米级磁珠提供的超大比表面积，大幅缩短抗体与抗原吸附所需的平衡时间，15min内即可完成抗体吸附过程，30min 内完成抗原沉淀操作。

简短的操作时间避免长时间操作造成目标蛋白水解，保证了目标蛋白的活性及蛋白复合物的完整性。

免疫沉淀磁珠试剂盒配有经过优化预制的缓冲液，为免疫沉淀实验提供了最佳的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳定性。

本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。

操作者可以参考本操作说明书，附表1的数据了解不同种属来源及亚型的抗体与Protein A磁珠、Protein A/G的结合能力。

产品特性：产品名称规格免疫沉淀磁Beads Protein A/G for IP①1mL结合缓冲液IP Binding Buffer②30mL磷酸盐缓冲液PBS(10×,用之前请稀释到1×)③20mL洗涤缓冲液IP Washing Buffer④20mL洗脱缓冲液IP Elution Buffer⑤0.5mL中和缓冲液IP Neutralization Buffer⑥0.2mL储存条件2~8o C保存保存期1年注：磁珠结合Human IgG能力（Antibody Capacity）分别为：Protein A：0.4~0.5mg/mL;Protein A/G：0.5~0.6mg/mL操作步骤：1.抗原样品制备：本操作说明书提供以下四种样品处理方法，建议您根据不同来源的抗原样品选择适当的方式进行预处理，使待检测抗原释放至样品溶液中。

整理）Co-IP免疫共沉淀样品制备

整理）Co-IP免疫共沉淀样品制备Co-IP免疫共沉淀样品制备一、所需试剂1、Pierce?交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒（货号88805 4℃保存）（1）Pierce 蛋白A/G 磁珠1 mL，贮存于含有0.05% NaN3的水中，浓度为10 mg/mL （2）Pierce 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液（pH 7.4）<1>0.025M Tris，0.15M NaCl：这个盐浓度可以保持大部分蛋白之间的相互作用<2>0.001M EDTA: 乙二胺四乙酸，螯合金属离子，抑制一些含巯基的酶<3>1% NP40：表面活性剂，可以温和裂解膜，拮抗非特异性的蛋白相互作用<4>5% 甘油: 其粘性可以保护蛋白质之间的相互作用起（3）20×交联缓冲液，25 mL, 稀释后含10 mM 磷酸钠，150 mM NaCl；pH 7.2（4）DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯，具有胺反应性的同源双功能交联剂，具体见附/1），No-Weigh?形式，每包加217μDM SO溶解成10X储存液（4）中和液，1.0 mL，pH 8.5（5）洗脱液，25 mL，pH 2.0（如需自己配见附录2）（6）电泳上样缓冲液：非还原性，（5×）, 5 mL，pH 6.8，0.3M Tris·HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料（好像不含巯基乙醇，减少IP抗体的变性）2、Protease cocktail（货号：cw2200s）：蛋白酶抑制剂混合物，具体什么就不管了3、IP抗体和IB抗体（两者抗体种属最好不一样！理由见附录3），对照IgG抗体4、ddH2O二、具体步骤（冰上进行）第一天：<一>蛋白样品制备一般用超大皿来提蛋白，裂解蛋白只需10-15min，裂解蛋白离心期间可以进行第<二>和第<三>一部分<二>抗体—A/G蛋白磁珠结合1、1×改良的交联缓冲液制备：0.1 mL的20×交联缓冲液+0.1 mL 的免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液+1.8 mL超纯水2、向离心管中加入25 μL磁珠（使用前涡旋），将离心管置于磁力架上1分钟，收集磁珠。

Pierce免疫共沉淀(Co-IP)试剂盒26149

说明书Pierce®免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒26149 2181.6货号描述26149 Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒，包含足够进行50次免疫沉淀反应的试剂（每次使用25 μL树脂固相化抗体）试剂盒组分：加强型AminoLink®偶联树脂，2 mL固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100 μL 50%的浆液含有50 μL固相树脂）20×交联缓冲液，25 mL，使用时稀释至：0.01M Na3PO4，0.15M NaCl；pH 7.2氰基硼氢化钠溶液（5 M），0.5 mL淬灭缓冲液，50 mL ，1M Tris-HCl洗涤缓冲液，60 mL，1M NaClIP裂解/洗涤缓冲液，2 × 50mL，0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%甘油；pH 7.4改良型杜氏PBS （20×），25mL，使用时稀释至：0.008M Na3PO4、0.002M K3PO4、0.14M NaCl、0.01M KCl；pH 7100×条件缓冲液，5 mL，中性pH缓冲液洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺非还原型泳道标记上样缓冲液，（5×），5 mL，0.3M Tris•HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料；pH 6.8Pierce离心柱-带螺帽，100个柱子，包含相应配件微量离心收集管，2 mL，100个微量离心样品管，1.5 mL，50个Pierce对照用琼脂糖树脂（4％琼脂糖珠交联），2 mL固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100 μL 50%的浆液含有50 μL固相树脂）储存：收到试剂盒后将其储存于4°C。

将DSS于4°C干燥保存。

常温运输。

产品简介Thermo Scientific Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒通过将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解液或其它复杂混合物中分离天然蛋白复合体。

免疫共沉淀实验·基础篇

免疫共沉淀实验·基础篇What is Co-IP？Co-IP全称Co-Immunoprecipitation，中文学名免疫共沉淀，是一种以抗体和抗原识别专一性为基础，用于研究蛋白质之间相互作用的经典方法。

通俗点来说，假设我们需要研究样品中A蛋白和B蛋白之间是否存在一些相互作用，首先我们通过合适的方法处理样本，将蛋白提取出来（同时不能破坏蛋白之间的相互作用），然后用预先结合了琼脂糖珠或者磁珠的A蛋白抗体捕获样本中的A蛋白，那么与A蛋白结合的B蛋白也能一起沉淀下来。

再将蛋白从珠子上裂解下来，对B蛋白进行检测，能检测到，说明B蛋白在之前的沉淀过程中随着A蛋白一起被拉下来了，进而证明二者之间存在相互关系。

How to do？实验流程A few tips：如何理解文献中的结果？各名称解析：IB：全称immunoblotting，即免疫印迹，也就是常规的Western Blotting，用于显示目的蛋白。

IP：全称immunoprecipitation，即免疫沉淀，这一步主要是为了纯化富集目的蛋白。

Input：全细胞裂解液，含有细胞内所有的蛋白，可认为是阳性组。

也就是处理完样本得到的细胞裂解液，在做IP实验之前，需要先跑WB，确认样本中含有蛋白A和蛋白B。

Anti-A：A蛋白的免疫共沉淀抗体IgG：Anti-A的同型对照抗体，即跟Anti-A同来源同种型，如Anti-A是兔来源IgG型，则同型对照抗体需要选择Rabbit IgG （abs20035）结果图解析：该结果是为验证蛋白A与蛋白B是否存在相互作用。

本实验一共分为两大组：Input组及IP组，其中IP组又分为IgG组（阴性对照组）和实验组，并通过WB去验证蛋白A和B在每一个组里面是否存在。

由Input组的条带可以得到结论：蛋白A与蛋白B都是存在的，证明样本处理提取蛋白的步骤没有任何问题。

阴性对照IgG组和实验组平行进行免疫沉淀实验，结果蛋白A与蛋白B均没有条带，说明利用IgG抗体没有把蛋白A和B沉淀下来，证明蛋白A和B与IgG没有结合，排除了蛋白与抗体非特异性结合的可能性；而实验组蛋白A和B均有条带，表示利用蛋白A的抗体进行沉淀实验，成功把蛋白A沉淀下来了，与此同时蛋白B也被沉淀下来，进而得到结论：蛋白A与蛋白B之间存在相互作用。

Pierce交联磁珠式免疫沉淀免疫共沉淀试剂盒

说明书Pierce™交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒888052309.4货号描述88805 Pierce交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒，包含足够完成40个反应的试剂，每个反应使用25 µL磁珠试剂盒组成:Pierce 蛋白 A/G 磁珠1 mL，贮存于含有 0.05% NaN3的水中，浓度为10 mg/mLPierce 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液，2 × 50 mL，pH 7.4，0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP40，5% 甘油20×交联缓冲液，25 mL, 稀释后含10 mM 磷酸钠， 150 mM NaCl；pH 7.2DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯），No-Weigh™形式， 8 × 2 mg 微型管中和液，1.0 mL，pH 8.5洗脱液，25 mL，pH 2.0电泳上样缓冲液，非还原性，（5×）, 5 mL，pH 6.8，0.3M Tris·HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料贮存条件：收到本产品后于4°C贮存。

冰盒运输。

目录产品简介 (2)流程简述 (2)重要产品信息 (2)所需额外试剂和仪器 (3)Pierce经典磁珠式免疫沉淀试剂盒流程 (3)A. 将抗体结合于蛋白A/G磁珠上 (3)B. 交联结合的抗体 (4)C．哺乳动物细胞裂解 (4)D. 手动抗原免疫沉淀 (5)E. 自动免疫沉淀 (5)问题解决 (7)网站附加信息 (7)Thermo Scientific KingFisher 仪器的常见问题 (8)Thermo Scientific相关产品 (8)产品简介Thermo Scientific™ Pierce™ 交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒通过共价键将抗体交联于Thermo Scientific™ Pierce™ 蛋白 A/G磁珠上能够高效完成抗原免疫沉淀（IP）及免疫共沉淀（Co-IP）实验。

整理)Co-IP免疫共沉淀样品制备

Co-IP免疫共沉淀样品制备一、所需试剂1、Pierce™交联磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒（货号88805 4℃保存）（1）Pierce 蛋白A/G 磁珠1 mL，贮存于含有0.05% NaN3的水中，浓度为10 mg/mL （2）Pierce 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液（pH 7.4）<1>0.025M Tris，0.15M NaCl：这个盐浓度可以保持大部分蛋白之间的相互作用<2>0.001M EDTA: 乙二胺四乙酸，螯合金属离子，抑制一些含巯基的酶<3>1% NP40：表面活性剂，可以温和裂解膜，拮抗非特异性的蛋白相互作用<4>5% 甘油: 其粘性可以保护蛋白质之间的相互作用起（3）20×交联缓冲液，25 mL, 稀释后含10 mM 磷酸钠，150 mM NaCl；pH 7.2（4）DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯，具有胺反应性的同源双功能交联剂，具体见附/1），No-Weigh™形式，每包加217μDMSO溶解成10X储存液（4）中和液，1.0 mL，pH 8.5（5）洗脱液，25 mL，pH 2.0（如需自己配见附录2）（6）电泳上样缓冲液：非还原性，（5×）, 5 mL，pH 6.8，0.3M Tris·HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料（好像不含巯基乙醇，减少IP抗体的变性）2、Protease cocktail（货号：cw2200s）：蛋白酶抑制剂混合物，具体什么就不管了3、IP抗体和IB抗体（两者抗体种属最好不一样！理由见附录3），对照IgG抗体4、ddH2O二、具体步骤（冰上进行）第一天：<一>蛋白样品制备一般用超大皿来提蛋白，裂解蛋白只需10-15min，裂解蛋白离心期间可以进行第<二>和第<三>一部分<二>抗体—A/G蛋白磁珠结合1、1×改良的交联缓冲液制备：0.1 mL的20×交联缓冲液+0.1 mL 的免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液+1.8 mL超纯水2、向离心管中加入25 μL磁珠（使用前涡旋），将离心管置于磁力架上1分钟，收集磁珠。

免疫共沉淀操作步骤

免疫共沉淀操作步骤免疫共沉淀（immunoprecipitation）是一种常用的实验技术，用于检测特定蛋白与其他分子的相互作用。

本文将介绍免疫共沉淀的操作步骤，包括前期准备、取样、免疫共沉淀、洗涤、洗脱和分析结果等。

一、前期准备1. 准备所需试剂：PBS缓冲液（含0.1%的Tween-20）、蛋白质抽提缓冲液（含有适当的蛋白酶抑制剂）、抗体（单克隆或多克隆抗体）、控制组织或细胞苗、蛋白质A/G磁珠等。

2.对样品进行处理：收集样品，如细胞或组织，并用蛋白质抽提缓冲液裂解细胞膜或组织。

3. 确定抗原-抗体反应的条件：进行Western blot或其他实验，确定抗体和目标蛋白的最佳工作浓度和最佳条件。

二、取样1.将裂解的细胞或组织样品通过离心等手段去除细胞碎片和残留的细胞核。

2.将上清液收集到新的离心管中，并测定样品的总蛋白浓度，以便后续计算抗体的用量。

3.根据总蛋白浓度将样品分成相等的小样本，并放入不同的离心管中。

三、免疫共沉淀1.将试验管中的抗体与适量的蛋白质A/G磁珠混合，孵育一段时间，使抗体与磁珠形成固定复合物。

2.将磁珠与固定复合物加入到每个含有样品的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。

3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中，以减少非特异性结合的背景。

4.用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。

5.转移沉淀到新的离心管中，并用PBS缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除残留的非特异性结合蛋白质。

四、洗涤1.将磁珠与背景低的洗涤缓冲液混合，孵育一段时间，混匀后在冰上孵育。

2.将磁珠与洗涤缓冲液加入到每个含有沉淀的离心管中，混匀并在冰上孵育一段时间。

3.离心管置于磁珠磁架上，使磁珠在离心管底部附着，将上清液小心地转移至新的离心管中。

4.用洗涤缓冲液洗涤磁珠至少3次，以去除非特异性结合的蛋白质。

五、洗脱1.将洗涤缓冲液去除，加入适量的脱附缓冲液，孵育一段时间，混匀并在冰上孵育。

ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案

ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案染色质免疫沉淀-芯片试剂盒染色质免疫沉淀(芯片)的完整溶液是研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。

其基本原理是将蛋白质-DNA复合物固定在活细胞状态，将其随机切割成一定长度范围内的小染色质片段，然后通过免疫学方法沉淀复合物，特异性富集与靶蛋白结合的DNA片段。

通过目标片段的纯化和检测，可以获得关于蛋白质和DNA之间相互作用的信息。

芯片不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态相互作用，还可以研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

此外，芯片与其他方法的结合扩大了其应用范围:通过芯片与基因芯片的结合建立的芯片-芯片法已广泛用于高通量筛选特异的反式因子靶基因；芯片结合体内足迹法寻找反式因子的体内结合位点；核糖核酸芯片用于研究核糖核酸在基因表达调控中的作用因此，随着ChIP的进一步完善，它必将在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

就目前国内研究状况而言，教师在研究领域有分化、转录、发育、诱导多能性、肿瘤干细胞、表观遗传学等。

会做ChIP实验，一些老师会自己购买抗体，手动配置试剂。

然而，因为实验本身具有复杂的实验步骤，并且其中许多步骤非常关键，需要更多的试剂，所以很容易导致配置之间的错误，并且实验周期长。

如果没有设置阴性和阳性对照，结果就无法分析，从而导致无休止的混乱。

经典染色质免疫沉淀(ChIP)试剂盒(p-2002):提供细胞样品上染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂此外，试剂盒包含阳性对照抗体(核糖核酸聚合酶2抗体)、阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)和GAPDH引物(可用作阳性对照，以确保试剂盒中的试剂和操作步骤没有问题)在大多数生长中的哺乳动物细胞中，核酸聚合酶II富集在GAPDH基因启动子上，为启动转录做准备，因此启动子可以与核酸聚合酶II进行免疫沉淀反应，但不能与正常的小鼠IgG进行免疫沉淀反应。

在该染色质免疫沉淀反应中，细胞与甲醛偶联以提取其中的染色质染色质被适当破坏，然后加入微孔中，与吸附在微孔表面的抗体反应特异性结合在微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物中释放出来，通过我们公司专门设计的高速离心柱进行翻转和纯化。

(完整版)CO-IP说明书

说明书（CO-IP26149）Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒 261492181.6 描述26149 Pierce 免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒，包含足够进行 50 次免疫沉淀反应的试剂（每次使用 25ul 树脂固相化抗体）试剂盒组分：加强型AminoLink偶联树脂，2 mL 固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100ul 50%的浆液含有50ul固相树脂）20×交联缓冲液，25mL，使用时稀释至：0.01M Na ，0.15MNaCl；pH 7.2氰基硼氢化钠溶液（5 M），0.5 mL淬灭缓冲液，50 mL ，1M Tris-HCl洗涤缓冲液，60 mL，1M NaClIP 裂解/洗涤缓冲液，2 50mL，0.025MTris，0.15M NaCl，0.001M EDTA，1% NP-40，5%甘油；pH 7.4改良型杜氏PBS （20×），25mL，使用时稀释至：0.008M Na 、0.14MNaCl、0.01M KCl；pH7100×条件缓冲液，5mL，中性pH 缓冲液洗脱缓冲液，50 mL，pH 2.8，含有伯胺非还原型泳道标记上样缓冲液，（5×），5 mL，0.3M Tris•HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料；pH 6.8Pierce 离心柱-带螺帽，100 个柱子，包含相应配件微量离心收集管，2 mL，100个微量离心样品管，1.5mL，50个Pierce对照用琼脂糖树脂（4％琼脂糖珠交联），2 mL 固相树脂以50%的浆液形式提供（例如，100ul50%的浆液含有50ul的固相树脂）干燥保存。

常温运输。

产品简介 Thermo Scientific Pierce免疫共沉淀（Co-IP）试剂盒通过将纯化的抗体直接固定在琼脂糖基质上，从细胞裂解液或其它复杂混合物中分离天然蛋白复合体。

免疫共沉淀是研究蛋白:蛋白相互作用的一种常用方法，即用抗体去免疫沉淀特定抗原（诱饵蛋白）并且共沉淀任何与该抗原相互作用的蛋白（目标蛋白）。

免疫共沉淀试剂盒说明书

Pierce Biotechnology 3747 N. Meridian Road
PO Box 117 Rockford, lL 61105 USA
(815) 968-0747 (815) 968-7316 fax
/pierce
Important Product Information
• For best results, add Thermo Scientific Halt Protease (Product No. 78430) and Phosphatase (Product No. 78428) Inhibitor Cocktails to minimize degradation and dephosphorylation of cell lysate proteins. These inhibitors are also available as a combined cocktail (Product No. 78440). See the Related Thermo Scientific Products Section for more information.
Wash Solution, 60mL, 1M NaCl IP Lysis/Wash Buffer, 2 × 50mL, 0.025M Tris, 0.15M NaCl, 0.001M EDTA, 1% NP-40, 5% glycerol; pH 7.4
Modified Dulbecco’s PBS (20X), 25mL, when diluted results in 0.008M sodium phosphate, 0.002M potassium phosphate, 0.14M sodium chloride and 0.01M KCl; pH 7

P2078 染色质免疫沉淀检测试剂盒说明书_ChIP Assay Kit_

ChIP Assay Kit产品简介：ChIP Assay Kit即Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit，也称染色质免疫沉淀检测试剂盒或ChIP检测试剂盒，用于通过免疫沉淀来沉淀和目标蛋白结合的染色质片段，最后通过PCR或Southern等方法来检测沉淀的染色质片段的试剂盒。

通常用于检测特定的转录因子或组蛋白等基因组DNA结合蛋白是否和预期的特定基因组DNA序列在同一复合物中。

通过ChIP检测可以获得在体的(In Vivo)目标蛋白和预期基因组DNA片段是否在同一复合物中的结论。

EMSA，也称gel shift获得的结果是体外的(In Vitro)目标蛋白和预期基因组DNA片段的结合结果，可以推断细胞内也发生类似的结合，但并不代表该情况在细胞内也真实发生。

而ChIP的检测结果则可明确说明这种结合在细胞内是真实发生的。

本ChIP Assay Kit采用了Protein A+G Agarose，比Protein A Agarose或Protein G Agarose适合于免疫沉淀更多种类的抗体，包括mouse IgG1，IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, rat IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, rabbit IgG, rabbit and goat polyclonal Abs，以及human IgG1, IgG2, IgG3和IgG4。

本试剂盒中经过Salmon Sperm DNA预饱和的Protein A+G Agarose和目的基因组DNA的非特异性结合大大下降。

提供了预混合的对照引物(Control Primers)。

可用于扩增human GAPDH的部分相应序列，引物序列为：5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’；5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

本ChIP Assay Kit如果用于常规的染色质免疫沉淀，共可以免疫沉淀22个样品。

免疫共沉淀试及染色质免疫共沉淀试剂

免疫共沉淀试及染色质免疫共沉淀试剂
免疫共沉淀试及染色质免疫共沉淀试剂是生命科学中常用的实验方法之一，用于研究蛋白质和DNA/RNA之间的相互作用及其在细胞功能和调控中的作用。

免疫共沉淀试剂是一种利用抗体特异性结合目的蛋白质的方法，可用于分离和富集免疫沉淀物。

该方法包括将含有目的蛋白质的细胞裂解液与对应的免疫抗体预先结合，形成细胞裂解物-抗体复合物。

接着，将复合物与免疫沉淀剂（例如蛋白A-agarose或蛋白G-agarose）混合，复合物可与免疫沉淀剂结合并沉淀下来，从而分离和富集免疫沉淀物。

染色质免疫共沉淀试剂则是在免疫共沉淀试的基础上发展出的方法，用于研究蛋白质与染色质之间的相互作用及其在染色质结构与功能调控中的作用。

该方法与免疫共沉淀试的步骤相似，只是在免疫抗体-目的蛋白复合物与免疫沉淀剂混合前，先对细胞裂解物进行特定的前处理，例如交联剂处理和核酸酶处理等，以稳定蛋白质与染色质之间的相互作用并减少非特异性结合。

免疫共沉淀试和染色质免疫共沉淀试是研究蛋白质功能和染色质结构与调控的重要工具，也有助于深入理解许多疾病的发病机制及其治疗策略的开发。

赛默飞世尔科技免疫沉淀技术指南和实验方案说明书

“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的结合蛋白，进行小规模的蛋白质亲和纯化的实验。更确切地说， IP 是采用固定在微珠支持物 ( 一般是琼脂糖树脂 ) 上的特定抗体，从复杂的混合物中，纯化单一抗原的实验。固定化蛋白质复合物的组装既可以分步进行，也可以一步完成 ( 图 1)。常见的加样顺序：抗体和样本 ( 如细胞裂解物 ) 一起孵育，然后加入亲和微珠，用于捕获抗体 - 抗原复合物。也可以将抗体和微珠 ( 通过抗体结合蛋白，如蛋白 A、G 或 A/G 等，直接或间接结合抗体 ) 先进行孵育，然后再加入含有抗原的样本。当抗原、抗体和固相支持物产生结合以后，充分洗涤微珠，再采用适当的洗脱缓冲液从支持物上洗脱抗原。在设计 IP 实验时应考虑诸多因素 ( 包括加样顺序等 )，后续章节中将会一一进行讨论。
赛默飞世尔科技 www.thermo /proteinbiology 服务热线： 800 810 5118 400 650 5118 客服信箱：LifeScience-CNTS@thermo
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IP、Co-IP 和 Pull-Down 实验的通用介绍
A. 免疫沉淀 (IP)
最早的免疫沉淀方法，是将放射性前体 ( 如氨基酸 ) 加入细胞培养基中，使得细胞在生长的过程中，总蛋白可以直接被标记。裂解细胞后，利用固定在微珠支持物上的特异抗体，从蛋白混合物中纯化获得抗原。纯化所得抗原用 SDSPAGE 分离后，再通过放射自显影，将凝胶上的放射性信号显示到胶片上。
这种放射性免疫检测方法仍在使用，但有关放射性材料使用的安全性、监管和成本问题促进了非同位素方法的开发。不同于预先标记抗原，现在更常见的方法是从裂解物中纯化抗原，采用 SDS-PAGE 分离，然后转印至膜上进行 Western Blotting 检测。灵敏的化学发光底物的问世，意味着该方法可以轻松达到与放射性技术相当的灵敏度，在抗体亲和力一致的条件下，提供了更高的特异性。

Pierce™ 经典磁珠式免疫沉淀免疫共沉淀试剂盒 88804

说明书Pierce™经典磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒888042287.3 货号描述88804 Pierce经典磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒，包含足够完成40个反应的试剂，每个反应使用25 µL磁珠试剂盒组成:Pierce 蛋白 A/G 磁珠1 mL，贮存于含有 0.05% NaN3的水中，浓度为10 mg/mLPierce 免疫沉淀裂解/漂洗缓冲液，2 × 50 mL，pH 7.4，0.025M Tris，0.15M NaCl，0.001MEDTA，1% NP40，5% 甘油电泳上样电泳上样缓冲液，非还原性，（5×），5 mL，pH 6.8，0.3M Tris HCl，5% SDS，50%甘油，泳道标记示踪染料洗脱缓冲液，5 mL，pH 2.0中和缓冲液，0.5 mL，pH 8.5贮存条件: 收到本产品后于4°C贮存。

冰盒运输。

目录列表产品简介 (2)流程简述 (2)重要产品信息 (2)所需额外试剂和仪器 (3)Pierce经典磁珠式免疫沉淀试剂盒流程 (4)A. 免疫复合物的制备 (4)B. 手动免疫沉淀 (4)C. 自动免疫沉淀 (5)问题解决 (7)网站附加信息 (8)Thermo Scientific KingFisher 仪器常见问题 (8)Thermo Scientific相关产品 (9)产品简介Thermo Scientif ic™ Pier ce™经典磁珠式免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒能够高效完成抗原免疫沉淀（IP）及免疫共沉淀（Co-IP）实验，抗体用量小于10 μg且无需离心。

首先，将特异性的抗体加入样品中与目标抗原形成免疫复合物，然后将其结合在蛋白A/G磁珠上。

通过漂洗去除未结合物质后，用低pH的洗脱液将免疫复合物从蛋白A/G 磁珠上洗脱下来。

或者，当样品是为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验作准备时，可以使用变性条件洗脱免疫复合物，即用试剂盒提供的电泳上样缓冲液( Lane Marker Sample Buffer)。

免疫共沉淀(Co-IP)

1免疫共沉淀一、实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP），是利用抗原A 与蛋白B 结合，通过A 的抗体（钥匙）沉淀A （锁），再利用精制的prorein A/G （钥匙链）预先结合到磁珠上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，磁珠上的prorein A/G 就能吸附抗原，从而获得抗原A 与蛋白B 的复合体，之后就可以对B 进行检测，从而获得蛋白质与蛋白质相互作用的信息。

二、Co-IP 标准化操作流程样品裂解（裂解液）→样品的预纯化（normal IgG/微珠）→与目标蛋白抗体共孵育（IP 抗体、Normal IgG ）→免疫共沉淀（微珠）→微珠清洗（裂解液）→洗脱→WB 分析或其他分析（WB/一抗、二抗）（一）样品裂解 1.温和裂解（1）温和的裂解液进行裂解，常用的去垢剂成分：NP-40、TritonX-100、IGEPAL CA-630、CHAPS ；（2）成品buffer ；（3）添加蛋白酶抑制剂（防止蛋白被降解）。

2.样本制备流程（1）去掉培养基，用冰PBS 清洗一次。

2（2）去掉PBS，每个板（10cm ）中加0.5mL 冰预冷的1×细胞裂解液，在冰上孵育5min 。

（3）将所有细胞刮下，收集到离心管，置于冰上。

（4）冰浴中对样品用超声处理3次，每次5s 。

（此步骤对膜蛋白提取有较好作用）（5）4 ℃，14000g 离心10min ，将上清转移到新的离心管中，即为细胞裂解物。

（6）BCA 测定浓度。

3.注意事项（1）整个过程冰上操作。

（2）IP 样本一般建议新鲜制备并立即使用，如有需要，可保存在-80 ℃。

（二）预纯化 1.阴性对照的选择与IP 抗体同源同型（亚型）的抗体：如 Rabbit IgG ；Mouse IgG1等。

取与IP 实验等量的裂解液，使用Isotype Control 孵育；与IP 抗体孵育同时进行。

2.Isotype Control 选择3.预纯化的目的（1）减少裂解混合物中的非特异性蛋白的含量。

免疫共沉淀详细操作方法

免疫共沉淀详细操作方法免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种常用的蛋白质亚细胞定位、相互作用以及鉴定蛋白质结构和功能的实验方法。

它基于抗体与特定的抗原的非共价结合，通过这种特异性识别和结合，可以将目标蛋白质从混合溶液中富集出来。

下面将为您详细介绍免疫共沉淀的操作步骤：1.制备样品：-收集需要分析的生物样品（如细胞或组织），并在冰上快速移至离心管中，避免样品被降解。

-加入细胞裂解液：将离心管放入冰上，加入细胞裂解液（含有蛋白酶抑制剂）使细胞完全裂解。

-离心：将样品进行离心，去除细胞碎片和细胞核等杂质。

- 确定样品浓度：使用蛋白质浓度检测方法，如BCA法或Bradford 法，测定样品中的总蛋白质浓度。

2.抗体偶联：-预处理蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶：向蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中加入足够的磷酸盐缓冲液，摇匀致溶，并将其放置在冰上。

-加入抗体：根据需要添加用于免疫共沉淀的抗体到磷酸盐缓冲液中，每次添加约10-20μg抗体。

-偶联抗体：将抗体与蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中的磷酸盐缓冲液混合，放置在冰上静置30分钟以上。

- 离心：将含有抗体的磷酸盐缓冲液进行离心，去除沉淀，得到滴度为1mg/mL的液体。

3.预结合抗体与琼脂糖的结合：- 加入琼脂糖磷酸盐瓶：将经离心的滴度为1mg/mL的抗体溶液加入含有蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中，放置在冰上静置过夜。

-离心：离心管中的混悬物进行离心，除去上清液，得到含有预结合抗体的固体。

4.免疫共沉淀：-加入样品：将样品加入到含有预结合抗体的蛋白A/G琼脂糖磷酸盐瓶中，放置在冰上静置2-4小时或过夜，使抗体结合到目标蛋白质上。

-离心：将混合物进行离心，去除上清液。

-洗涤：加入洗涤缓冲液，使混合物重悬，轻轻混匀，然后离心去除上清液，重复此步骤2-4次。

-溶解蛋白质或沉淀：根据需求，可以选择加入蛋白酶抑制剂和PBS 溶解蛋白质或沉淀物。

5.应用：-SDS-：使用SDS-技术，将免疫共沉淀的样品和对照样品进行分离。

免疫共沉淀protocol

免疫共沉淀实验技术（IP）一、原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

1、实验仪器：高速组织捣碎机：SWISS KINEMATIC Ltd. Co（型号：PT1600E）电泳仪：北京六一仪器厂（型号：DYY-8C）电泳槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-24D）转印槽：北京六一仪器厂（型号：DYCZ-40D）低温高速离心机：Sigma 公司（型号：Sigma 2-16k）超低温冰箱：SANYO（型号：MDF-382E）分光光度计：上海尤尼柯（型号：WFZ-UV-2000）脱色摇床：上海琪特分析仪器有限公司（型号：STS-2）2、主要试剂：HRP标记山羊抗小鼠二抗：北京中山（货号：ZB-2305）蛋白质预染分子量marker：FermentasA蛋白-sepharose珠：Pharmacia Biotech公司产品NC膜：Millipore公司（型号：0.45um）化学发光底物底物：PIERCE公司电泳类生化试剂均为美国amresco公司产品其他生化试剂为国药集团上海化学试剂公司产品总蛋白测定试剂盒：南京建成生物工程研究所二、操作流程1、样品准备1）取细胞加入500μl上样Buffer(无溴酚蓝)和50ul 10mg/ml PMSF，混匀，超声波破碎细胞2）4℃，12000rpm离心10min3）取上清夜，-70℃冻存24hr5）4℃12000rpm再次离心10min，取上清分装，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚蓝(0.1%(W/V))后于100℃加热4min，后于-20℃保存待用。

2、定蛋白及计算电泳上样量根据总蛋白测定试剂盒说明书操作测定样本中的总蛋白含量，电泳上样量定为40ug3、免疫沉淀1）准备A蛋白-Sepharose珠：用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠2）准备A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物：按每50 μl A蛋白-Sepharose珠中加入10ul 一抗，4℃孵育1 h，8000rpm离心5 min，PBS洗涤3次，加50ulPBS3）取100 μg总蛋白，加入50ul A蛋白-Sepharose珠.一抗复合物，4℃轻摇2h，PBS洗涤3次，之后加入50ul 1×SDS凝胶上样缓冲液，100℃变性3 min，以游离抗原、抗体、珠子，8000 rpm室温离心5 min，蛋白上清储于-20℃备用。

免疫共沉淀中文使用说明书(Pierce26149)

Pierce® Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit（26149）中文说明书介绍：Thermo 公司的Pierce®免疫共沉淀试剂盒，可通过将铆钉抗体固定在琼脂糖支撑物上，从裂解液中或其他复杂混合物中，分离出天然蛋白复合物。

Co-IP是一种研究蛋白与蛋白相互作用通用的方法，该方法使用一种诱饵蛋白与抗原进行免疫沉淀反应，然后可通过免疫共沉淀任何与诱饵蛋白具有相互作用的猎物蛋白。

传统的Co-IP方法使用蛋白A或G共同洗脱抗体的重链和轻链，这很可能导致将相关的蛋白一起洗脱下来，掩盖一些重要的结果。

Pierce®免疫共沉淀试剂盒通过将共价结合抗体固定在一个胺类活性反应树脂上解决了这一问题。

该试剂盒包含足够的用于蛋白结合和恢复的缓冲液，完成对照试验的高校离心柱和收集管，这些产品进一步缩短了操作实验的时间。

重要产品信息：略Co-IP实验步骤：A.抗体固定注意：以下试验步骤是针对用无胺和其他载体蛋白稀释的10-75μg亲和纯化抗体（参考重要产品信息一节）。

根据实际使用比例参考这一协议步骤。

参考重要产品信息节表1中的建议抗体用量和树脂体积用量。

1.室温平衡胺连接耦合树脂（AminoLink®Plus Coupling Resin）和试剂；2.为每个Co-IP反应准备2ml 1×Coupling Buffer（超纯水稀释20×Coupling Buffer）；3.轻轻涡旋混匀装有AminoLink®Plus Coupling Resin的瓶子，使其处于悬浮状态。

使用大口径（或剪掉一段枪头端），添加50μl树脂悬液到Pierce提供的离心柱中，将离心柱放入微量离心管中，1000g离心1min，弃滤液；4.添加200μl 1×Coupling Buffer 清洗树脂2次，离心弃滤液；5.将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除剩余的液体，插上底塞；6.准备10-75μg亲和纯化抗体用于结合蛋白，调整体积至200μl，使用足够的超纯水和20×Coupling Buffer来制备1×Coupling Buffer。

免疫共沉淀详细操作方法

免疫共沉淀详细操作方法一、准备实验材料和试剂1.细胞培养基和细胞培养酶：根据实验需要选择不同种类的培养基和酶。

2.细胞系：选择适当的细胞系，如HEK293T细胞等。

3.抗体：选择特异性强、亲和力高的单克隆或多克隆抗体。

4. 蛋白提取缓冲液：例如，含10 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100、0.5% NP-40等。

5.磷酸盐缓冲液：例如，PBS（含1.5mMKH2PO4、6.5mMNa2HPO4、137mMNaCl、2.7mMKCl，pH7.4）。

6. 免疫共沉淀缓冲液：例如，含50 mM Tris-HCl（pH7.4）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、0.5% NP-40、5%甘油。

7.带有亲和树脂的免疫沉淀缓冲液：例如，蛋白A或蛋白G亲和树脂结合的PBS。

二、细胞处理和蛋白质提取1.培养细胞：将细胞培养在合适的培养基中，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养至适当的细胞数。

2.细胞刺激：根据实验需要，将细胞进行刺激处理，如药物刺激、细胞因子刺激等。

3.细胞裂解：将培养的细胞用蛋白提取缓冲液裂解，放在冰上离心，使细胞溶解并得到细胞裂解液。

4.蛋白质含量测定：使用BCA或其他合适的方法测定细胞裂解液中蛋白质的含量。

三、制备免疫复合物1.免疫数据：将所需的抗体预先装载到蛋白A或蛋白G亲和树脂上。

2.预清洗亲和树脂：将亲和树脂与免疫共沉淀缓冲液混合，使其均匀混合，然后以适当的速度离心，去除上清液。

3.免疫共沉淀：将适当量的蛋白质样品加入预清洗的亲和树脂和免疫共沉淀缓冲液中，使其充分混合，并以适当的速度旋转培养，使抗体与目标蛋白结合形成免疫复合物。

4.温和洗涤：使用免疫共沉淀缓冲液轻轻洗涤免疫复合物，以去除非特异性结合的蛋白质。

四、蛋白质沉淀1.洗涤亲和树脂：使用洗涤缓冲液多次洗涤亲和树脂，以去除非特异性结合的蛋白质。