菌种滤纸保存法的应用

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菌种的保存方法介绍

细菌鉴定卡保存菌种[4]
本法适用于使用VITEK全自动微生鉴定仪的实验室。方法是将鉴定卡标注后直接放置-20℃冰箱保存，复苏时将鉴定卡直接从-20℃移至35℃，待小孔液体完全融化后，以无菌手续，用注射器抽吸出阳性生长孔内的液体，点种于合适平板，置 35℃孵箱内24～48小时即可。该法生化卡内的细菌反复冻融 5次，分离出的细菌效果相同。葡萄球菌属、肠杆菌属、念珠菌属存活时间不小于29 个月；肠球菌属、黄杆菌属、不动杆菌属存活时间不小于21个月,链球菌属和假单胞菌属存活时间不小于10个月。
菌种管由传统的玻璃菌种管改为0.5ml带盖塑料离心管。方法：①将塑料离心管置耐高压塑料离心管盒内并用双层报纸包好，高压蒸汽15磅15min消毒，放烤箱80℃烤干。②在净化工作台内将脱脂牛奶洗下的浓厚菌悬液用长毛细玻璃滴管加到塑料离心管的底部，每只0.2ml左右，切记不要将牛奶污染离心管口。③将加好菌液的离心管盒置20℃冰箱预冻，预冻好后把离心管盒放置到冷冻干燥机干燥箱内冻干。④冻干后在净化工作台内压好离心管盖，不抽真空。贴标签，用封口膜封离心管口。放-20℃冰箱保存。
菌种的保存方法介绍
江西省临床检验中心吴茂红
临床微生物实验室经常能够分离到一些有意义的菌种，但接种在平板上的细菌放 4℃冰箱只能保存数天，并且细菌在培养基上移种 3次后，其形态、菌落、毒力等均易发生变异[1]，监测日常工作的室内质控用标准菌株也需要长期留存。所以尽可能长期有效地留存菌种对于系统地分析当前流行株的生物学、分子生物学特征及耐药性变迁，医院感染病原学调查、新药临床研究都十分重要的意义。本文介绍几种常用的菌种保存方法
低温冷冻保存法实验室必须配备-20℃以下低温冰箱，冰箱温度越低，保存的时间越长。

菌种保藏方法及复壮技术

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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。

需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。

目前常用的菌种保藏方法有以下几种。

1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。

由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。

每隔六个月转管一次。

草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。

如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。

这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。

1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。

一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。

液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。

在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。

液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。

如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。

几种食用菌菌种保藏方法

几种食用菌菌种保藏方法食用菌菌种是指用于食用或驯化培养的真菌种类。

在保藏食用菌菌种时，主要有以下几种方法：1.冷冻保藏：将菌种置于-80℃的低温环境中。

首先，将菌种种植在琼脂平板上的单独菌落。

然后，将单独的菌落切下并置于含有30%甘油的琼脂平板上。

最后将含有菌落的琼脂平板置于-80℃的低温冷冻库中进行保存。

这种方法适合于长时间保存，但对设备和电力有一定需求。

2.雪贮法：将菌种置于冷藏室的冷湿源物质上。

首先，将菌种培养在含有菌落的琼脂平板上。

然后，将菌落保留在琼脂平板上并将其置于冷藏室中。

这种方法适用于一般食用菌的保存，在适宜的湿度和温度下，可以保存数月至一年。

3.干燥保藏：将菌种置于干燥环境中。

首先，将菌种培养在含有菌落的琼脂平板上。

然后将菌落切下并置于无菌的滤纸或多孔塑料袋中。

最后将菌种放置于干燥通风良好的地方，等待其自然干燥。

这种方法适用于一些干货类食用菌种，如香菇、平菇等。

4.培养罐保藏：将菌种保藏于培养罐中。

首先，将菌种培养在含有菌落的琼脂平板上。

然后将菌落切下并置于无菌培养罐中，加入适宜的培养基，并密封培养罐。

最后将培养罐保存在适宜的温度和湿度下。

这种方法适用于菌种的短期保藏。

5.低温干燥保藏：将菌种保藏于低温干燥器中。

首先，将菌种培养在含有菌落的琼脂平板上。

然后将菌落切下并置于低温干燥器中，通过低温干燥将其保存起来。

这种方法适用于一些低温耐受性较强的食用菌。

总结起来，以上是几种食用菌菌种保藏的方法。

选择合适的方法可根据菌种的特性、用途和预期保藏时间来确定。

在进行菌种保藏时，要注意无菌操作，避免菌种的污染或变异，并在适宜的环境条件下保存。

这将有助于保持菌种的营养价值和生物特性，以及保证其在后续使用中的质量。

各菌种保存方法的优缺点

各菌种保存方法的优缺点1．斜面低温保藏法(1)将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。

(2)保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。

酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。

此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。

缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。

2．液体石蜡保藏法(1)将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。

(2)将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

(3)用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm 为准，使菌种与空气隔绝。

(4)将试管直立，置低温或室温下保存(有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长)。

此法实用而效果好。

霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。

此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。

缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。

从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

3．滤纸保藏法(1)将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0.6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟。

(2)将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。

(3)取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。

菌种保藏方法_菌种应该怎么保存

菌种保藏方法_菌种应该怎么保存引导语：菌种应该怎么保存呢?以下是小编收集整理的关于菌种保藏方法相关内容，欢迎阅读参考!菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。

传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如*奶等常用生产菌种的保存。

传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。

培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。

若为产*菌种，则应在培养基中添加少量碳*钙。

一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。

传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传*状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原*、形成生理活*物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。

2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。

此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。

其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳*杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。

3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。

常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。

方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。

保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。

使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)，置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。

食用菌菌种保藏的方法

食用菌菌种保藏的方法
食用菌是一种广泛使用的食品，如何保存食用菌的菌种是非常重要的。

下面介绍几种常用的菌种保藏方法。

一、冷冻法
冷冻法是将菌种置于低温下，使其处于冷冻状态以达到保藏的目的。

将菌丝均匀地涂于平板上，置于-80℃的低温冷冻柜中冷冻，或将菌丝混入15%甘油溶液中，用液氮冷冻保存。

这种方法保存的菌种质量较好，保藏时间较长。

二、干燥法
将菌丝培养在无菌环境下，培养到菌丝生长至顶部时，用无菌石英砂或无菌滤纸吸干培养皿内的水分，再将石英砂或滤纸中的菌种置于无菌条件下进行干燥，然后密封保存。

这种方法使用简单，保存时间较长，但保存的菌种易受到氧气、温度和湿度等因素的影响。

三、冷藏法
冷藏法是将培养好的菌种置于低温环境下进行保存。

将培养好的菌种涂于平板上，进行初步培养，再将平板用无菌纸包好，置于4℃的冰箱中保存。

这种方法保存的菌种质量较好，但保存时间较短。

四、液氮保存法
将培养好的菌种混入15%甘油溶液中，用液氮冷冻保存。

这种方法保存的菌种质量较好，保存时间长达数年，但需要液氮存储设备。

五、糖分保藏法
将培养好的菌种混入10%蔗糖水溶液中，用常温保存。

这种方法保存的菌种质量较好，保存时间长达数年，但需要注意保藏容器的密封性。

不同的菌种保藏方法适用于不同的情况，我们需要根据实际情况选择合适的方法。

同时，在进行菌种保藏时，需要注意保藏容器的密封性、温度、湿度等因素，以确保保存的菌种质量。

实验室最常用的五种菌种保藏方法

在现代生物学研究和生物技术应用中，菌种保藏是至关重要的环节。

恰当的菌种保藏方法能够确保菌种的活性、遗传稳定性和可用性，为科学研究的持续开展以及相关产业的发展提供坚实的基础。

本文将重点介绍实验室中最常用的五种菌种保藏方法，深入探讨它们各自的特点、适用范围以及操作要点。

一、低温冷冻保藏法低温冷冻保藏法是目前最为广泛应用且效果较为可靠的菌种保藏方法之一。

其基本原理是将菌种置于超低温环境（通常为液氮温度，即-196℃）下，使菌种细胞处于极度冷冻的状态，从而抑制其代谢活动，达到长期保存的目的。

该方法具有诸多显著优点。

低温能够极大地减缓细胞的生理活动，几乎使其处于完全停滞状态，从而有效地延长菌种的存活时间。

低温冷冻保藏对菌种的遗传稳定性影响较小，经过长期保存后，菌种的特性通常能够较好地保持。

操作相对简单，只需将菌种制备成适宜的冷冻保存液，然后置于液氮罐中即可。

在具体操作时，首先要选择合适的冷冻保存液。

常用的冷冻保存液一般含有一定比例的保护剂，如甘油、二甲基亚砜等，它们能够降低细胞内冰晶的形成对细胞的损伤。

制备好冷冻保存液后，将菌种接种到冷冻保存液中，制成菌悬液。

将菌悬液分装到合适的冷冻管中，迅速放入液氮罐中进行保存。

在液氮罐中，要定期检查液氮的液位，确保菌种始终处于适宜的低温环境中。

低温冷冻保藏法适用于大多数微生物菌种的长期保存，尤其对于那些对温度敏感、容易变异的菌种，如细菌中的一些致病菌、真菌中的丝状真菌等，具有良好的保藏效果。

然而，该方法也存在一些不足之处，例如液氮的成本较高，液氮罐的储存空间有限，以及在取出菌种进行复苏时可能存在一定的风险等。

二、干燥保藏法干燥保藏法是利用菌种在干燥环境下代谢活动受到抑制的原理来实现保藏的方法。

常见的干燥保藏法包括沙土管保藏法、滤纸保藏法等。

沙土管保藏法是将菌种接种到无菌的沙土中，然后将沙土管置于干燥器中进行干燥保存。

该方法具有操作简便、成本低廉的特点。

在干燥过程中，菌种细胞内的水分逐渐散失，代谢活动减缓，从而达到保藏的目的。

滤纸片低温冷冻法保存微生物菌株的临床应用

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｉｔｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔｒａｉｎｓｂｙｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｉｆｌｍｆｒｅｅｚБайду номын сангаасｉｎｇｍｅｔｈｏｄ．
ＭｅｈｏｔｄｓＴｈｅｐｕｒｉｉｆｅｄｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｄｉｐｐｅｄｂｙｉｆｌｔｅｒｐａｐｅｒ．ｐａｃｋｅｄｗｉｔｈｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｔｕｂｅａｎｄｆｒｅｅｚｉｎｇｐｒｅｓｅｒｖｅｄａｔ一２Ｏ ℃．ＲｅｓｕｌｔｓＡｍｏｎｇｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｗｈｏｓｅｓｔｏｒｅａｇｅｔｉｍｅｗａｓ６，１２，１８，２４ｍｏｎｔｈｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｌｌｈｅｔｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅＦｕｇｉｒｔｏｓａ，
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，ＫｌｅｂｓｉｅＵａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｏ２ｚｒｅ１１￣，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｓｕｆ￣ｅｃｉｕｍ，Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ

铜绿假单胞菌菌种滤纸保存法探讨

#实验技术#铜绿假单胞菌菌种滤纸保存法探讨刘英,王磊,吴红艳,韩莉,王嘉军(三峡大学医学院病原生物学部,湖北宜昌443002)=摘要> 用设计的无需抽真空的滤纸法保存铜绿假单胞菌6年,菌株存活率为100%(30/30),保菌效果优于琼脂斜面保存法和高层半固体琼脂保存法,与真空冷冻干燥法的效果相近,但方法更经济,且简便实用。

=关键词> 铜绿假单胞菌;滤纸法;菌种保存=中图分类号> R378.911 =文献标识码> B =文章编号> 1673-5234(2009)09-0716-01[J our nal of Pathogen B iology .2009Sep;4(9):716,669.]Determining a convenient method of preserving Pseudomonas aeruginosa strainsLIU Ying ,WANG Lei,WU H ong -yan,et al (M edical Col lege of T hr ee Gor ges Univer sity ,Yichang ,H u -bei,443002,China)=Abstract > W e preserved P seudomonas aer uginosa for 6y ear s using a filter paper method w ith no v acuum pumping.T he surv iv al rate for the str ain w as 100%(30/30).Str ain preserv ation was superio r to pr eser vation w ith ag ar slants and sem-i so lid agar ov erla pared to v acuum f reeze -dry ing,o ur met ho d is mor e economical,simple,and practical w ith the same level o f preservation.=Key words > Pseudomonas aer uginosa ;filter paper metho d;strain preserv atio n 医学微生物学教学和实验都需要保存细菌菌种,而微生物具有易变异的特性,因此在保藏过程中,必须使微生物的代谢处于相对静止状态,才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持很好的活性。

菌种保藏方法

3白胶塞封口保存法
选择与试管口径相符的白胶塞，用0.2%煤酚皂溶液洗涤，浸泡在酒精内待用。当试管斜面长满菌丝后，在无菌条件下拔去棉塞，取浸泡的白胶塞1个，通过火焰迅速塞入试管口内，并用石蜡熔封。此法能达到与石蜡油封存相似的效果。用该法保存菌种可存活1～3年，但以每年移植1次为好。
4蒸馏水保藏法
将8成熟试管菌种放在接种箱内，注入蒸馏水，将培养基斜面全部淹没至管口2cm。管口用白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，常温下置于阴凉处立放，可以保藏1年左右。
利用孢子保存菌种系列方法
1滤纸片保藏法
取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）滤纸，剪成4.0cm×0.8cm的小纸条，平铺在培养皿中用纸包裹进行灭菌。采用钩悬法收集孢子，让孢子落在滤纸条上。将载有孢子的滤纸条放入保藏试管中，白胶塞封口，再将保藏试管放入干燥器中1～2d，除去滤纸水分，然后低温保藏。保存期可达２～10年。
2沙土管保藏法
取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，加用1％稀盐酸煮沸30min，以除去其中的有机质，再用水冲洗至pH值达到中性，烘干备用。同时取非耕作层的瘦黄土或红土，用水反复冲洗至中性，烘干碾细，过100目筛，将处理好的沙与土以2～4∶1混匀，然后分装小试管内，每管装0.5g，高压灭菌（1.5kg/cm2）3次，再干热灭菌（160℃，2h）1次，待无菌检验合格后方可使用。将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3mL，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气至沙土干燥为止。真空干燥操作需在孢子接入后48h内完成，以免孢子发芽。制备好的沙土管石蜡封口，在低温下可保藏2～10年。
二、菌种保藏的方法
试管斜面菌种系列保存方法

滤纸片低温干燥法保存丝状真菌

滤纸片低温干燥法保存丝状真菌尹良芬㊀（华中农业大学植物科技学院作物学实验教学中心，湖北武汉４３００７０）摘要㊀将待保存菌株接种在ＰＤＡ培养基平板中央，在菌落周围放置直径３５ｍｍ的圆形无菌滤纸片，待真菌菌丝（孢子）长满滤纸片后，将其取出放入无菌培养皿中，放置在底部盛有变色硅胶的干燥器中干燥３５ｄ㊂将干燥后的带菌滤纸片再转入底部装有无菌变色硅胶的无菌离心管中，用封口膜封口，放入透明冷冻盒内－２０ħ保存㊂通过对保存周期为２７年的１５种真菌菌种共计２６０个菌株的存活情况及部分菌株的致病性进行检测，发现保存的菌种存活率高，致病性和生物学特性不易退化㊂因此，滤纸片低温干燥法保存丝状真菌菌种，具有对设备要求简单㊁占用空间小㊁保存容量大㊁保存时间长㊁工作效率高等优点㊂关键词㊀菌种保存；滤纸片干燥；低温；存活率；致病性；丝状真菌中图分类号㊀Ｒ４４６．５㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２２）１２－０００５－０６ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２２．１２．００２㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＤｒｙｉｎｇＦｉｌｔｅｒＰａｐｅｒａｔＬｏｗＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｏＰｒｅｓｅｒｖｅＦｉｌａｍｅｎｔｏｕｓＦｕｎｇｉＹＩＮＬｉａｎｇ⁃ｆｅｎ㊀（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄＴｅａｃｈｉｎｇＣｅｎｔｅｒｏｆＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｉｎＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉ⁃ｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ４３００７０）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＴｈｅｓｔｒａｉｎｓｔｏｂｅｐｒｅｓｅｒｖｅｄｗｅｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｉｎｔｈｅｃｅｎｔｅｒｏｆｔｈｅＰＤＡｍｅｄｉｕｍｐｌａｔｅ，ａｃｉｒｃｕｌａｒｓｔｅｒｉｌｅｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｗｉｔｈａｄｉａｍｅｔｅｒｏｆ３ｔｏ５ｍｍｗａｓｐｌａｃｅｄａｒｏｕｎｄｔｈｅｃｏｌｏｎｙ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｆｕｎｇａｌｈｙｐｈａｅ（ｓｐｏｒｅｓ）ｗｅｒｅｏｖｅｒｇｒｏｗｎｗｉｔｈｔｈｅｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒ，ｔｏｏｋｉｔｏｕｔａｎｄｐｕｔｉｔｉｎｔｏａｓｔｅｒ⁃ｉｌｅｐｅｔｒｉｄｉｓｈ，ａｎｄｐｌａｃｅｄｉｔｉｎａｄｅｓｉｃｃａｔｏｒｆｉｌｌｅｄｗｉｔｈｄｉｓｃｏｌｏｒｅｄｓｉｌｉｃａｇｅｌａｔｔｈｅｂｏｔｔｏｍｔｏｄｒｙｆｏｒ３ｔｏ５ｄａｙｓ．Ｄｒｉｅｄｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｐｉｅｃｅｓｗｅｒｅｔｈｅｎｐｕｔｉｎｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｔｕｂｅｓｗｉｔｈｓｔｅｒｉｌｅｓｉｌｉｃａｇｅｌａｔｔｈｅｂｏｔｔｏｍ．Ａｆｔｅｒｓｅａｌｉｎｇｗｉｔｈｐａｒａｆｉｌｍ，ｔｈｅｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｔｕｂｅｓｗｅｒｅｆｉｎａｌｌｙｐｕｔｉｎｔｏａｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔｆｒｅｅｚｅｒｂｏｘａｎｄｓｔｏｒｅｄａｔ－２０ħ．Ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ２６０ｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍ１５ｆｕｎｇｉｓｐｅｃｉｅｓｔｈａｔｐｒｅｓｅｒｖｅｄｆｏｒ２－７ｙｅａｒｓ，ｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｍｏｓｔｏｆｔｈｅｄｅｔｅｃｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｍａｉｎｔａｉｎｅｄｈｉｇｈｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅａｎｄｈｉｇｈｖｉｒｕｌｅｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｉｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｄｏｎｏｔｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｅａｓｉｌｙ．Ｕｓｉｎｇｄｒ⁃ｙｉｎｇｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒａｔｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｏｓａｖｅｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉｈａｓｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｓｕｃｈａｓｒｅｑｕｉｒｅｓｓｉｍｐｌｅｅｑｕｉｐｍｅｎｔｓ，ｏｃｃｕｐｉｅｓｓｍａｌｌｓｐａｃｅ，ｈａｓｌａｒｇｅｓｔｏｒａｇｅｃａｐａｃｉｔｙ，ｋｅｅｐｓｌｏｎｇｓｔｏｒａｇｅｔｉｍｅ，ａｎｄｈａｓｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｆｕｎｇｉｓｔｒａｉｎｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ；Ｄｒｙｉｎｇｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｐｉｅｃｅｓ；Ｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅ；Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ；Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉ作者简介㊀尹良芬（１９７４），女，云南罗平人，高级工程师，博士，从事植物病理研究㊂收稿日期㊀２０２１－０９－１８㊀㊀菌种是生物学研究工作正常运行的物质基础㊂菌种质量的高低决定着研究工作的成败㊂为使自然界分离的优质菌株能够保持原有的优良性状，最大限度地发挥作用，就需要尽可能完好地保存菌种㊂微生物菌种的保存方法较多，各有优缺点㊂大体上可分为４类，即继代法㊁干燥法㊁低温干燥法和超低温冷冻法［１－３］㊂继代法，也叫定期移植法，即把菌种移植到斜面培养基上进行保存的方法；该方法操作简便㊁适用广泛，不需要特殊设备；但缺点是微生物的生长和代谢活动几乎没有被抑制，因而保存时间较短，需要经常进行移植（９０ｄ或者更短时间就需要移植一次），烦琐费时；而且最致命的还是多次继代培养后菌种的生物学特性退化，失去原有的优良性状［１－５］㊂干燥法是将菌种干燥后放置干燥环境保存的方法［１］，该方法保存时间长，但需要一直放置在干燥器中，保存容量小㊂低温干燥法是将待保存真菌孢子悬浮在保护剂中，加干燥剂（如硅胶等）抽真空进行干燥后，封口低温保存［１］；该保存方法菌种的存活率高㊁保存时间长㊁菌种稳定性高，但操作烦琐且需专用设备［１］㊂超低温冷冻法是将菌种制成悬液，加入保护剂如甘油等分装到离心管或者冻存管中，或者将菌种培养到滤纸片上，干燥后保存于－８０ħ的超低温冰箱或者液氮（－１９６ħ）中；该方法保存时间长㊁菌种不易退化，但操作复杂，需特殊设备，液氮还需要定期添加［５－７］㊂此外，还有很多上述方法改进的保存方法，如矿物油保存法［１，８］㊁Ｒｉｃｈａｒｄｓ保存法［９］㊁滤纸低温保存法［１０－１１］㊂上述滤纸保存方法中，只利用真菌孢子进行保存的方法适用范围较窄，因为一些真菌菌株人工培养时不会产生孢子，或者即便产生分生孢子其量也非常小，无法利用该方法进行保存；而利用菌丝（孢子）进行保存的方法，虽然扩大了菌种的保存范围，但由于信封与塑料密封袋的低密闭性，硅胶容易受潮，需要定期进行更换，增加了工作量以及更换过程中菌种被污染的风险㊂此外，信封或者硫酸纸袋都不透明，导致查找菌种不方便，而且活化菌种以及更换硅胶时需要逐层打开塑料密封袋㊁信封及硫酸纸袋，因而工作效率低㊂笔者介绍一种改进的滤纸片低温干燥保存法，即将带菌滤纸片保存在添加有变色硅胶的透明离心管中，然后放置于透明冷冻盒内进行保存㊂经过改进后，上述保存方法中存在的问题都能得到很好的解决，从而能够更好地保存菌种㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验材料１．１．１㊀供试菌种㊂褐腐病菌Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ㊁Ｍｏｎｉｌｉａｍｕｍｅｃｏｌａ㊁Ｍｏｎｉｌｉａｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ㊁Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｌｉｎｈａｒｔｉａｎａ；实腐病菌Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｅｒｅｓ㊁Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｆｕｓｉｃｏｌａ；炭疽病菌Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ㊁Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍａｃｕｔａｔｕｍ；纹枯病菌Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ；黄萎病菌Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ；枯萎病菌Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓ⁃ｐｏｒｕｍ；小斑病菌Ｂｉｐｏｌａｒｉｓｍａｙｄｉｓ；赤星病菌Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａ⁃ｔａ；黑根霉Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉｇｒｉｃａｎｓ；犁头霉Ａｂｓｉｄｉａ㊂１．１．２㊀供试材料㊂单孔或双孔文具用打孔器，孔径４ｍｍ左右；普通定性滤纸；１．５ｍＬ或２．０ｍＬ离心管（也可换为螺口㊁平底的指形管）；变色硅胶（规格型号ＨＧ／Ｔ２７６５．４－２００５，青安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２２，５０（１２）：５－１０㊀㊀㊀岛海洋化工有限公司）；普通玻璃干燥器；封口膜（ＰＡＲＡ⁃ＦＩＬＭ）；透明塑料冷冻盒，规格不限㊂１．２㊀试验方法１．２．１㊀变色硅胶干燥㊂将变色硅胶倒入玻璃培养皿或者瓷盘中，放入烘箱８０ħ干燥２ｈ至硅胶变为深蓝色（干燥的变色硅胶呈深蓝色，根据吸湿量的多少颜色会依次呈淡蓝色㊁蓝白色㊁蓝紫色和粉红色）后冷却，然后倒入玻璃干燥器中备用㊂１．２．２㊀变色硅胶灭菌㊂将变色硅胶倒入玻璃培养皿中，烘箱１６０ħ灭菌２ｈ［１］，冷却后加入无菌离心管中备用㊂１．２．３㊀滤纸片及其灭菌㊂用打孔器将定性滤纸打成直径３５ｍｍ的圆形滤纸片，放入玻璃培养皿中，１２１ħ湿热灭菌１５ｍｉｎ后放超净工作台上备用㊂１．２．４㊀带菌滤纸片制作㊂将待保存的真菌接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ培养基）平板的中央，在接种点的周围均匀摆放数个灭菌滤纸片，于恒温培养箱中２５ħ黑暗培养（该条件为大部分丝状真菌培养的最适条件）［１，１２－１３］㊂培养过程中菌丝（孢子）生长到滤纸片上㊂滤纸片长满菌丝（孢子）后取出，放置于无菌培养皿中㊂１．２．５㊀带菌滤纸片干燥㊂将放置有带菌滤纸片的培养皿放入底部盛有干燥变色硅胶（呈深蓝色）的干燥器内，盖上盖子干燥３５ｄ㊂１．２．６㊀带菌滤纸片保存㊂取１．５ｍＬ的无菌离心管，于超净工作台酒精灯火焰旁将无菌变色硅胶加入离心管底部，然后将干燥好的带菌滤纸片放入其中㊂用记号笔在离心管上写上菌种名称或编号及保存日期并用封口膜封口，最后放入透明冷冻盒中－２０ħ冰箱长期保存㊂１．２．７㊀滤纸片低温干燥法保存菌种的存活率测定㊂取低温干燥法保存菌种滤纸片放置于ＰＤＡ培养基上，２５ħ黑暗培养数天后检查其存活率㊂存活率计算：同一种真菌移植的１０片滤纸片中，能够长出菌丝的滤纸片所占的百分比㊂如果同一种真菌保存有多个菌株且活化过其中的数个菌株，则存活率为活化过的所有菌株的平均值㊂１．２．８㊀滤纸片低温干燥法保存菌种的致病力测定㊂在活化好的待测菌种如褐腐病菌菌落边缘用直径为５ｍｍ的打孔器打取菌丝块，接种到该菌种的寄主（核果或仁果类水果）果实上（果实先用同样的打孔器打孔，然后将菌丝块菌丝面朝下塞到孔里），将接种果实放入底部铺有湿纸巾的瓷盘里，用保鲜膜盖上后放入光照培养箱中，（２３ʃ１）ħ［１４－２０］㊁光照条件１２ｈ／１２ｈ［１２－１５］培养１７ｄ观察发病情况并测量病斑大小，计算病斑扩展速率并评价该菌种的致病力㊂２㊀结果与分析２．１㊀带菌滤纸片制作㊀菌种移植培养时，先在ＰＤＡ培养基平板中部放置数片无菌滤纸片，然后将待保存菌种的菌丝块置于无菌滤纸片围成的圆圈中央；如果接菌后想保存，则将滤纸片放置在菌落边缘先端菌丝尚未到达的地方（图１ａ），这样菌丝往外生长扩展时就会长到滤纸片上㊂待整个滤纸片都长满菌丝（孢子）时，带菌滤纸片制作完成（图１ｂ）㊂注：ａ．菌种培养初期放置无菌滤纸片；ｂ．菌丝或孢子长满滤纸片，成为带菌滤纸片Ｎｏｔｅ：ａ．Ｓｔｅｒｉｌｅｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｐｉｅｃｅｓｗｅｒｅｐｌａｃｅｄｄｕｒｉｎｇｆｕｎｇｕｓｃｕｌｔｕｒｅ；ｂ．Ｆｕｎｇｕｓ⁃ｂｅａｒｉｎｇｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｃｏｍｐｌｅｔｅｄａｆｔｅｒｆｕｎｇｉｇｒｅｗｏｎｔｈｅｍ图１㊀褐腐病菌Ｍｏｎｉｌｉａｍｕｍｅｃｏｌａ带菌滤纸片的制作Ｆｉｇ．１㊀Ｍａｋｉｎｇｏｆｆｕｎｇｉ⁃ｂｅａｒｉｎｇｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｏｆＭｏｎｉｌｉａｍｕｍｅｃｏｌａ２．２㊀带菌滤纸片干燥㊀将长满菌丝（孢子）的带菌滤纸片转移到无菌培养皿中（图２ａ），然后放置于底部盛有干燥变色硅胶的玻璃干燥器中干燥３５ｄ（图２ｂ）㊂２．３㊀带菌滤纸片保存㊀干燥后的带菌滤纸片放入底部装有无菌变色硅胶的１．５ｍＬ无菌离心管，用封口膜（ＰＡＲＡＦＩＬＭ）封口（图３ａ），后放入透明冷冻盒内，于－２０ħ冰箱中长期保存（图３ｂ）㊂２．４㊀变色硅胶不同湿度时颜色变化㊀变色硅胶吸湿后其颜色因湿度不同会发生改变㊂干燥状态呈深蓝色，此时湿度为０（图４ａ）；湿度约为１０％时呈淡蓝色（图４ｂ）；湿度约为２５％时呈蓝白色（图４ｃ）；湿度约为４０％时呈蓝紫色（图４ｄ）；湿度约为５０％时呈粉色（图４ｅ）㊂菌种保存过程中如果变色硅胶６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２２年呈粉红色，表明其吸湿性已经很弱，无法继续维持所保存菌种的干燥环境，需要进行更换㊂注：ａ．带菌滤纸片转移到无菌培养皿中；ｂ．放入干燥器中进行干燥Ｎｏｔｅ：ａ．Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇｆｕｎｇｉ⁃ｂｅａｒｉｎｇｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｐｉｅｃｅｓｉｎｔｏｓｔｅｒｉｌｅｐｅｔｒｉｄｉｓｈ；ｂ．Ｄｒｙｉｎｇｆｕｎｇｉ⁃ｂｅａｒｉｎｇｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｐｉｅｃｅｓｉｎａｄｒｙｅｒ图２㊀带菌滤纸片干燥Ｆｉｇ．２㊀Ｄｒｙｉｎｇｆｕｎｇｉ⁃ｂｅａｒｉｎｇｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｐｉｅｃｅｓ注：ａ．干燥的带菌滤纸片保存于离心管中；ｂ．冷冻保存于－２０ħ冰箱中Ｎｏｔｅ：ａ．Ｄｒｉｅｄｆｕｎｇｉ⁃ｂｅａｒｉｎｇｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｐｉｅｃｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｉｎｔｈｅｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｔｕｂｅｓ；ｂ．Ｓｔｏｒｅｄｉｎａｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｏｒａｔ－２０ħ图３㊀带菌滤纸片的冷冻保存Ｆｉｇ．３㊀Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｇｉ⁃ｂｅａｒｉｎｇｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒｐｉｅｃｅｓ２．５㊀保存菌种干燥状态检查㊀从冰箱中取出冷冻盒，直接通过冷冻盒的透明底部观察离心管中硅胶颜色的变化（图５），硅胶颜色为粉色时需要进行更换㊂常使用的冷冻盒规格为１００格（１０行１０列），利用该保存方法，１００个菌种的干燥状态检查只需要几秒钟的时间㊂２．６㊀滤纸片低温干燥法保存菌种的存活率及生物学特性测定㊀该研究检测了用滤纸片低温干燥法保存的１５种真菌２６０株菌株的存活率㊂结果表明，除水稻纹枯病菌外，其他菌种的存活率达８０％以上，多数菌种的存活率达１００％㊂从表１可以看出，人工培养能够产生分生孢子或者菌丝浓密的菌种成活率最高，可达１００％；而不产生分生孢子且菌丝稀疏的菌种存活率相对较低㊂水稻纹枯病菌保存了２次，２０１３年保存的菌种，２０１４２０１７年活化成功，２０１８年未活化成功；２０１８年保存的菌种，２０２１年活化时存活率达７０％㊂与水稻纹枯病菌相似，桃褐腐病菌Ｍ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ在人工培养时不产生分生孢子，菌丝也较稀疏，２０１２２０２０年共保存了２８１株来自不同地区及寄主上的该病原菌菌株，数年间活化过其中的４５个菌株且全部存活㊂另外还观察了上述１５种真菌活化后的生物学特性，如菌落生长特性㊁产孢特性等，发现与分离初期的菌种没有太大差异㊂如褐腐病菌Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ，保存４年的㊁来自桃的分离菌活化后与刚分离的㊁来自枇杷的分离菌一样，在ＰＤＡ培养基上菌落都呈褐色，产生大量分生孢子㊂且保存４年的桃分离菌菌落生长速率为１４ｍｍ／ｄ，而刚分离的枇杷菌株为７５０卷１２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀尹良芬㊀滤纸片低温干燥法保存丝状真菌１５ｍｍ／ｄ［１４－２０］，差异不大㊂注：ａ．深蓝色；ｂ．淡蓝色；ｃ．蓝白色；ｄ．蓝紫色；ｅ．粉色Ｎｏｔｅ：ａ．Ｄａｒｋｂｌｕｅ；ｂ．Ｌｉｇｈｔｂｌｕｅ；ｃ．Ｂｌｕｅ⁃ｗｈｉｔｅ；ｄ．Ｐｕｒｐｌｅｂｌｕｅ；ｅ．Ｐｉｎｋ图４㊀变色硅胶颜色变化Ｆｉｇ．４㊀Ｃｏｌｏｒｃｈａｎｇｅｏｆｓｉｌｉｃａｇｅｌ图５㊀通过透明冷冻盒底部检查菌种干燥状态Ｆｉｇ．５㊀Ｄｒｙｓｔａｔｅｃｈｅｃｋｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｂｏｔｔｏｍｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔｆｒｅｅｚｅｒｂｏｘ２．７㊀滤纸片低温干燥法保存菌种的致病力测定㊀为测定该方法保存菌种的致病力是否存在退化现象，该研究挑选了３种培养性状及保存年限不同的褐腐病菌与新分离菌株进行致病力对比试验㊂３个保存菌种分别是保存４年的Ｍ．ｆｒｕｃｔｉ⁃ｃｏｌａ㊁保存６年的Ｍ．ｍｕｍｅｃｏｌａ㊁保存７年的Ｍ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ㊂其中，Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ人工培养时能产生大量分生孢子，存活率为１００％；Ｍ．ｍｕｍｅｃｏｌａ人工培养时不产生分生孢子，但菌丝浓密，存活率也为１００％；Ｍ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ人工培养时不产生分生孢子，菌丝稀疏，存活率为９８％㊂新分离菌株为分离自枇杷的Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ，３个保存菌种分离自桃㊂所以在枇杷及桃上都进行了回接试验㊂接种结果如图６所示，新分离菌Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ在枇杷和桃上都能致病，产生褐色病斑及大量分生孢子（图６ａ㊁ｅ）；保存４年的Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ菌在枇杷和桃上也产生褐色病斑及大量分生孢子（图６ｂ㊁ｆ）；保存６年的Ｍ．ｍｕｍｅｃｏｌａ菌（图６ｃ㊁ｇ）及保存７年的Ｍ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ菌（图６ｄ㊁ｈ）也产生差不多大小的褐色病斑，但分生孢子相对较少，这是由于不同种之间的差异造成的㊂同样是属于Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ的菌株，来自枇杷的新分离菌株接种枇杷时，病斑扩展速度为１７．４ｍｍ／ｄ；而保存４年，来自桃的菌株则为１５．９ｍｍ／ｄ；但接种桃时，来自枇杷的新鲜菌株病斑的扩展速度为１２．８ｍｍ／ｄ；来自桃㊁保存４年的菌株病斑扩展速度却为１４ｍｍ／ｄ［１４－２０］㊂这些数据说明菌种的致病力与保存年限没有直接关系，也就是说该方法保存的菌种其致病力没有明显退化㊂３㊀讨论与结论以前的滤纸片保存方法是让菌丝（孢子）长在滤纸上，干燥后放入硫酸纸袋中，外面用塑料密封袋封口或者在硫酸纸袋和塑料密封袋中间加一个装有干燥变色硅胶的信封，放入－２０ħ冰箱进行保存㊂该方法的优点是保存的菌种范围广且保存时间长，缺点是硫酸纸袋和塑料密封袋的密闭性较差，会导致菌种受潮因而保存时间不长，硅胶容易受潮，需要定期进行更换，增加了工作量以及更换过程中菌种被污染的风险㊂此外，由于信封或者硫酸纸袋都不透明，导致查找菌种㊁活化菌种以及更换硅胶时需要逐层打开塑料密封袋㊁信封及硫酸纸袋，工作效率低下㊂该研究介绍的滤纸片低温干燥法保存真菌菌种，利用离心管作为保存容器进行菌种保存㊂离心管密闭性高，又添加了硅胶干燥剂，能长时间为所保存菌种提供干燥的环境，菌种在这种条件下代谢极低，因而保存时间长，且其生物学特性不易发生退化㊂同时，离心管和冷冻盒均为透明，通过冷８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２２年冻盒盖子即可方便快捷地查找目标菌种；而从透明冷冻盒底部及四周可见离心管中变色硅胶的颜色，据此可判断所保存菌种的干燥状态以及是否需要更换变色硅胶等㊂离心管的高密封性可有效隔绝外界湿气，因此不需要经常更换硅胶㊂华中农业大学植物科技学院作物学实验教学中心用此法所保存的数千份菌种中，有数百份为保存１０年以上的菌种，仅有个别菌种其离心管中的硅胶变为粉色，需要更换，其他绝大多数都不需要更换㊂另外，此法活化菌种及更换变色硅胶都比较方便，只需要打开离心管盖子进行操作即可㊂表１㊀滤纸片低温干燥法保存菌种的存活率测定Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎｓｐｒｅｓｅｒｖｅｄｂｙｄｒｉｅｄｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒａｔｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ菌种名称Ｎａｍｅｏｆｆｕｎｇｉｓｐｅｃｉｅｓ寄主Ｈｏｓｔ保存时间Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｔｉｍｅ活化时间Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｔｉｍｅ活化菌株数Ａｃｔｉｖａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓʊ株存活率Ｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅʊ％菌种培养特征Ｓｔｒａｉｎｃｕｌｔｕｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ褐腐病菌Ｍｏｎｉｌｉａｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ桃㊁李㊁杏㊁梨㊁苹果２０１２２０２１年２０１２２０２１年４５９８＃不产孢，菌丝稀疏褐腐病菌Ｍｏｎｉｌｉａｍｕｍｅｃｏｌａ桃㊁李㊁杏㊁樱桃２０１３２０２０年２０１３２０２０年５０１００不产孢，菌丝浓密小斑病菌Ｂｉｐｏｌａｒｉｓｍａｙｄｉｓ玉米２０１３－１０２０１４２０２０年７１００产孢，菌丝浓密赤星病菌Ａｌｔｅｒｎａｒｉａａｌｔｅｒｎａｔａ烟草２０１３－１０２０１４２０２０年７１００产孢，菌丝浓密枯萎病菌Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ棉花２０１３－１０２０１４２０２０年９１００产孢，菌丝稀疏黄萎病菌Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ棉花２０１３－１０２０１４２０２０年９１００不产孢，菌丝稀疏纹枯病菌Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ水稻２０１３－１０２０１８－０５１０不产孢，菌丝稀疏褐腐病菌Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ核果类水果及枇杷２０１０２０２０年２０１２２０２１年５５１００大量产孢，菌丝稀疏炭疽病菌Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ柑橘２０１４－１２２０１９－０９１１００大量产孢，菌丝稀疏炭疽病菌Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍａｃｕｔａｔｕｍ桃２０１６－０５２０２０－０９１１００大量产孢，菌丝稀疏纹枯病菌Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ水稻２０１８－０７２０２１－０２１７０不产孢，菌丝稀疏黑根霉Ｒｈｉｚｏｐｕｓｎｉｇｒｉｃａｎｓ２０１３－１０２０１４２０２０年７１００不产孢，菌丝浓密犁头霉Ａｂｓｉｄｉａ２０１３－１０２０１４２０２０年７１００不产孢，菌丝浓密实腐病菌Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｅｒｅｓ桃２０１７２０１９年２０１８２０２０年２０８０部分产孢，菌丝一般实腐病菌Ｄｉａｐｏｒｔｈｅｆｕｓｉｃｏｌａ桃２０１７２０１９年２０１８２０２０年１５８０部分产孢，菌丝一般褐腐病菌Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｌｉｎｈａｒｔｉａｎａ木瓜２０１７２０１９年２０１９－２０２０年２５８０不产孢，菌丝稀疏㊀注：＃．表示活化时，有个别菌株会出现个别滤纸片活化不成功的情况㊀Ｎｏｔｅ：＃ｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔｄｕｒｉｎｇａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｓｏｍｅｓｔｒａｉｎｓｍａｙｆａｉｌｔｏａｃｔｉｖａｔｅｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒ注：ａｄ．接种１ｄ后；ｅｈ．接种５ｄ后㊂病斑来自ａ㊁ｅ．新鲜Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ菌种；ｂ㊁ｆ．保存４年Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ菌种；ｃ㊁ｇ．保存６年Ｍ．ｍｕｍｅｃｏｌａ菌种；ｄ㊁ｈ．保存７年Ｍ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ菌种Ｎｏｔｅ：ａ－ｄ．１ｄａｙａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ；ｅ－ｈ．５ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｓｙｍｐｔｏｍｓｃａｍｅｆｒｏｍａ，ｅ．ｆｒｅｓｈｉｓｏｌａｔｅｄＭ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａｉｓｏｌａｔｅ；ｂ，ｆ．Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａｉｓｏｌａｔｅｐｒｅ⁃ｓｅｒｖｅｄｆｏｒ４ｙｅａｒｓ；ｃ，ｇ．Ｍ．ｍｕｍｅｃｏｌａｉｓｏｌａｔｅｐｒｅｓｅｒｖｅｄｆｏｒ６ｙｅａｒｓ；ｄ㊁ｈ．Ｍ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓｉｓｏｌａｔｅｐｒｅｓｅｒｖｅｄｆｏｒ７ｙｅａｒｓ图６㊀新分离菌株及滤纸片低温干燥法保存菌株的致病力测定Ｆｉｇ．６㊀Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｆｒｅｓｈｌｙｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｒｅｓｅｒｖｅｄｂｙｄｒｙｉｎｇｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒａｔｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ９５０卷１２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀尹良芬㊀滤纸片低温干燥法保存丝状真菌㊀㊀利用滤纸片低温干燥法进行保存时，如果一次性保存的菌种数量比较大，通常先将滤纸片围成圆圈放置在培养基平板上，再将菌块接到圆圈中央，这样同一把镊子消毒后可以放置多皿滤纸片，从而提高工作效率㊂菌种培养过程中如果想保存，则需要将滤纸片放置在菌落边缘先端菌丝尚未到达的培养基上，这样菌丝才能长到滤纸片上；如果菌落已经长满培养皿或者菌落边缘快要到达培养皿边缘则不建议进行菌种保存，此时无法保证足够量的菌丝（孢子）长到滤纸片上㊂对于菌丝特别稀疏的菌种进行保存，可先将无菌滤纸片用灭菌的马铃薯葡萄糖水培养基（ＰＤＢ培养基，即ＰＤＡ培养基去掉琼脂）泡一下，滤纸片上扩展的菌丝（孢子）量会增加㊂保存过程中添加到离心管里的灭菌硅胶粒需要使用新的，而干燥用的硅胶粒则可以反复使用㊂滤纸片低温干燥保存方法中，２０１３年保存的水稻纹枯病菌于２０１８年活化时其存活率为０，第２次保存的存活率也不高㊂而同样是人工培养时不产生孢子或者产生极少量孢子，且菌丝也稀疏的褐腐病菌Ｍ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ和Ｍ．ｌｉｎｈａｒｔｉａｎａ却能达到８０％以上的存活率㊂尤其是Ｍ．ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ菌种，从２０１２年开始华中农业大学植物科技学院作物学实验教学中心共分离保存过２８１株来自不同寄主及地区的菌株，且活化过其中的４５个菌株，没有出现过１例存活率为０的情况㊂水稻纹枯病菌存活率低下的原因不明㊂木瓜褐腐病菌中有些菌株的菌丝非常稀疏，滤纸片上几乎看不见菌丝，导致保存的菌种存活率低下㊂虽然利用滤纸片低温干燥保存方法出现水稻纹枯病菌５年后存活率为０的情况，但相比华中农业大学植物科技学院作物学实验教学中心同时使用过的继代保存法和石蜡油保存法，该方法的优势仍很明显㊂滤纸片保存的所有菌种同时都进行过ＰＤＡ斜面４ħ冰箱保存，除黑根霉㊁犁头霉㊁褐腐病菌Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ３个菌种２年后仍能存活外，其他菌种尤其水稻纹枯病菌存活周期短的仅９０ｄ，长的能达１年以上㊂而利用该方法保存，即便２０１８年活化时存活率为０的水稻纹枯病菌，其在２０１４２０１７年却每年都能活化成功㊂此外，继代保存的菌种还会出现生物学特性退化的情况，如利用继代法保存的棉花黄萎病菌㊁棉花枯萎病菌等多次继代保存后会出现不产生分生孢子的情况㊂而石蜡油保存的菌种，虽然５年以后仍能存活，但放冰箱里只能直立，占用空间较大，且活化时菌落带有黏性，碰过石蜡油的接种针在酒精灯上灼烧灭菌时会发出炸裂声，油花四溅，同时散发出石蜡油的异味㊂致病力测定试验可以看出，同样的Ｍ．ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ菌种，保存４年的菌种致病力与刚分离的菌种没有区别，说明该保存方法能够很好地保存菌种的优良性状，菌种的生物学特性不易退化㊂对于人工培养时不产生孢子㊁菌丝稀疏的菌种，要解决成活率低下的问题，只需要在菌种保存时加大保存滤纸片的数量，同时活化时１次取２张或者３张滤纸片进行活化即可㊂滤纸片低温干燥保存方法有效规避了继代保存法多次继代培养而导致的菌种活力下降以及冷冻保存法需要特殊设备且费用高昂的问题㊂该保存方法中滤纸片放置在离心管中保存，不仅占用空间小，保存容量大，一个普通冰箱的冷冻室就能够轻松保存数千份菌种㊂此外，菌种取用方便，需要时找到所需菌种打开封口，取出１片滤纸片进行活化，余下的菌种封口放回去继续保存㊂综上所述，该保存方法具有对设备要求简单㊁占用空间小㊁保存容量大㊁保存时间长㊁取用方便及菌种成活率高㊁致病力强㊁生物学特性不容易退化㊁工作效率高等优点，值得推广应用㊂参考文献［１］方中达．植病研究方法［Ｍ］．３版．北京：中国农业出版社，２００７：１４２－１４６．［２］郭玲玲．微生物菌种保藏方法及关键技术［Ｊ］．微生物学杂志，２０１９，３９（３）：１０５－１０８．［３］徐莹．药品微生物检验用菌种保藏方法［Ｊ］．检验检疫学刊，２０１９，２９（１）：７３－７４．［４］黄霞云．人工传代㊁低温与超低温法保存菌种的效果比较观察［Ｊ］．现代医院，２００６，６（８）：７３－７４．［５］梁梅娟，陈亚波，苏佩冰．菌种超低温保存法与人工传代法的比较［Ｊ］．现代食品，２０１８（２１）：１８４－１８６．［６］吴婧，李东明，ＤＥＨＯＯＧＧＳ，等．病原性丝状真菌的菌种保藏方法［Ｊ］．中国真菌学杂志，２０１１，６（５）：３０５－３０７．［７］王华，杜立业，李华．微生物液氮超低温保存研究进展［Ｊ］．食品与生物技术学报，２０１１，３０（１）：１－５．［８］杨之为，李有志，宗兆锋．矿物油中保存真菌存活期限的检测［Ｊ］．西北农业大学学报，１９９６，２４（３）：１００－１０３．［９］易龙．烟草赤星病菌菌种保存及致病性研究［Ｊ］．植物保护，２００８，３４（１）：９２－９５．［１０］吴波明，郭芳芳，王宁，等．真菌快速保存方法：ＣＮ２０１７１０７９６１３９．５［Ｐ］．２０１８－０２－０９．［１１］曹美林，李佳，邓慧，等．滤纸片低温冷冻法保存微生物菌株的临床应用［Ｊ］．实验与检验医学，２０１５，３３（３）：２７９－２８１，３０３．［１２］尹良芬，马琼瑶，陈育．桃溃疡病的鉴定［Ｊ］．西南农业学报，２０１１，２４（５）：１７４８－１７５２．［１３］尹良芬，都胜芳，蔡明历，等．野生柑橘炭疽病鉴定［Ｊ］．西南农业学报，２０１７，３０（３）：５９０－５９４．［１４］ＹＩＮＬＦ，ＣＨＥＮＳＮ，ＣＨＥＮＧＫ，ｅｔａｌ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｒｅｅＭｏｎｉｌｉｎｉａｓｐｅｃｉｅｓｆｒｏｍｐｌｕｍｉｎＣｈｉｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅ，２０１５，９９（１２）：１７７５－１７８３．［１６］ＣＨＥＮＧＫ，ＤＵＳＦ，ＬＩＧＱ，ｅｔａｌ．ＦｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｏｆｂｒｏｗｎｒｏｔｃａｕｓｅｄｂｙＭｏ⁃ｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｃｏｌａｏｎＣｈｉｎｅｓｅｓｏｕｒｃｈｅｒｒｙ（Ｃｅｒａｓｕｓｐｓｅｕｄｏｃｅｒａｓｕｓ）ｉｎｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎＣｈｉｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅ，２０１６，１００（１）：２２４．［１７］ＹＩＮＬＦ，ＣＡＩＭＬ，ＤＵＳＦ，ｅｔａｌ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｗｏＭｏｎｉｌｉａｓｐｅｃｉｅｓｆｒｏｍａｐｒｉｃｏｔｉｎＣｈｉｎａ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２０１７，１６（１１）：２４９６－２５０３．［１８］ＹＩＮＬＦ，ＤＵＳＦ，ＣＨＡＩＳＩＲＩＣ，ｅｔａｌ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｆｕｎｇｉｃｉｄｅｂａｓｅｌｉｎｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＭｏｎｉｌｉａｍｕｍｅｃｏｌａｉｎＣｈｉｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅ，２０１９，１０３（９）：２２３１－２２３６．［１９］ＹＩＮＬＦ，ＭＯＷ，ＧＵＯＤＹ，ｅｔａｌ．ＦｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｏｆｂｒｏｗｎｒｏｔｏｆＰｒｕｎｕｓｍｕｍｅｃａｕｓｅｄｂｙＭｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｃｏｌａｉｎＣｈｉｎａ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅ，２０２０，１０４（４）：１２５３．［２０］ＹＩＮＬＦ，ＺＨＡＮＧＳＱ，ＤＵＪ，ｅｔａｌ．Ｍｏｎｉｌｉｎｉａｆｒｕｃｔｉｃｏｌａｏｎｌｏｑｕａｔ：Ａｎｏｌｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｎｖａｄｉｎｇａｎｅｗｈｏｓｔ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，２０２１，２０（７）：２００９－２０１４．０１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２２年。

三种简易菌种保藏方法的效果比较

的３４个，Ｌ４－５椎间盘突出的７０个，Ｌ５－Ｓ１椎间盘突出的７３个，共有２０７个突出的椎间盘。

２２常规ＭＲＩ与ＭＲＩ结合ＭＲＭ的诊断结果对比常规核磁共振成像中的２０７个椎管内型影像中，呈中央型的１１１个（５３６％），旁中央型的６０个（２９０％），椎间孔型的２３个（１１１％），游离型的９个（４４％）；确诊数量为２０３个，诊断率为９８１％。

常规核磁共振结合磁共振脊髓造影成像中的２０７个椎管内型影像中，呈中央型的１１１个（５３６％），旁中央型的６２个（２９９％），椎间孔型的２５个（１２１％），游离型的９个（４４％）；确诊数量为２０７个，诊断率为１０００％。

两者对比差异不明显，无统计学意义（Ｐ＞００５）。

３讨论腰椎间盘突出症主要是由于患者椎间盘受外伤、劳作损伤或退变而致的髓核突出，临床对其病情确诊较为常用的是进行ＣＴ或Ｘ线检查，但其结果均不如核磁共振的确诊率高。

核磁共振是利用扫描仪的脉冲序列，矢状位的Ｔ１ＷＩ、Ｔ２ＷＩ的形态及信号辨别对患者的横断面、矢状面及各斜面进行的成像检查。

虽然本文中采用ＭＲＩ检查的确诊率（９８１％）略低于采用ＭＲＩ结合ＭＲＭ检查的效率（１０００％），但其确诊率还是极高的，它可以清晰的将椎间盘的膨出、突出和变形等病理变化呈现出来，具有视野开阔、分辨率高等特点，说明了它的应用价值。

但其设备近５米内都有很大的磁场［４］，为了不影响成像结果，除患者在检查时摘掉随身携带的金属饰品或电子产品外；陪同家属也需摘掉；并禁止体内有支架或金属夹等家属入内。

总之，对腰间盘突出症患者采用核磁共振扫描检查，病情诊断率较高且具有可靠性，值得临床推广应用。

参考文献［１］　马跃虎；李永霞；田丽；鞠慧；陈跃芳磁共振脊髓造影技术在腰椎间盘突出症中的应用［Ｊ］现代中西医结合杂志２０１２，２１（２８）：３１５６－３１５７［２］　王富山磁共振脊髓造影对腰椎间盘突出症患者的诊断价值［Ｊ］中国伤残医学２０１３，２１（０８）：３２３［３］　袁强；田伟；程晓光；屈辉；刘波；李勤；胡临；李志宇；何达；行勇刚腰椎间盘疾患诊治中腰椎间盘造影后计算机体层摄影术与磁共振显像的对比研究［Ｊ］中华医学杂志２００６，８６（３１）：２１６６－２１７０［４］　徐安波腰椎间盘突出症核磁共振影像分析１５２例［Ｊ］中国中医药现代远程教育２０１３，１１（０６）：４５－４６三种简易菌种保藏方法的效果比较张丽娜　舒东娇　刘莉莉　马癑　曹子晶（哈尔滨市疾病预防控制中心　黑龙江　哈尔滨　１５００５６）摘要　目的：寻找一种即简便又经济实用的菌种保存方法。

滤纸管保藏法在泰乐菌素生产中的应用

［摘要］通过对传统滤纸管保藏法的改良，应用于泰乐菌素生产菌的保藏，分别在不同的保藏周期时活化进行生产能力验证，结果显示改良滤纸管保藏法使用方便，摇瓶效价不低于沙土管保藏法，而且批间差异小，生产能力不随保藏时间的延长而降低。
［键词］泰乐菌素；关生产菌；滤纸管保藏法，良改ＦｉｔｒＰａｅｌｅｐｒＴｕｂｓＰｒｓｒｅｎｌｓｎＰｒｄｔｏｅｅｅｖｄｉＴｙｏｉｏｕｃｉｎ
ＺＨＡＮＧｎＬＩＸｉＰｉｇ，ａ，ＳＨＩＹａ —Ｐｎ，ＺＨＡＯｎｎｅｇＸｉ
２１，５１：９—５／萍，０１４（）４１张等
中国兽药杂志
滤纸管保藏法在泰乐菌素生产中的应用
张萍，霞，有限公司菌种研究所，银川７００）５１１［收稿日期］００－７４［２１０ —１文献标识码］Ａ［文章编号］０２２０２１）１０４０［１０ —１８（０１Ｏ — ０９— ３中图分类号］８９７６￥５．９
管中，用时每次取适量沙土孢子制备生产斜面。使这样虽然简单方便，由于１支沙土管在使用过程但中多次开启容易造成染菌，之反复升温降温，加影
响保藏效果，且每批斜面之间孢子用量很难控而制，利于生产的稳定。不
１材料与方法１１材料．
１１１供试菌种：．．泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌，为我

纸片法保存临床常见菌种的分析

纸片法保存临床常见菌种的分析发表时间：2013-08-06T10:06:05.373Z 来源：《中外健康文摘》2013年第26期供稿作者：马芳军杨小玲贾永娟[导读] 半固体高琼脂法易干燥导致菌种死亡，还偶见培养基液化引起菌种死亡。

马芳军杨小玲贾永娟(兰州市第一人民医院检验科甘肃兰州 730050)【中图分类号】R446 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)26-0234-02【摘要】目的介绍一种简便易行的菌种保存方法。

方法临床分离非苛养菌246株分别用纸片法和半固体琼脂法进行保存，并比较1m、12m、36m两种方法的菌种存活率。

结果菌株经保存1m、12m和36m后，纸片法的平均存活率分别为100%、95.1%和88.2%，半固体琼脂法分别为98.0%、76.0%和42.7%。

纸片法保存铜绿假单胞菌、白色假丝酵母菌36m后，菌株存活达100%，临床常见菌金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、大肠艾希氏菌、肺炎克雷伯菌保存36m后，菌株存活率均>88%。

化脓性链球菌的保存效果不佳。

结论纸片法适用于非苛养菌的保存，方法简便易行，不需特殊设备，值得推广应用。

【关键词】纸片菌种保存法菌种存活率简便低成本1 材料和方法1.1 菌株来源收集2008年1月至10月来自临床病人分离菌株246株，其中金黄色葡萄球菌31株，凝固酶阴性葡萄球菌32株，大肠艾希氏菌61株，肺炎克雷伯菌61株，铜绿假单胞菌31株，白色假丝酵母菌20株，化脓性链球菌10株，培养与鉴定均按全国临床检验规程第三版操作[3]。

以大肠艾希氏菌ATCC25922, 金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC27853，肺炎克雷伯菌ATCC700603为质控菌株(质控菌株购自甘肃省临检中心)。

1.2 实验方法1.2.1菌种保存：(1)纸片法：用无菌镊子取纸片，以无菌操作，在纸片上刮取复苏后纯培养18h的4-5个菌落，置于灭菌好的1.5ml带盖塑料离心管中，每管1片，盖紧塑料盖并封口，贴上瓶签，分为3组，置-20℃冰箱中保存。

标准菌株滤纸保存方法

标准菌株滤纸保存方法
1. 选择适合的滤纸：标准菌株滤纸通常采用高纯度、无荧光的纸张材料制成，确保
滤纸不会对菌株的生长和保存造成不良影响。

2. 干燥滤纸：在保存标准菌株之前，确保滤纸是干燥的。

湿润的滤纸可能导致菌株
的生长受阻或滤纸变形。

3. 使用无菌技术：在滤纸上放置菌株之前，使用无菌操作和工具，确保滤纸表面没
有任何其他微生物污染。

4. 均匀涂布菌株：将标准菌株均匀涂布在滤纸上。

确保每个滤纸上仅涂布一种菌株，并确保数量适当，避免菌株过浓或过稀。

5. 干燥滤纸：将涂布好菌株的滤纸放置在无菌室内自然晾干。

避免使用加热或其他
方法，以免菌株失活。

6. 使用质量可靠的保存袋：将干燥的滤纸用质量可靠的无菌塑料袋或密封容器密封，以防止滤纸被空气、湿气或其他污染物接触。

7. 标记保存袋：在保存袋上标记菌株名称、保存日期、所属实验室等必要信息，以
便今后识别和追溯。

8. 冷藏保存：将标记好的保存袋置于冷藏室中，温度通常保持在2-8摄氏度，以延长菌株的保存时间。

9. 避免频繁开启：为了确保滤纸保存袋的无菌性，避免频繁开启或加热保存袋。

每
次使用时，尽量一次取出所需菌株数量。

10. 定期更换：定期检查保存袋内滤纸上的菌株状态，如发现有异常，如变色、变形等，及时更换滤纸，并追溯原因以防止再次发生。

标准菌株滤纸的保存方法非常重要，它直接关系到菌株的质量和活力。

采用上述方法
可以有效保持标准菌株滤纸的无菌性和营养物质，延长菌株的保存时间，确保菌株的可靠
性和可用性。

菌种保藏的原理简介

菌种保藏的原理简介菌种保藏的具体方法很多，原理却大同小异。

首先要挑选典型菌种（typeculture）的优良纯种，最好采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）；其次，还要创造一个适合其长期休眠的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。

水分对生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在保藏中占有首要地位就不言而喻了。

五氧化二磷、无水氯化钙和硅胶是良好的干燥剂，当然，高度真空还可同时达到驱氧和深度干燥的双重目的。

除水分外，低温乃是保藏中的另一重要条件。

微生物生长的温度低限约在-30℃，可是，在水溶液中能进行酶促反应的温度低限则在-140℃左右。

这或许就是为什么在有水分的条件下，即使把微生物保藏在较低的温度下，还是难以较长期地保藏它们的一个主要原因。

在低温保藏中，细胞体积较大者一般要比较小者对低温更为敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。

其原因同低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤有关。

如果放到低温（不是一般冰箱）下进行冷冻时，适当采用速冻的方法，可因产生的冰晶小而可减少对细胞的损伤。

当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故快速升温也可减少对细胞的损伤。

当然，不同微生物的最适冷冻速度和升温速度也是不同的。

在实践中，发现用较低的温度进行保藏时效果更为理想，如液氮温度（-195℃）比干冰温度（-70℃）好，-70℃又比-20℃好，而-20℃则比4℃好。

一种良好的保藏方法，首先应能保持原菌的优良性状不变，同时还须考虑方法的通用性和操作的简便性。

具体的菌种保藏方法很多，其原理和应用范围各有侧重，优缺点也有所差别。

菌种主要保存方法1、传代培养保藏法；又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。

,一般要保存在5度,但因类而异,如霍乱,淋球,脑膜炎,厌氧菌,钩体等要保存于37度为宜.2、液体石蜡覆盖保藏法；是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

微生物菌种保藏方法

微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。

菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。

(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。

2 原理菌种保藏的方法很多。

其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。

使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。

依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。

一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。

3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。

3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。

3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。

4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。

在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。

在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。

5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。

5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。

这种方法一船可保藏三个月至半年。

5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。

一种保藏小单孢菌的简便方法─滤纸保藏法

一种保藏小单孢菌的简便方法─滤纸保藏法
廖爱芳;杨丽娜;林永珠
【期刊名称】《氨基酸和生物资源》
【年(卷),期】1996(18)3
【摘要】用滤纸法保藏７２株小单孢菌在冰箱１０℃无干燥条件下，保藏７年５个月后检查其存活率、抗菌活力，观察其形态特征、培养特征和生化特征。

结果表明，所保藏的菌种全部存活，且抗菌活力、生理特征等保持原有菌株的特征水平。

我们认为，用滤纸法保藏小单孢菌效果好，方法简便，适用于在临床上、工业生产上和科研中有实用价值的庆大霉素、小诺霉素、西梭霉素、小单孢菌的保藏。

【总页数】4页(P19-22)
【关键词】小单孢菌;保藏;滤纸保藏法
【作者】廖爱芳;杨丽娜;林永珠
【作者单位】福建省微生物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q93－336;Q939.11
【相关文献】
1.介绍一种简便的菌种保藏方法 [J], 钟启平
2.一种适用于醋厂的醋酸菌保藏方法 [J], 赵小锋;郭琪;张军;曾杨;杨鑫
3.介绍一种简便长期保藏醋酸菌的方法 [J], 王瑞果;王丽丽;陈学武
4.简便实用的食用菌菌种保藏方法 [J], 于爱红
5.一种保藏小单孢菌的简便有效方法—滤纸保藏法 [J], 廖爱芳;杨丽娜
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