Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测
酵母双杂交的原理和应用
酵母双杂交的原理和应用前言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究蛋白质间相互作用。
本文将介绍酵母双杂交的原理和应用，并详细说明相关实验步骤和注意事项。
一、酵母双杂交原理酵母双杂交利用酵母细胞中的转录因子来检测两个蛋白质是否发生相互作用。
该技术包括两个主要步骤：酵母杂交库的构建和蛋白质相互作用的检测。
1.酵母杂交库的构建–首先，需要构建一个酵母细胞库，其中包含目标蛋白的编码序列，以及与之它相互作用的蛋白编码序列。
–这些蛋白编码序列被插入一个特殊的酵母表达载体中，该载体包含一个转录因子启动子和一个可变启动子。
当目标蛋白与与之相互作用的蛋白结合时，转录因子被激活，并启动报告基因的表达。
2.蛋白质相互作用的检测–将酵母杂交库与一个可能与目标蛋白相互作用的蛋白质编码序列进行杂交。
–利用筛选或选择的方法，检测是否存在转录因子的激活，从而判断蛋白质是否发生相互作用。
二、酵母双杂交的应用酵母双杂交技术在生物学研究中有广泛的应用，主要用于以下方面：1.蛋白质相互作用的筛选–酵母双杂交可以用于大规模筛选蛋白质间的相互作用。
通过构建酵母杂交库，并与目标蛋白进行杂交，可以鉴定潜在的相互作用蛋白，从而探索蛋白质间的相互作用网络。
2.功能区域的鉴定–通过酵母双杂交，可以鉴定特定的蛋白质功能区域。
例如，在研究某个转录因子的结构和功能时，可以利用酵母双杂交技术识别其与其他蛋白质相互作用的功能区域。
3.药物靶点的鉴定–酵母双杂交可以用于鉴定药物的靶点。
通过与已知药物相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与特定药物相互作用的蛋白质，进而确定药物的作用机制和潜在靶点。
4.疾病相关基因的鉴定–酵母双杂交还可以用于鉴定疾病相关基因。
通过与疾病相关蛋白相互作用的酵母杂交库进行筛选，可以发现与疾病发生发展相关的基因，从而揭示疾病的发病机制。
三、酵母双杂交实验步骤酵母双杂交实验包括以下步骤：1.构建酵母杂交库：–从样品中提取RNA或DNA片段；–将片段克隆到酵母表达载体中；–将载体转化至酵母细胞中。
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》考试试卷(64)
河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出从组织中抽取RNA的关键步骤，并解释如何判断RNA质量。
答案：（1）从组织中提取RNA的步骤如下：①将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol裂解液溶解样品，充分吹打混匀。
②每1ml TRIzol加入2.0ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min。
③4℃，10000g离心15min，此时RNA主要包括集中在水相中。
④将水相转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置10min。
⑤4℃，10000g离心10min，此时可在离心管底部观察沉淀到白色沉淀，即为RNA。
⑥用75冷的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g以下，离心5min，弃上清。
⑦超净台中吹干，加入无RNase的水溶解。
（2）检测RNA质量的方法如下：①凝胶成像：取适量RNA溶液加入电泳缓冲液后，跑琼脂糖质谱仪，如果28S和18S条带明亮、清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则认为RNA的质量是好的。
②吸光度检测：使用紫外分光光度计检测RNA样品在260nm、280nm处的吸光度，若两者的比值在1.8～2.0时，可认为RNA纯度良好，蛋白质等其他物质的污染有机物可以接受。
解析：2、判断题（55分，每题5分）1. TDNA插入会导致某些基因表达的缺失，但不会引起植物的致死现象。
（）答案：错误解析：如果TDNA插入到对于植物发育非常重要的基因性状上，就会引起植物的致死弊病。
2. 端粒的序列在同一细胞各条染色体上都是相同的。
（）答案：正确解析：端粒为每个染色体末端特化的部位，着色较深。
由端粒DNA和端粒蛋白组成。
其首要作用主要是防止染色体降解、粘连，抑制细胞凋亡，与细胞寿命长长短有关。
(完整版)酵母双杂交原理
酵母双杂交系统原理酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA 结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。
因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。
报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。
〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。
〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。
酵母双杂交原理ppt演示
当两个蛋白质之间发生相互作用时，DNA结合域和转录激活域之间的空间构象发生 变化，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交系统的应用领域
蛋白质相互作用研究
通过酵母双杂交系统可以检测蛋白质 之间的相互作用，为研究蛋白质的功 能和调控机制提供有力支持。
将诱饵蛋白基因克隆到表达载 体中，转化大肠杆菌进行表达。
通过亲和纯化技术，如镍柱亲 和纯化，分离纯化诱饵蛋白。
目的
• 制备钓饵蛋白，用于与诱饵蛋白进行相互作用筛 选。
目的
• 将诱饵蛋白和钓饵蛋白导入酵母细胞中， 通过相互筛选找到与诱饵蛋白相互作用的 蛋白质。
目的
• 验证筛选得到的阳性克隆是否真正与诱饵蛋白相互作用。
03 酵母双杂交系统的应用实 例
蛋白质相互作用研究
01 02
蛋白质相互作用研究
酵母双杂交系统能够用于研究蛋白质之间的相互作用，通过将两个蛋白 质分别与转录激活域和转录抑制域融合，观察它们之间的相互作用是否 会导致转录活性的变化。
验证已知相互作用
利用酵母双杂交系统可以验证已知的蛋白质相互作用，从而验证相关生 物学过程的机制。
缺点
由于酵母双杂交系统依赖于真核生物的转录调控机制，因此对于某些在酵母中 不表达或表达水平较低的蛋白质可能无法检测到相互作用。此外，酵母双杂交 实验也可能受到非特异性干扰因素的影响。
02 酵母双杂交系统的实验流 程
目的
• 制备诱饵蛋白，用于筛选与钓饵蛋白相互作用的蛋白质。
步骤
设计诱饵蛋白的基因序列，确 保其在大肠杆菌中表达，并具 有可纯化的标签。
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。
酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。
这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。
2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。
3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。
4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。
例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。
总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。
OsRUS2.1酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测
OsRUS2.1酵母双杂交猎物载体的构建及其细胞毒性和自激活作用检测潘家强;侯学文【摘要】采用 PCR 技术扩增水稻根UV‐B 敏感基因2.1(ROOT UV‐B S EN S IT IV E 2.1,RUS2.1)四个不同片段[OsRUS2.1(1‐1317),OsRUS2.1(1‐138),OsRUS2.1(139‐879),OsRUS2.1(880‐1317)],连接到 T 载体pMD18‐T‐Simple 上,测序无误后分别亚克隆到猎物表达载体 pGADT7上.结果表明：四个OsRUS2.1基因片段的表达载体构建成功,读码框正确；分别转化这四个猎物表达载体于酵母感受态细胞 Y187中,用 LacZ 、M EL1活性检测法和营养缺陷型培养基SD‐Leu‐DO 培养法进行自激活检测和毒性检测,结果表明构建的四个OsRUS2.1不同片段的猎物表达载体对酵母菌株 Y187均没有转录激活活性和毒害作用,可用于后续研究.%Four fragments of rice(Oryza sativa)ROOT UV‐B SENSIT IV E 2 .1(OsRUS2 .1) ,OsRUS2 .1(1‐1317) , OsRUS2 .1(1‐138) ,OsRUS2 .1 (139‐879) ,OsRUS2 .1 (880‐1317) ,were amplified by PCR from cloned OsRUS2 .1 plasmid ,and were ligated with pMD18‐T‐simple vector ,then transformed to E .coli TOP10 competent cell .The posi‐tive clones were selected and sequenced .The confirmed fragments were subcloned to prey vector pGADT 7 .The four constructed pGADT7 prey vectors were further confirmed by enzyme digestion and sequencing . The confirmed 4 types of pGADT7 prey vectors were transformed to Y187 yeast c ompetent cells .The self‐activation and toxicity of the plasmids to host yeast Y187 were detected by LacZ and MEL1 activity assays and culturing in auxotroph medium SD‐Leu ‐DO .Results showed that the fourconstructed plasmids had no self‐transcriptional a ctivity and not toxicity to yeast strain Y187 ,and they could be used in the following yeast two‐hybrid experiments .【期刊名称】《广西植物》【年(卷),期】2013(000)001【总页数】6页(P76-81)【关键词】水稻根对敏感基因 2.1;猎物载体;酵母双杂交;自激活;毒性检测【作者】潘家强;侯学文【作者单位】华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室，广州 510642;华南农业大学生命科学学院分子植物生理研究室，广州 510642; 华南农业大学生命科学学院植物功能基因组与生物技术重点实验室，广州 510642【正文语种】中文【中图分类】Q782UV-B是太阳辐射的组成部分，它能够穿过大气层到达地表，但到达地表的UV-B 辐照强度与季节、云层厚度以及大气层臭氧含量有关。
酵母双杂交的原理及其应用
酵母双杂交的原理及其应用
酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，通过构建酵母中的两个蛋白质相互作用所需要的分子间的结合，结合情况可以检测相互作用的程度或强度。
酵母双杂交的原理是基于兰伯特-贝尔特微分方程（Lambert-Beer-Bouguer Law），该方程描述了光强与溶液中物质的浓度之间的关系。
在双杂交中，一对目标蛋白质分别与两个不同的报告蛋白质（通常是启动子与其相应的转录激活因子）结合，形成一个蛋白质复合物。
当这两个蛋白质相互作用时，可以观察到报告蛋白质转录水平的上升。
酵母双杂交的应用广泛，可以用于以下方面：
1. 识别蛋白质-蛋白质相互作用：通过构建大规模的蛋白质相互作用图谱，可以帮助研究人员理解细胞内蛋白质相互作用网络的组织和功能。
2. 确定蛋白质结构和功能：通过和其他蛋白质的相互作用，可以获得相关蛋白质的结构和功能信息。
3. 寻找药物靶点：酵母双杂交可以用于筛选潜在的药物靶点，从而帮助药物研发。
4. 研究疾病机制：通过了解蛋白质之间的相互作用，可以揭示疾病的发生机制，
为疾病的治疗提供新的思路和方法。
总的来说，酵母双杂交技术是一种有效的方法，可以用于研究蛋白质相互作用和功能，对于生命科学研究具有重要的意义。
酵母双杂交检测（Yeast
酵母双杂交检测（Yeast Two酵母双杂交检测（Yeast Two-Hybrid Assay）产品专题检测原理：酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid assay）是⽤于体内研究蛋⽩相互作⽤的⼀种⾮常便利的⼯具，常⽤的如GAL4为基础的系统，使⽤酵母转录因⼦GAL4来检测转录激活后的蛋⽩相互作⽤。
某些转录因⼦（如GAL4）由两个可以分开，功能上相互独⽴的结构域组成，N端有⼀个147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain，BD），C端有⼀个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain，AD）。
BD可以和上游激活序列（UAS）结合，⽽AD能激活UAS下游基因进⾏转录。
单独的BD或AD不能激活基因转录，两者只有通过某种⽅式结合在⼀起形成完整的转录激活因⼦的功能【见图1】。
酵母双杂交系统主要利⽤酵母GAL4的这个特性通过两个杂交蛋⽩在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来研究活细胞内蛋⽩质的相互作⽤，对蛋⽩质之间微弱、瞬间的作⽤都能通过报告基因敏感的检测到。
酵母双杂交系统应⽤：1）对新的与已经蛋⽩相互作⽤的鉴定2）对预测蛋⽩相互作⽤的确认3）对蛋⽩相互作⽤区域的鉴定双杂交检测原理图。
两个蛋⽩分别表达，⼀个（诱饵蛋⽩bait protein）融合到Gal4 DNA 图1.双杂交检测原理图。
结合域表达，另⼀个（诱捕蛋⽩prey protein）融合到Gal4转录激活结构域（AD）表达。
在Y2HGold酵母菌株中，只有当两个蛋⽩之间相互作⽤并结合到Gal4反应性启动⼦上才能活化报告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表达。
酵母双杂交系统重要元件介绍（以Matchmarker GAL4-based two hybrid assay为例）诱饵（the bait）⼀、⼀、诱饵（为了建⽴GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩，推荐使⽤质粒pGBKT7；要调查三元蛋⽩复合物，推荐使⽤含2个MCS区域的三杂交载体，能表达GAL4 DNA-BD/bait融合蛋⽩和第⼆个感兴趣蛋⽩，在bait和prey蛋⽩之间发挥桥梁作⽤。
酵母双杂交实验原理
酵母双杂交实验是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验方法，它基于真核生物调控转录起始过程的机制。
酵母双杂交实验主要通过检测两个蛋白质在酵母细胞中的相互作用，从而揭示它们在生物体内的功能和相互作用。
酵母双杂交实验原理如下：
1. 构建重组质粒：首先，将目标蛋白质的表达载体与酵母双杂交系统中的启动子、激活子等调控元件进行重组，得到重组质粒。
2. 转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，使目标蛋白质在酵母细胞中表达。
3. 筛选融合蛋白：利用选择性培养基，筛选出成功表达目标蛋白质的酵母细胞。
4. 鉴定蛋白质互作：将筛选出的酵母细胞进行混合、共培养，观察转录激活效应。
如果两个蛋白质之间存在相互作用，它们会结合在一起，形成完整的转录激活因子，从而激活报告基因的转录。
通过检测报告基因的表达水平，可以判断蛋白质之间是否发生相互作用以及作用强度。
5. 结果分析：根据实验结果，分析蛋白质之间的相互作用，进一步研究它们在生物体内的功能和调控机制。
目前常用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种。
LexA系统基于原核蛋白LexA的DNA结合域和转录激活域，而Gal4系统则利用了酵母转录激活因子GAL4的DNA结合域和转录激活域。
这两种系统在实验操作和应用范围上略有不同，但均具有较高的灵敏度和特异性。
酵母双杂交 原理
酵母双杂交原理
酵母双杂交原理是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用和信号转导通路。
该技术利用酵母细胞中的两个互补的基因片段，将它们分别与两个感兴趣的蛋白质的编码基因融合，形成一个融合蛋白。
当这两个融合蛋白在酵母细胞中相互作用时，就会激活一个报告基因，从而实现对蛋白质相互作用的检测。
酵母双杂交技术的基本原理是利用酵母细胞中的两个互补的基因片段，将它们分别与两个感兴趣的蛋白质的编码基因融合，形成一个融合蛋白。
其中一个融合蛋白包含了DNA结合域，另一个融合蛋白包含了激活域。
当这两个融合蛋白在酵母细胞中相互作用时，就会激活一个报告基因，从而实现对蛋白质相互作用的检测。
酵母双杂交技术的优点是可以在活细胞中直接检测蛋白质相互作用，而不需要纯化蛋白质。
此外，该技术可以用于高通量筛选，可以同时检测多个蛋白质相互作用，从而加快了研究进程。
酵母双杂交技术的应用非常广泛，可以用于研究蛋白质相互作用、信号转导通路、基因调控等方面。
例如，利用酵母双杂交技术可以筛选出与某个蛋白质相互作用的蛋白质，从而揭示其功能和调控机制。
此外，该技术还可以用于筛选药物靶点，从而为药物研发提供新的思路和方法。
酵母双杂交技术是一种重要的分子生物学技术，可以用于研究蛋白
质相互作用和信号转导通路等方面。
该技术具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点，是现代生命科学研究中不可或缺的工具之一。
酵母双杂交的作用
酵母双杂交系统酵母双杂交系统酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。
大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。
因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。
当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。
另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。
例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。
为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。
研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。
酵母双杂交技术
酵母双杂交技术引言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该技术能够检测和分析细胞内发生的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、代谢途径和疾病发生机制。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。
原理酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。
当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。
具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤：1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。
2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。
3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。
4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。
一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。
应用1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白质之间的相互关系和调控机制。
2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。
3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研发过程。
优缺点酵母双杂交技术具有以下优点：•高通量：酵母双杂交技术可以同时检测大量蛋白质之间的相互作用，有助于加速研究的进程。
•对新蛋白质相互作用的发现：酵母双杂交技术可以帮助发现未知的蛋白质相互作用，有助于揭示新的细胞信号传导途径和代谢途径。
•相对简洁易行：酵母双杂交技术不需要复杂的实验设备，相对容易实施。
博士硕士研究生入学考试-细胞生物学-简答论述及参考答案
1.简述酵母双杂交系统原理及应用答：酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。
酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。
许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。
但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质。
2.miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA的区别和联系答：miRNA，siRNA，dsRNA和shRNA都是RNA干扰技术中用到的小分子RNA，其不同之处在miRNA 是单链RNA，其余均为双链RNA；siRNA和dsRNA相似；shRNA需通过载体导入细胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。
3.试述磷酸酰肌醇双信号通路的基本内容及功能答：在这一信号转导途径中,膜受体与其相应的第一信使分子结合后，激活膜上的Gp蛋白(一种G蛋白),然后由Gq蛋白激活磷酸脂酶Cβ (phospholipase Cβ, PLC), 将膜上的脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol biphosphate, PIP2)分解为两个细胞内的第二信使：二酰甘油( diacylglycerol, DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)。
酵母双杂交自激活检验原理
酵母双杂交自激活检验原理
酵母双杂交自激活检验原理是一种利用两个不同基因组的酵母株进行双杂交，使得一个酵母株与另一株酵母株之间的合作关系形成，从而使其中一个杂交和另外一个杂交可以活化它们原本被遗忘的基因。
通过这种方法，可以识别出酵母菌的激活基因并鉴定其功能。
酵母双杂交自激活检验原理是一种利用两个不同基因组的酵母株进行双杂交，从而形成一个酵母株与另一株之间的合作关系。
每个酵母株中都有一个传统上被称为“特异性杂交”(SP)的杂交，以及一个较新的类型的杂交，称为“自激活”(SA)的杂交。
在SA杂交中，其中一个杂交可以激活另外一个杂交中被遗忘的基因，使其可以进行正常的生物学功能。
通过利用这种双杂交系统，被激活的基因的功能可以通过观察杂交的表型变化而被识别出来。
因此，酵母双杂交自激活检验原理是一种非常有效的方法，用于识别出被遗忘的基因以及其功能。
它能够发挥其潜在的功能，使研究者可以更好地理解和操控复杂的生物途径和功能。
另外，酵母双杂交自激活检验原理也有助于模拟了真实细胞环境中的复杂感应反应，并为许多分子生物学的研究提供新的可能性，以期望发掘到更多未知的基因功能。
酵母双杂交自激活检验原理是未来生命科学实验室研究进步的重要工具，将提供基本生命科学以及分子生物学研究的更多新发现，以改善人类的健康和福祉。
酵母双杂交的一些问题
研究蛋白互作的方法蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。
我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧常用的体外互作研究方法：1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h)酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
“假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
酵母双杂交实验原理及具体步骤
酵母双杂交原理：酵母双杂交（Yeast two-hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用研究技术，用于检测蛋白质间的物理相互作用关系。
其原理基于转录因子的两个功能域的可拆分性。
①转录因子可拆分性：构建酵母诱饵（bait）和猎物（prey）表达载体：将目标蛋白分别将其编码序列分别克隆到两个表达载体中。
其中，诱饵载体通常包含一个“催化域”（activation domain，AD），用于连接目标蛋白和转录激活子域；猎物载体通常包含一个“DNA结合域”（DNA binding domain，BD），与转录因子的靶位点序列结合。
通过将目标蛋白的相互作用引入到转录因子中，可以重新组装功能域并激活报告基因表达。
②目标蛋白的诱饵和猎物构建：将目标蛋白分别克隆到诱饵载体和猎物载体中。
诱饵载体中的目标蛋白与BD结合，形成诱饵蛋白-BD复合物；猎物载体中的目标蛋白与AD结合，形成猎物蛋白-AD复合物。
③互补的转录因子和报告基因：将诱饵和猎物载体转化到同一酵母细胞中，诱饵蛋白与猎物蛋白发生相互作用后，诱饵蛋白的BD域与猎物蛋白的AD域重新组装为完整的转录因子。
该转录因子能够结合到特定的报告基因启动子上，激活报告基因的表达。
④报告基因表达和筛选：通过培养在所选的选择性培养基上，只有发生了特定蛋白相互作用的酵母细胞才能生长。
选择性培养基可能缺乏某些必需营养物质，当酵母菌株与目标蛋白质发生相互作用时，新的遗传特征和功能产物的表达则能够弥补酵母细胞在选择性培养基上的缺陷。
例如，当使用缺乏组氨酸（histidine）的培养基时，只有酵母菌株表达了完整的转录因子，才能够合成组氨酸并正常生长。
⑤结果验证：据此可以筛选出具有蛋白相互作用的酵母突变株。
验证通常通过进一步的亲和试验（如共免疫沉淀）或其他技术（如荧光共定位）来确认蛋白质相互作用的可靠性。
总体来说，酵母双杂交实验通过利用转录因子可拆分性的原理来检测蛋白质的相互作用。
请详述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤。
请详述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤。
酵母双杂交是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质相互作用和基因功能。
酵母双杂交的基本原理是利用酵母细胞中的转录激活因子来检测两个蛋白质相互作用。
该技术基于转录激活因子在酵母细胞中诱导报告基因表达的原理。
核心思想是将需要检测
相互作用的两个蛋白质分别与两个互补的转录激活因子结合，从而使这两个转录激活因子
相互结合并激活报告基因的表达。
具体操作步骤如下：
1. 构建酵母双杂交载体：
- 选择一个载体，将一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基因
之间，构建转录激活因子的融合蛋白。
- 在另一个载体上将另一种转录激活因子的DNA序列插入该载体中的启动子和报告基
因之间。
2. 转化酵母细胞：
- 将上述构建好的双杂交载体分别转化进酵母细胞中。
这一步骤常用的方法有直接转化、化学转化或电击转化。
- 在转化后，将酵母细胞培养至适当的条件，以使其能够自我复制并表达融合蛋白。
3. 鉴定蛋白相互作用：
- 将转化后得到的酵母细胞分别进行孵育和培养。
- 如果两个融合蛋白能够相互结合，其结合后的转录激活因子能激活报告基因的表达，则酵母细胞会在选择性培养基上生长，形成菌落。
- 将生成的菌落进行筛选和鉴定，确定其是否存在转录激活作用。
常用的方法有β-
半乳糖苷酶报告基因检测、荧光素酶报告基因检测等。
通过上述酵母双杂交的基本原理和具体操作步骤，可以很方便地研究蛋白质相互作用
和基因功能。
酵母双杂交技术的原理及其应用
酵母双杂交技术的原理及其应用1. 引言酵母双杂交技术是一种经典而常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质间相互作用以及蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理及其应用。
2. 原理酵母双杂交技术基于酵母细胞内的转录因子相互作用原理，利用酵母细胞内的转录活性来检测蛋白质间的相互作用。
其基本步骤如下：1.构建载体：将目标蛋白质的编码序列克隆到酵母双杂交载体中，该载体通常包含一个激活域和一个DNA结合域。
2.构建酵母菌株：将构建好的双杂交载体转化到酵母菌株中，产生转录因子的表达。
3.杂交实验：将两个不同的酵母菌株分别转化目标蛋白质的编码序列，使得两个蛋白质分别与激活域和DNA结合域相连。
4.检测蛋白质相互作用：利用报告基因检测酵母菌株中的转录活性，若目标蛋白质间存在相互作用，则报告基因被激活，并产生可观察的表型。
3. 应用3.1 蛋白质相互作用研究酵母双杂交技术广泛应用于研究蛋白质间的相互作用关系。
通过构建不同的载体和菌株，可以很方便地筛选和鉴定蛋白质相互作用的结构域和关键基序。
这有助于揭示蛋白质相互作用的机制和信号通路。
3.2 酶底物筛选酵母双杂交技术还可以用于酶底物的筛选。
通过将酶和可能的底物序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以快速筛选出与酶底物结合的蛋白质。
这对于研究酶的底物特异性和酶促反应机理具有重要意义。
3.3 药物靶点筛选利用酵母双杂交技术，可以通过构建包含药物分子和可能的靶点蛋白质的双杂交载体，进行药物靶点的筛选。
这种方法可以高效地从大量的分子库中筛选出与药物相互作用的潜在靶点，对于药物开发具有重要意义。
3.4 蛋白质与DNA/RNA相互作用研究除了研究蛋白质间相互作用外，酵母双杂交技术还可以用于研究蛋白质与DNA/RNA的相互作用。
通过将DNA/RNA序列与目标蛋白质的编码序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以检测蛋白质与DNA/RNA的相互作用，并进一步研究该相互作用的功能和调控机制。
酵母双杂交名词解释
酵母双杂交名词解释酵母双杂交名词解释酵母双杂交是基因学领域的研究方法之一，其主要是通过两种不同类型的酵母菌之间的交配达到检测基因交互作用的目的。
在酵母双杂交中，每个基因都被分别连接到酿酒酵母中唯一的两个分子，利用蛋白质交互作用而使得两种酵母菌互相连接并产生可观测的效果。
本文将按类别对酵母双杂交进行详细解释。
1. 酵母：酵母是一类单细胞真菌，研究人员可以利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模式生物进行基因研究。
酵母具有许多极其有用的特性，比如其遗传可重复性很高，因此研究人员可以利用酵母来进行基于DNA的研究。
2. 双杂交：双杂交是指一种检测蛋白质相互作用的方法。
该方法通过在酵母的细胞内部形成蛋白质复合物，而使蛋白质相互作用的结果在酵母细胞内可观测到，从而达到检测蛋白质交互作用的目的。
在酵母双杂交中，两种酵母菌互相连接，产生可观测的效果。
研究人员可以利用该方法来检测不同蛋白质之间的交互作用。
3. 名词解释：酵母双杂交可以被定义为一种鉴定基因交互作用的方法，该方法通过酵母细胞内的蛋白质交互作用导致的效果来检测基因交互作用。
同时，酵母双杂交也可以被定义为酿酒酵母之间的一种孢子杂交法。
4. 操作方法：酵母双杂交技术需要利用DNA重组方法，将目标基因在拼接时连接到酵母二杂交系统（Y2H）中的激活子，而将其连接到另一种被测体系（prey）中，还需要使用质粒在酵母菌当中进行转化；随后，其菌落在关键培养基上生长出菌丝，涂上试纸液，观察菌落是否变色，判断蛋白之间的作用是否发生。
总之，酵母双杂交在基因学领域中发挥着重要的作用，在生物学的方方面面都有着广泛的应用。
它是许多基因测序研究的前提，也是基因组学的核心研究方法之一。
我们相信，随着科技的不断提高，这一技术将发挥更加巨大的作用，进一步推动基因学领域的发展。
酵母双杂交自激活
蛋白质相互作用在细胞生物学和疾病中的作用。
此外，酵母双杂交系统还可以用于筛选新的药物靶点或鉴定新
03
的治疗策略。
酵母双杂交系统的优缺点
优点
酵母双杂交系统具有高灵敏度和特异性，能够检测到低亲和力的相互作用。此外 ，它还具有高通量和高可重复性的特点，可以同时检测多个蛋白质之间的相互作 用。
缺点
然而，酵母双杂交系统也存在一些局限性。例如，它可能受到酵母细胞内其他因 素的影响，导致假阳性结果。此外，由于酵母细胞与人类细胞存在差异，因此某 些在酵母细胞中检测到的相互作用可能无法在人类细胞中重现。
蛋白质的相互作用可以通过多种方式进 在酵母双杂交实验中，了解蛋白质之间 行，例如通过蛋白质的直接接触或通过 的相互作用有助于预测自激活的可能性， 与它们相关的其他分子之间的相互作用。 并采取措施避免或减少这种现象的发生。
基因表达水平的影响
基因表达水平对酵母双杂交自激活也有重要影响。当一个基因的表达水平过高时， 它可能会产生过多的蛋白质，导致自激活。
2
该系统基于两种基本的酵母转录因子，即GAL4 和STE12，它们可以分别与DNA结合并激活转录。
3
当一个转录因子与另一个转录因子结合时，它们 可以形成一个杂合二聚体，从而激活转录。
酵母双杂交系统的应用
01
酵母双杂交系统被广泛应用于研究蛋白质之间的相互作用，特 别是在信号转导和转录调控领域。
02
它可以帮助科学家确定蛋白质相互作用的结构基础，以及研究
酵母双杂交自激活
目录
• 酵母双杂交系统简介 • 酵母双杂交自激活的发现与确认 • 酵母双杂交自激活的影响因素
目录
• 酵母双杂交自激活的调控策略 • 酵母双杂交自激活的实际应用 • 未来展望与研究方向
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Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测作者：滑玮，张伟，吕海鹏，辛晓燕【关键词】凋亡；Bit1基因；酵母菌双杂交；报告基因Expression of Bit1 gene in a yeast twohybrid system and reporter gene activation assay【Abstract】 AIM: To construct a bait vector with Bit1 gene in yeast twohybrid system GAL4, and assay whether Bit1 gene expression product affects the growth of host yeast cells and activates the reporter genes in the yeast twohybrid system. METHODS: The Bit1 gene fragments were amplified by RTPCR from ovarian cell Caov3, and cloned into pUC19 for DNA sequencing. After verified by DNA sequencing, they were subcloned into the bait vector pGBKT7 of yeast twohybrid system GAL4, and the rebinant plasmids were subsequently transferred into yeast cell AH109, and its expression product was tested whether it could activate the reporter genes in the yeast twohybrid system. RESULTS: The Bit1 gene fragments were successfully amplified, and their expression product showed to be nontoxic to AH109 cells, and did not activate the reporter genes of the GAL4 system. CONCLUSION: Yeast twohybrid GAL4 system can be utilized to study Bit1interacting protein.【Keywords】 apoptosis; Bit1; yeast twohybrid system; reporter genes 【摘要】目的：用Bit1基因片段构建酵母双杂交诱饵载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法：运用RTPCR 技术从卵巢癌细胞系Caov3中扩增出Bit1基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果: 成功获得Bit1基因片段，Bit1基因表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用. 结论：可以利用酵母双杂交Gal4系统来研究与Bit1相互作用的蛋白.【关键词】凋亡；Bit1基因；酵母菌双杂交；报告基因【中图号】 R7370引言酵母双杂交系统是一种直接在真核细胞内检测蛋白相互作用的方法，具有灵敏度高和特异性好的优点.自1989年由Fields等［1］提出并初步建立以来，得到了不断的完善和改进，在细胞生物学，肿瘤学，蛋白质组学等诸多领域有着广泛的应用［2-3］. Jan等［4］在研究bcl2转录调控的实验中，发现了一种可下调bcl2表达的新基因，并因其功能而命名为Bit1（bcl2 inhibitor of transcription 1）.研究表明，胞浆内Bit1浓度的升高可以明显促进凋亡的发生，而其浓度的降低可以减少凋亡的发生.我们拟利用酵母双杂交GAL4系统，构建Bit1蛋白即诱饵蛋白，以期从人脑cDNA文库中钓取可与之结合的蛋白基因，为研究细胞凋亡的发生和调节提供新的思路和实验依据.1材料和方法材料卵巢癌细胞系Caov3购自中国医科大学细胞生物研究所，表达载体pGBKT7及酵母菌种AH109购自Clontech公司.质粒pUC19由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室张伟博士惠赠. 逆转录酶购自Promega公司；PCR试剂盒，DNA重组所用的限制性内切酶购自Takara公司；T4 DNA连接酶购自Gibco 公司；质粒提取试剂盒，DNA电泳胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；酵母培养基购自Clontech公司.方法扩增Bit1基因自行设计出克隆Bit1基因的引物.常规培养Caov3细胞，提取细胞总RNA, 加入下游引物和逆转录酶，45℃各作用30 min进行逆转录,反应条件为：70℃ 10 min, 42℃ 45 min, 95℃ 5 min. 再取逆转录产物加入引物P1和P2扩增Bit1基因.PCR反应条件为：94℃ 30 s, 61℃ 45 s，72℃ 50 s，共进行38个循环.产物克隆及鉴定纯化的RTPCR产物经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，定向克隆入pUC19质粒，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选.酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆，命名为pUC19－Bit1，然后进行序列分析.构建及鉴定诱饵载体用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pUC19－Bit1和表达载体pGBKT7，回收Bit1基因及pGBKT7载体片段，载体片段与Bit1基因连接后转化大肠杆菌DH5α.经限制性内切酶分析,含正确插入片段的克隆命名为pGBKT7－Bit1.制备酵母感受态细胞随机挑取几个酵母菌AH109克隆，接种于50 mL YPDA 液体培养基中，振荡培养至A600=～在室温下将培养液离心，弃上清，重悬沉淀，洗涤酵母细胞.再离心取沉淀，用mL 1×TE/LiAc溶液重悬，即为酵母感受态细胞.转化酵母感受态细胞将构建好的诱饵载体，鲱鱼精DNA和酵母感受态细胞，混匀后加入 mL PEG/LiAc溶液.在30℃振荡培养, 加入DMSO后混匀, 在42℃水浴15 min, 冰浴2 min,离心, 去上清，以mL 1×TE重悬细胞后，铺于SD/Trp 平板.于30℃培养36 h左右，直至带有诱饵载体的酵母克隆长出.和LacZ报告基因表达的检测用无菌牙签随机挑取酵母菌单个克隆，分别划线于有Trp，Ura，His，Leu营养缺陷的SD平板上，于30℃培养36 h，观察酵母菌的生长情况. 采用β半乳糖苷酶印膜法检测lacZ报告基因的表达.用无菌牙签随机挑取酵母单个克隆，点样于硝酸纤维素滤膜上.将带有酵母克隆的滤膜在液氮中迅速冷冻5 s后，置于室温裂菌.将点有菌体的滤膜面朝上，放在另一张同样大小浸有Z buffer/Xgal的Whatman#1滤纸上，去气泡，于30℃孵育30 min~8 h，观察颜色变化.2结果基因的扩增采用优化的逆转录方法对人卵巢癌细胞系Caov3总RNA进行逆转录，然后在50 μL反应体系中继续扩增反应.取RTPCR扩增产物10 μL，在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，可见与预期大小一致的600 bp左右的DNA片段（图1）.重组质粒pUC19－Bit1的酶切鉴定及测序用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pUC19质粒及PCR产物，回收pUC19载体片段及Bit1蛋白基因片段，连接后获得的重组质粒命名为pUC19－Bit1.再用EcoRⅠ和BamHⅠ对pUC19－Bit1质粒进行酶切鉴定（图2）.鉴定正确的pUC19－Bit1重组质粒分别作正反向测序，测序结果经与Genbank中的Bit1序列（NM_016077）比较分析表明，扩增得到的Bit1蛋白基因片段与原序列完全相符.图1Bit1基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略）图2重组质粒pUC19bit1 的EcoR I，BamHI双酶切鉴定（略）重组质粒pGBKT7－Bit1的酶切分析再分别用EcoRⅠ和BamHⅠ将Bit1基因片段从质粒pUC19－Bit1亚克隆入pGBKT7载体，重组质粒pGBKT7－Bit1的酶切鉴定结果(图3).报告基因表达的检测将含有单纯AH109和含有pGBKT7Bit1质粒的酵母菌AH109单个菌落挑出，分别划线接种于有Ura，Trp，Leu和His营养缺陷的SD 平板上，于30℃培养36 h后, 可见单纯AH109酵母菌只在SD/Ura平板上生长，而含有pGBKT7 Bit1质粒的AH109酵母菌可以在SD/Ura和SD/Trp平板上生长，在SD/His和SD/Leu平板上不生长.报告基因表达的检测将pCL1质粒转化入AH109作为阳性对照，将pGBKT7 Lams和pGADT7－T质粒共转化入AH109作为阴性对照，用β半乳糖苷酶印膜法来检测含pGBKT7Bit1质粒的AH109酵母细胞内LacZ报告基因的表达情况.结果显示LacZ报告基因不被Bit1激活.图3重组质粒pGBKT7bit1经EcoRI，BamHI双酶切鉴定（略）3讨论酵母双杂交技术是近十几年来发展起来的研究蛋白质－蛋白质相互作用的一种方法，其基本原理是：一些转录激活因子（如酵母的Gal4蛋白和细菌的LexA 蛋白），往往由两个在结构上可以分开而在功能上又相互独立的结构域构成，这两个结构域只要在同一细胞内能够彼此靠近，就可以激活下游报告基因的表达［5］.如果将诱饵蛋白融合到一个结构域上，而将表达文库构建到另一个结构域上，就可以筛选到与诱饵蛋白相互作用蛋白的基因.酵母双杂交Gal4系统3是在系统1和系统2基础上的改进，具有转化效率高，假阳性率低等优点.酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取与已知蛋白直接相互作用分子的方法.对于未知功能的蛋白质，如能钓到与之相互作用的已知蛋白，将对其功能的研究具有明确的指导方向.将诱饵蛋白融合到Gal4蛋白的一个结构域上以后，利用此融合蛋白去筛选构建在另一个结构域上的表达文库之前，就必须要验证融合到一个结构域上的诱饵蛋白本身对下游的报告基因有无激活作用，否则便会在cDNA文库筛选时出现假阳性结果.张伟等［6］就报告用HBV Pres与Pres1构建的酵母系统即有自激活作用，这样便不能直接用于cDNA文库的筛选. 我们用含有Bit1基因的重组质粒转化酵母菌，通过不同方法对报告基因的表达进行检测，结果表明Bit1基因不具有自激活作用，这样我们就可以直接利用Bit1作为诱饵，从人cDNA 文库中钓取与其相互作用的蛋白.凋亡是一种程序性细胞死亡，在胚胎发生与组织内环境稳定过程中发挥着重要的作用［7］. 脱落凋亡(Anoikis)［8-9］是指细胞与细胞外基质脱粘连而引起的凋亡.整合素与细胞外基质的结合并上调Bcl2基因的表达能够抑制这种凋亡的发生.为了探索细胞内是否存在其他分子参与了Bcl2基因的上调表达以及细胞成活，Jan等［4］构建了一个特殊的CHO细胞系.该细胞系的特点是，胞膜上的整合素α5β1的胞内部分被截掉，从而阻断了整合素引起的Bcl2基因的上调表达.然后将cDNA文库质粒和bcl2基因启动子控制下的GFP表达质粒共转染该细胞系，以筛选能调节bcl2基因表达的细胞分子.经筛选后获得了5个细胞克隆，其中一个细胞克隆含有的就是bit1基因.Bit1蛋白存在于线粒体中，如果Bit1从线粒体中释放至胞浆，或者在细胞胞浆中表达Bit1蛋白，都可以引起相应细胞的凋亡.利用酵母双杂交技术可以精确有效的发现并研究与Bit1蛋白发生相互作用的分子，对脱落凋亡发生和调节机理的进一步探索有着重要的意义.【参考文献】［1］ Fields S, Song O. A novel genetic system to detect proteinprotein interactions［J］. Nature, 1989,340:245-246.［2］ White MA. The yeast twohybrid system: forward and reverse ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:10001-10003.［3］ Gietz RD, Woods RA. Screening for proteinprotein interactions in the yeast twohybrid system［J］. Methods Mol Biol,20XX,185:471-486.［4］ Jan Y, Matter M, Pai JT, et al. Mitochondrial protein, Bit1, mediates apoptosis regulated by integrins and Groucho/TLE corepressors ［J］. Cell, 20XX, 116:751-762.［5］ Luban J, Goff SP. The yeast twohybrid system for studying proteinprotein interaction［J］. Curr Opinion Biotechnol, 1995, 6:59-64.［6］张伟，刘新平，张，等. 乙型肝炎病毒前S区不同片段在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测［J］. 第四军医大学学报,20XX,23:509-514.［7］ Jacobson MD, Weil M, Raff MC. Programmed cell death in animal development［J］. Cell, 1997,88:347-354.［8］ Frisch SM, Ruoslahti E. Integrins and anoikis［J］. Curr Opin Cell Biol, 1997,9:701-706.［9］ Frisch SM, Screaton RA. Anoikis mechanisms［J］. Curr Opin Cell Biol, 20XX,13:555-562。