细胞计数与细胞增
细胞计数实验原理
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。
2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3. 计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：
细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104
说明：公式中除以4，因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3而1ml=1000mm3
（注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液）
细胞计数与存活测试
1. 原理：
1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。
1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形，
其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方
盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计
数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞
数目。
细胞计数要点：
①进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于1×107 L-1，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。
细胞增殖和活力
CFSE标记的细胞的激发和发射波长分别为500 nm和520 nm
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6. CCK8检测法
是一种基于WST‐8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的 快速高灵敏度检测方法。CCK‐8细胞活性检测试剂中含 有WST‐8：2‐(2‐甲氧基‐4‐硝基苯基)‐3‐(4‐硝基苯 基)‐5‐(2,4‐二磺酸苯)‐2H‐四唑单钠盐]。 WST‐8是一种 类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下， 可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒产 物formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒 性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和 细胞数目呈线性关系。
理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调 整。
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注意事项-避免血清干扰
用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血 清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本 底增加，会试验敏感性。
一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈 色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
23
谢谢！
24
谢谢！
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注意事项-药物浓度的设定
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较 大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓 度和时间范围再细筛。
切记！ 否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的
有效浓度和时间。
6.1细胞的增殖(50张PPT)
多细胞生物：受精卵发育成多细胞个体；
细胞
组织
器
植物体
官
细胞
组织
器
系
人
官
统
体
补充衰老、死亡的细胞；
阅读提问：
1、细胞增殖的意义是什么？
是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础
2、细胞通过 分裂 方式进行增殖细胞在分裂
之前，必须进行一定的物质准备，细胞增殖包
括物质准备和细胞分裂整个连续过程
0
条染色单体、
4 个DNA分子。
8个 条染色体、
实验原理：在高等植物体 内，有丝分裂常见于根 尖、芽尖等分生区细胞。 通过高倍显微镜观察各 个时期细胞内染色体的 存在状态。染色体容易 被碱性染料（如龙胆紫 溶液）着色。
成熟区
伸长区 分生区 根冠
步骤
注意问题
分析
一、根尖的培养：实验前3~4天，让洋 置于温暖处，常 因为细胞分裂和生长需要水
A．应该选一个处于间期的细胞，持续观察它从间期到末期的全 过程 B．如果在低倍镜下看不到细胞，可改用高倍物镜继续观察 C．如果在一个视野中不能看全各个时期，可移动装片从周围细 胞中寻找 D．如果视野过暗，可以转动细准焦螺旋增加视野的亮度
。2. 一份耕耘，份收获，努力越大，收获越多，奋斗!奋斗!奋斗!3. 让我们将事前的忧虑，换为事前的思考和计划吧！4. 世界上那些最容易的事情中，拖延时间最不费力5. 不管现在有多么艰辛，我们也要做个生活的舞者。6. 奋斗是万物之父。— —陶行知7. 上帝制造人类的时候就把我们制造成不完美的人，我们一辈子努力的过程就是使自己变得更加完美的过程，我们的一切美德都来自于克服自身缺点的奋斗。8. 不要被任何人打乱自己的脚步，因为没有谁会像你一样清楚和在乎自己 的梦想。9. 时间不在于你拥有多少，只在于你怎样使用10. 水只有碰到石头才能碰出浪花。11. 嘲讽是一种力量，消极的力量。赞扬也是一种力量，但却是积极的力量。12. 在我们成长的路上也会遇到一些挫折，一些困难，那韩智华就是我们 的榜样，永不认输，因为我知道挫折过后是一片晴朗的天空，瞧，成功就在挫折背后向我们招手，成功就是在努力的路上，“成功就在努力的路上”！让我们记住这句话，向美好的明天走去。13. 销售世界上第一号的产品——不是汽车，而 是自己。在你成功地把自己推销给别人之前，你必须百分之百的把自己推销给自己。14. 不要匆忙的走过一天又一天，以至于忘记自己从哪里来，要到哪里去。生命不是一场速度赛跑，她不是以数量而是以质量来计算，知道你停止努力的那 一刻，什么也没有真正结束。15. 也许终点只有绝望和失败，但这绝不是停止前行的理由。16. 有事者，事竟成；破釜沉舟，百二秦关终归楚；苦心人，天不负；卧薪尝胆，三千越甲可吞吴。17. 我颠覆了整个世界。只为了摆正你的倒影18. 好的想法是十分钱一打，真正无价的是能够实现这些想法的人。19. 伤痕是士兵一生的荣耀。20. 只有一条路不能选择——那就是放弃的路；只有一条路不能拒绝——那就是成长的路。21. 多对自己说“我能行，我一定可以”，只有这样才不 会被“不可能”束缚，才能不断超越自我。22. 人生本来就充满未知，一切被安排好反而无味——坚信朝着目标，一步一步地奋斗，就会迈向美好的未来。23. 回避现实的人，未来将更不理想。24. 空想会想出很多绝妙的主意，但却办不成任 何事情。25. 无论什么思想，都不是靠它本身去征服人心，而是靠它的力量；不论靠思想的内容，而是靠那些在历史上某些时期放射出来的生命的光辉。——罗曼·罗兰《约翰·克利斯朵夫》26. 上帝助自助者。27. 你的爸妈正在为你奋斗，这 就是你要努力的理由。28. 有很多人都说：平平淡淡就福，没有努力去拼博，又如何将你的人生保持平淡?又何来幸福?29. 当事情已经发生，不要抱怨，不要沮丧，笑一笑吧，一切都会过去的。30. 外在压力增加时，就应增强内在的动力。31. 我们每个人都应微笑面对人生，没有了怨言，也就不会有哀愁。一个人有了希望，就会对生活充满信心，只要你用美好的心灵看世界，总是以乐观的精神面对人生。32. 勇敢的人。——托尔斯泰《袭击》33. 昨天下了雨，今天刮了风，明天太 阳就出来了。34. 是的，成功不在于结果，更重要的是过程，只要你努力过，拼搏过，也许结果不一定是最好的那也走过了精彩的过程，至少，你不会为此而后悔。35. 每一天的努力，以后只有美好的未来。每一天的坚持，换来的是明天的辉 煌。36. 青年最要紧的精神，是要与命运奋斗。——恽代英37. 高峰只对攀登它而不是仰望它的人来说才有真正意义。38. 志不可立无可成之事。如无舵之舟，无衔之马，飘荡奔逸，何所底乎？--王守仁39. 拿望远镜看别人，拿放大镜看自己。 40. 顽强的毅力可以征服世界上任何一座高峰。——狄更斯41. 士人第一要有志，第二要有识，第三要有恒。——曾国42. 在我们能掌控和拼搏的时间里，去提升我们生命的质量。43. 我们不是等待未来，我们是创造未来，加油，努力奋斗。 44. 人生如画，一笔一足迹，一步一脚印，有的绚丽辉煌，有的却平淡无奇。45. 脚跟立定以后，你必须拿你的力量和技能，自己奋斗。——萧伯纳46. 一个能从别人的观念来看事情，能了解别人心灵活动的人，永远不必为自己的前途担心。
白细胞计数与分类计数
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白细胞计数与分类计数
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白细胞计数与分类计数
【参考值】
白细胞计数
成人（4～10）×109 /L
儿童（5～12）×109 /L
新生儿（15～20）×109 /L
白细胞分类计数（成人）
相对值绝对值
中性杆状核粒细胞 1%～5% （0.04～0.5）×109 /L
中性分叶核粒细胞 50%～70% (2～7)×109 /L
嗜酸性粒细胞 0.5%～5% (0.05～0.5)×109 /L
嗜碱性粒细胞 0%～1% (0～1)×109 /L
淋巴细胞 20%～40% (0.8～4)×109 /L
单核细胞 3%～8% (0.12～0.8)×109 /L
【临床意义】
白细胞总数高于参考值上限称白细胞增多，低于参考值下限为白细胞减少。其增多和减少主要受中性粒细胞数量的影响，淋巴细胞等数量的改变也会引起白细胞总数的变化。白细胞总数改变的临床意义详见白细胞分类计数的相关临床意义。
外周血涂片经Wright染色后观察其形态，可将白细胞分为5种类型，即中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，各种白细胞的特点及其变化的临床意义如下：
1.中性粒细胞
（1）中性粒细胞增多（neutrophilia）中性粒细胞增多常伴随白细胞总数的增多。
细胞计数与细胞增
支原体污染
95％以上是以下四种支原体：
•口腔支原体（M.orale） •精氨酸支原体（M.arginini） •猪鼻支原体（M.hyorhinis） •牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）
危害：
世界性问题，平均发生率达到11% 能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达 不能通过可视法对其进行检测 对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染 来源： •操作环境不良 •操作人员的疏失 •实验器具不洁等 •已受污染的细胞 •已受污染的培养基、血清
2．细胞活力 ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 ④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数， 计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞， 活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力 测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液 对原细胞悬液的加倍稀释作用。
细胞污染
细菌污染 真菌污染 细菌和真菌的清除 支原体污染 支原体的清除
细菌污染
细胞培养常见的污染 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰 氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
白细胞计数与分类计数
白细胞计数与分类计数
【参考值】
白细胞计数
成人（4～10）×109/L
儿童（5～12）×109/L
新生儿（15～20）×109/L
白细胞分类计数（成人）
相对值绝对值
中性杆状核粒细胞1%～5%（0.04～0.5）×10
9/L
中性分叶核粒细胞50%～70%(2～7)×10
9/L嗜
酸性粒细胞0.5%～5%(0.05～0.5)×10
9/L
嗜碱性粒细胞0%～1%(0～1)×10
9/L
淋巴细胞20%～40%(0.8～4)×10
9/L
单核细胞3%～8%(0.12～0.8)×10
9/L
【临床意义】
白细胞总数高于参考值上限称白细胞增多，低于参考值下限为白细胞减少。
其增多和减少主要受中性粒细胞数量的影响，淋巴细胞等数量的改变也会引起白
细胞总数的变化。白细胞总数改变的临床意义详见白细胞分类计数的相关临床意
义。
外周血涂片经Wright染色后观察其形态，可将白细胞分为5种类型，即中
性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，各种白细胞的
特点及其变化的临床意义如下：
1.中性粒细胞
（1）中性粒细胞增多（neutrophilia）中性粒细胞增多常伴随白细胞总
数的增多。
生理情况下，外周血白细胞及中性粒细胞一天内存在着变化，下午较清晨为
高。
剧烈运动（或重体力劳动）、饱餐或淋浴后、高温或严寒、情绪激动和剧痛
都可使白细胞暂时性增多。
妊娠中晚期及分娩时白细胞增多，于分娩后2～5天恢复至孕前水平。
病理性增多见于：
①急性感染：尤其是化脓性球菌感染为最常见原因。此外，某些杆菌（大
肠杆菌、绿脓杆菌）、病毒（乙脑、流行性出血热）、真菌和放线菌、立克次体、
细胞培养之细胞计数
细胞培养之细胞计数
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
一.准备工作：
取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用.
二.细胞悬液制备：
用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS 等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数：
1.取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑。活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
细胞悬液的细胞数/ml＝（四个大格子细胞数/4)×2×104
说明：/4因为计数了4个大格的细胞数；×2因细胞悬液：染液=1：1稀释；×104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm×1.0mm×0.1mm＝0.1mm3而 1ml＝1000mm3
四.细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
血液中的白细胞计数与感染疾病的关系
血液中的白细胞计数与感染疾病的关系
血液中的白细胞计数是评估人体免疫系统健康状况的重要指标之一。白细胞是人体免疫系统的重要成分，它们在感染疾病的过程中扮演了
关键的角色。本文将探讨血液中的白细胞计数与感染疾病的关系，并
阐述白细胞计数异常对诊断和治疗的重要意义。
一、白细胞计数的基本概念
白细胞计数是指血液中每微升的白细胞数量。正常情况下，成年人
的白细胞计数范围约为4000-10000个/μL，而儿童和婴儿的计数范围则
稍有不同。白细胞主要由粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸细胞和
嗜碱细胞组成，它们各自具有不同的功能，在维护机体免疫稳态中发
挥重要作用。
二、白细胞计数与感染疾病的关系
感染疾病是指由病原微生物侵入机体引起的疾病，如细菌感染、病
毒感染、真菌感染等。在感染过程中，机体会产生炎症反应，以应对
病原微生物的侵袭。白细胞则是免疫系统主要参与者，它们通过不同
的方式对抗病原微生物，维持机体的免疫防御能力。
1. 炎症反应与白细胞计数
感染疾病引起炎症反应是和白细胞计数增高密切相关的现象之一。
当机体感染时，病原微生物通过刺激免疫系统释放细胞因子，如肿瘤
坏死因子、白细胞介素等，刺激骨髓细胞增殖并释放更多的白细胞进
入血液。这种增加导致白细胞计数升高，称为白细胞增多。
2. 白细胞计数与病原微生物种类关系
在感染过程中，不同类型的病原微生物对白细胞计数的影响有差异。细菌感染往往会引起中性粒细胞增多，而病毒感染则可能导致淋巴细
胞增多。这是因为不同类型的病原微生物会引发不同的免疫反应，而
不同类型的白细胞则在免疫应答中起到不同的作用。
白细胞分类计数及临床意义
白细胞分类计数及临床意义
白细胞是人体免疫系统的重要组成部分，其分类计数可以帮助医生了解患者的免疫状态，协助诊断和治疗疾病。以下是对白细胞分类计数的详细解释及其临床意义：
1.中性粒细胞计数：正常范围为（
2.5-7.5）×10^9/L。当中性粒细胞计数增加时，可能表示存在感染、炎症或肿瘤。而当中性粒细胞计数减少时，可能表示存在病毒感染、药物反应或自身免疫性疾病等。
2.淋巴细胞计数：正常范围为（1.2-
3.2）×10^9/L。当淋巴细胞计数增加时，可能表示存在病毒感染、结核病、百日咳等。而当淋巴细胞计数减少时，可能表示存在免疫缺陷、辐射暴露或营养不良等。
3.单核细胞计数：正常范围为（0.2-0.8）×10^9/L。单核细胞计数的变化与感染、炎症和肿瘤等疾病有关。
4.嗜酸性粒细胞计数：正常范围为（0.05-0.5）×10^9/L。嗜酸性粒细胞计数的增加可能与过敏、寄生虫感染或皮肤病有关。而其减少可能表示存在严重创伤、手术或药物反应等。
5.嗜碱性粒细胞计数：正常范围为（0-0.1）×10^9/L。嗜碱性粒细胞计数的增加可能与过敏、炎症或肿瘤有关。而其减少可能表示存在肾上腺皮质功能减退或骨髓抑制等。
了解白细胞分类计数的正常范围及其临床意义，有助于医生对患者的病情进行准确诊断和治疗。
医院常见化验指标
红细胞减少多见于各种贫血，如急性、慢性再生障碍性贫血、缺铁性贫血等。
红细胞增多常见于身体缺氧、血液浓缩、真性红细胞增多症、肺气肿等。
2、血红蛋白测定(Hb)
[正常参考值]
男：120-160g/L(12-16g/dL)。
女：110-150g/L(11-15g/dL)。
儿童：120-140g/L(12-14g/dL)。
[临床意义]
生理性白细胞增高多见于剧烈运动、进食后、妊娠、新生儿。另外采血部位不同，也可使白细胞数有差异，如耳垂血比手指血的白细胞数平均要高一些。
病理性白细胞增高多见于急性化脓性感染、尿毒症、白血病、组织损伤、急性出血等。
病理性白细胞减少再生障碍性贫血、某些传染病、肝硬化、脾功能亢进、放疗化疗等。
4、白细胞分类计数(DC)
表2多参数血液细胞分析[血常规)化验单打印样式
(日本光电MEK6108K型)
日期和时间17/AUG/9816:12
标本编号NO.0113
白细胞WBC 7.7x109/L
淋巴细胞百分比LY% 23.3%
中间细胞百分比MO% 8.3%
粒细胞百分比GR% 68.4%
淋巴细胞绝对值LY 1.8x109/L
中间细胞绝对值MO 0.6x109/L
7、全血还原比粘度（低切）正常情况：低于男：14～20女：12～21
血细胞计数
血细胞计数
【目的和要求】掌握计数方法,原理及临床意义.
一、红细胞计数
成熟的红细胞为一高度分化的无核细胞（骆驼和家禽除外）。动物体内每天有一定数量的红细胞因衰老而死亡，同时又有相应数量的红细胞生成进入血液循环，以维持动态平衡，当这种平衡被破坏后，即可引起红细胞数量的变化，所以临床上常把计数红细胞和测定血红蛋白结合起来诊断动物贫血并将其分型。
【原理】红细胞计数是将一定量的血液经过稀释后，充入特制的细胞计数板的计数池内，在显微镜下计数规定区域内的红细胞数，而后换算出每升血液中的红细胞数（*1012个/L）【器材与试剂】
器材：纽巴氏（Neubauor）计数板（结构见图1），沙利氏三用吸管，试管，5ml吸管，血盖玻片，手揿计数器，显微镜。
试剂：红细胞稀释液：0.85%的氯化钠溶液或赫母（Hayem）氏液（取氯化钠 1.0g、结晶硫酸钠5.0 g、氯化高汞 0.5 g，以200.0ml蒸馏水溶解，加数滴碳酸品红）两液任选一种。【操作步骤】
1. 用5ml吸管吸取红细胞稀释液3.98ml，置于试管内。
2. 用三用吸管吸取全血至20ul处，擦去管外血液，将管内血液慢慢吹入上述试管底部，吸取上层稀释液反复清洗吸管内壁，轻轻混匀。
3. 用毛细吸管（三用管亦可）吸取混匀的血液稀释液，充入已盖有血盖片的计数板的计数池内，2～3分钟后即可计数。
4.将计数板装在显微镜上，在１０倍镜下找到计数的中央大方格，选择5个中方格（四角与中央的中方格或对角线的5个中方格,见图2和图3），转至４０倍镜下计数。
5.计数规则为：计左不计右（压左线取，压右线舍），计上不计下（压上线取，压下线舍）。【计算】红细胞数/升=X*5*10*200*106=X*1010/升
白细胞计数及白细胞分类计数
3.嗜碱性粒细胞
胞体圆形，类似中 性粒细胞大小。、 胞浆内充满排列不 均匀的黑蓝色嗜碱 性颗粒，其颗粒内 含有组织胺、肝素、 慢反应物质等，其 功能与速发性过敏 反应有关。胞核2-3 叶。
4.淋巴细胞
6-10μm
10-15μm
淋巴细胞胞体呈圆形或椭 圆形。大淋巴细胞胞质丰 富呈蔚蓝色，内含少量紫 红色嗜天青颗粒；小淋巴 细胞胞质很少，甚至缺如， 呈深蓝色。胞核呈圆形、 椭圆形，染色质聚集成块 状。
骨髓像 碱性磷酸酶
类白血病反应
慢粒
有原发疾病
无
原发病症状明显
消瘦、乏力、低热、明显脾 肿大
中度增高，以分叶和干状 显著增高，可见各发育阶段
为主
的细胞
不增多
常增多
常明显
不明显
无明显变化
早期贫血，Plt增多，晚期均 减少
一般无明显变化 积分显著增高
极度增生，粒系占90%以上 积分显著减低，甚至为0
（二）嗜酸性粒细胞
0.02-0.5
绝对值×109/L
0-0.1
0.8-4 0.12-0.8
血液细胞分析仪的工作原理
20世纪50年代，Coulter研制了电阻抗法血液 细胞分析仪.
直方图
白细胞的生理变化
年龄之间有差异：婴儿、新生儿、成人 不同的身体状态有差异； 一天内的不同时期也有变化。
白细胞计数与分类计数
白细胞计数与分类计数
【参考值】
白细胞计数
成人〔4～10〕×109 /L
儿童〔5～12〕×109 /L
新生儿〔15～20〕×109 /L
白细胞分类计数〔成人〕
相对值绝对值
中性杆状核粒细胞 1%～5% 〔0.04～0.5〕×109 /L
中性分叶核粒细胞 50%～70% (2～7)×109 /L
嗜酸性粒细胞 0.5%～5% (0.05～0.5)×109 /L
嗜碱性粒细胞 0%～1% (0～1)×109 /L
淋巴细胞 20%～40% (0.8～4)×109 /L
单核细胞 3%～8% (0.12～0.8)×109 /L
【临床意义】
白细胞总数高于参考值上限称白细胞增多，低于参考值下限为白细胞减少。其增多和减少主要受中性粒细胞数量的影响，淋巴细胞等数量的改变也会引起白细胞总数的变化。白细胞总数改变的临床意义详见白细胞分类计数的相关临床意义。
外周血涂片经Wright染色后观察其形态，可将白细胞分为5种类型，即中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，各种白细胞的特点及其变化的临床意义如下：
〔1〕中性粒细胞增多〔neutrophilia〕中性粒细胞增多常伴随白细胞总数的增多。
生理情况下，外周血白细胞及中性粒细胞一天内存在着变化，下午较清晨为高。
剧烈运动〔或重体力劳动〕、饱餐或淋浴后、高温或严寒、情绪激动和剧痛都可使白细胞暂时性增多。
妊娠中晚期及分娩时白细胞增多，于分娩后2～5天恢复至孕前水平。
病理性增多见于：
①急性感染：尤其是化脓性球菌感染为最常见原因。此外，某些杆菌〔大肠杆菌、绿脓杆菌〕、病毒〔乙脑、流行性出血热〕、真菌和放线菌、立克次体、螺旋体〔梅毒〕、寄生虫〔肺吸虫〕等都可使白细胞总数和中性粒细胞增多。
白细胞计数与分类计数
白细胞计数与分类计数
参考值
白细胞计数
成人4～10×109/L
儿童5～12×109/L
新生儿15～20×109/L
白细胞分类计数成人
相对值绝对值
中性杆状核粒细胞1%～5%0.04～0.5×109/L
中性分叶核粒细胞50%～70%2～7×109/L
嗜酸性粒细胞0.5%～5%0.05～0.5×109/L
嗜碱性粒细胞0%～1%0～1×109/L
淋巴细胞20%～40%0.8～4×109/L
单核细胞3%～8%0.12～0.8×109/L
临床意义
白细胞总数高于参考值上限称白细胞增多,低于参考值下限为白细胞减少;其增多和减少主要受中性粒细胞数量的影响,淋巴细胞等数量的改变也会引起白细胞总数的变化;白细胞总数改变的临床意义详见白细胞分类计数的相关临床意义;
外周血涂片经Wright染色后观察其形态,可将白细胞分为5种类型,即中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞,各种白细胞的特点及其变化的临床意义如下：
1.中性粒细胞
1中性粒细胞增多neutrophilia中性粒细胞增多常伴随白细胞总数的增多;
生理情况下,外周血白细胞及中性粒细胞一天内存在着变化,下午较清晨为高;
剧烈运动或重体力劳动、饱餐或淋浴后、高温或严寒、情绪激动和剧痛都可使白细胞暂时性增多;
妊娠中晚期及分娩时白细胞增多,于分娩后2～5天恢复至孕前水平;
病理性增多见于：
①急性感染：尤其是化脓性球菌感染为最常见原因;此外,某些杆菌大肠杆菌、绿脓杆菌、病毒乙脑、流行性出血热、真菌和放线菌、立克次体、螺旋体梅毒、寄生虫肺吸虫等都可使白细胞总数和中性粒细胞增多;
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Hemocytometer Cell Counts
Hemocytometer
The most common routine method for cell counting which is efficient and accurate is with the use of a hemocytometer.
1 mm 0.1 mm 1 mm Volume : 0.1mm3 1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3
Dead cell
细胞计数及活力
细胞计数时的注意事项 ①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则 会影响细胞计数结果。 ②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意 这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。 ③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。 如细胞团占10%以上，说明消化不充分。 ④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当， 200 /10mm2 500 /10mm2 需重新制备细胞悬液。 ⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖 片，也不要过少或带气泡。 ⑥在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左 不数右的原则进行计数。
二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定
在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞 的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是 进行实验必不可少的一种基本技能。
1．细胞计数 ．
①将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 ②将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片 和计数板之间。 ③静置3分钟。 ④镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左 侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝（4大格细胞总数/ 4）×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细 胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备 细胞悬液。
类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 细胞在体内、 粘附方式： 方式 体内：粘附是 体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征 外形具有复杂的立体特征 具有 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般 一般与体内时明显不同 外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型
⑦染色标本在计数细胞时必须在15分钟内检查计数完毕。因为台盼蓝染液可 以将死细胞迅速地染上蓝色，再延长时间则活细胞也将逐渐着色。
细胞增殖实验（ 细胞增殖实验（MTT法） 法
(一)原理 MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT（噻唑蓝）为 基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作 用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶， formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥 珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan 结晶可以用DMSO来溶解，利用酶标仪测定570 nm处的光 密度OD值，以反映出活细胞数目。
成纤维细胞样
太酸或太碱
上皮样细胞
标准pH 标准
成纤维细胞样
细胞密度 3T3 生长状态改变 悬浮或贴附 转化与否 低密度
上皮样细胞
高密度
成纤维细胞样
悬浮
上皮样细胞
贴附
圆形
未转化
成纤维或上皮样
转化后
成纤维样
可成上皮样
悬浮生长型
概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源自血，脾或骨髓， 来源自 脾或骨髓， 特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形， 细胞圆形，单个或小细胞团 圆形 尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能
培养时：这些细胞被放到体外环境中以后, 培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某 一固相表面才能生存和生长， 一固相表面才能生存和生长，因而 属于粘附型细胞。 属于粘附型细胞。 粘附(锚定或锚着)依赖型( 粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能 细胞： 生存的细胞
!
真菌污染
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作 用而使细胞脱落死亡。
细菌和真菌的清除
使用抗生素
抗生素对杀灭细菌较有效。（当在无血清培养基中添 加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度 的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血 清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到 毒性水平）。 联合用药比单独用药效果好。 预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍药物冲洗 法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此 法在污染早期有效。
分类 根据形态大致的不同，主要 类 根据形态大致的不同，主要2类： 上皮样 成纤维细胞样 其它， 其它，不定型
上皮样细胞型
名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于 名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞 来源：来源于外胚层， 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺， 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞 形态：类似体内的上皮细胞 体内的 扁平，不规则多角形， 扁平，不规则多角形，中有圆形核
优点 生存空间大， 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化 传代方便 不需消化) 不需消化 易于收获 可获得稳定状态 缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞 很多细胞不能悬浮生长 尤以正常细胞) 尤以正常细胞
贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡， 细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液 清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明 生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可 能。悬浮细胞当边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之， 则较差或已死亡。由于培养基内有 pH 指示剂的存在，因此 它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时， 细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过 长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞 生长状态不好，或已死亡。
贴壁(粘附) 贴壁(粘附)型细胞
粘附:是大多数有机体细胞在体内 粘附:是大多数有机体细胞在体内 细胞 生存和生长发育的 生存和生长发育的基本存在方式 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 粘附于一固相表面 于一 才能生存和生长。 才能生存和生长。 生存
支原体污染
95％以上是以下四种支原体： 95％以上是以下四种支原体：
•口腔支原体（M.orale） 口腔支原体（ orale） 口腔支原体 •精氨酸支原体（M.arginini） 精氨酸支原体（ arginini） 精氨酸支原体 •猪鼻支原体（M.hyorhinis） 猪鼻支原体（ hyorhinis） 猪鼻支原体 •牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawii） 牛莱氏无胆甾原体（ laidlawii） 牛莱氏无胆甾原体
生长特点 排列成放射状， 排列成放射状，漩涡状 放射状 并不紧靠连成片， 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而 细胞 细胞接触易断开而 单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 游离的单独的成纤维样细胞， 单独的成纤维样细胞 常有几个伸长的细胞突起 常有几个伸长的细胞突起
培养细胞形态不稳定 血清 Hela pH Hela 高血清 低血清
支原体污染检测
荧光染色法 电镜检查：扫描电镜、透射电镜 电镜检查：扫描电镜、 支原体培养 聚合酶链反应(PCR)法 法 聚合酶链反应
支原体污染表现
细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓， 细胞营养液常常仍清亮但变黄 细胞生长变缓，部分细胞发 细胞生长变缓 生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。 生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。
危害： 危害：
世界性问题，平均发生率达到11% 世界性问题，平均发生率达到11% 11 能改变细胞的DNA,RNA DNA,RNA及蛋白表达 能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达 不能通过可视法对其进行检测 对细胞的生长率影响较小， 对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染 来源： 来源： •操作环境不良 操作环境不良 •操作人员的疏失 操作人员的疏失 •实验器具不洁等 实验器具不洁等 •已受污染的细胞 已受污染的细胞 •已受污染的培养基、血清 已受污染的培养基、 已受污染的培养基
2．细胞活力 ． ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 ④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数， 计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞， 活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力 测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液 对原细胞悬液的加倍稀释作用。
细ຫໍສະໝຸດ Baidu污染
细菌污染 真菌污染 细菌和真菌的清除 支原体污染 支原体的清除
细菌污染
细胞培养常见的污染 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰 氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体 荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体
荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体
Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体
扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆 形颗粒为支原体
支原体的清除
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支原体清除剂MRA （Mycoplasma Removal Agent）处理法 支原体清除剂 ） 天换一次液， 每4天换一次液，连续处理 天 天换一次液 连续处理15天 清洗纯化法 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选 细胞清洗→反复离心洗涤 优质细胞群的筛选→细胞清洗 细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生， 原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通 过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 药物辅助高温处理法 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时 小时， 先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在 ℃培养 小时，可杀 死支原体，但对细胞有不良影响。 死支原体，但对细胞有不良影响。 支原体特异性血清法 的兔支原体免疫血清可去除支原体污染， 用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原 的兔支原体免疫血清可去除支原体污染 体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性 并且5个月后仍为阴性 天即转为阴性， 个月后仍为阴性。 体生长，故经抗血清处理后 天即转为阴性，并且 个月后仍为阴性。
一、培养细胞的形态观察
体外培养的细胞主要有两种状态。一 种是能 贴附在培养支持物上的细胞，如 HeLa 细胞、 NH3T3等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞 绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞并不 贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生 长，如 HL—60，叫做悬浮型细胞，这类细胞 主要是血液原性或癌原性的细胞。
生长特点 易相连成片 易相连成片 相靠—紧密相连 成薄层 相靠 紧密相连—成薄层 铺石状 紧密相连 成薄层—铺石状 生长时呈膜状移动 生长时呈膜状移动 时呈膜状 很少脱离细胞群而单个活动 很少脱离细胞群而单个活动 脱离细胞群而
成纤维细胞样细胞
名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 培养中形态与成纤维细胞类似 来源： 中胚层间充质组织起源的组织 来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 心肌，平滑肌，成骨细胞， 形态：似体内成纤维细胞的形态 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 个 胞质向外伸出 中有卵圆形核