鸭源抗鹅细小病毒卵黄抗体的制备_刘大鹏

取卵黄琼扩效价≥1∶64 的高免鸭蛋， 用清水 清洗蛋壳，吹干，常规熏蒸法消毒。手动打蛋，取出 卵黄，最大限度除去蛋清，划破卵黄膜，集中收集 流出的卵黄液。
将分离的卵黄加入 9 倍体积的去离子水，搅拌 均匀，并调 pH 值稳定至 5.1，4 ℃静置过夜（＞12 h）， 次 日 分 离 上 清 ，参 照 文 献 ［5］的 方 法 进 行 真 空 膜 抽 滤，进一步去除残留的脂类，获得鸭卵黄水溶性成 分 （Water solable fraction，WSF），向 WSF 中 加 入 无水硫酸钠至终浓度 18%，在 室 温 （＞20 ℃）条 件 下完全溶解，静置 1 h，抽滤，用 3/5 原卵黄液体积 PBS 清洗滤层，再次抽滤，滤液经透析 12 h，加无 菌 PBS 至 原 卵 黄 体 积 ， 经 0.45 μm 滤 膜 过 滤 除 菌，-20 ℃条件下保存备用。 1.2.3 鸭源 IgY 的组成、含量及浓度测定
关键词：鹅细小病毒；鸭；卵黄抗体
Preparation of Duck Immunogbulin of Yolk Against Goose Parvovirus*
LIU Dapeng，MA Bo，GAO Mingchun，WANG Junwei** （College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150030）
取 100 只非免疫产蛋金定麻鸭隔离饲养，本实 验室保存的 GPV 98E 株胚毒（ELD50 105.15/0.2 mL） 用生理盐水做 1∶5 倍稀释，每只鸭胸肌注射 1 mL； 8 周后用 1∶2 倍稀释的胚毒做加强免疫，每只鸭胸 肌注射 1 mL；免疫期间每周检测免疫鸭血清及卵 黄抗体效价，当卵黄抗体琼扩效价≥1∶64 时，开始 收集鸭蛋； 免疫期间统计两次免疫前后的产蛋率 变化。 1.2.2 鸭源抗 GPV 卵黄抗体的提纯
收 稿 日 期 ：2011-02-19 修 回 日 期 ：2011-04-13 *基金 项 目 ： 黑 龙 江 省 教 育 厅 重 大 科 技 项 目 （1054lz004）； 黑 龙 江 省 科 技 攻 关 项 目 （GB01B503-02 ；GB04B504 ） **通 讯 作 者 ，E-mail ：jwwang@
Abstract：Laying ducks were immunized with goose parvovirus （GPV） 98E strains. Yolk antibodies from duck yolk were extracted and purified by water dilution-sodium sulfate method after harvesting duck eggs and separating egg yolk. AGP titer，content and yield were determined. Prevention and treatment were determined with young goslings without maternal antibodies. Experimental results showed that high level of specific antibodies were producted quickly after ducks was immunized with lived GPV from goose′s embryo. The AGP titer of purified yolk antibodies was 1∶32，and content was 81.6% ，and the total protein ratio was 6.01 mg/mL. The mortality of young goslings was zero in preventive test，and the mortality of young goslings injected with antibodies by preventive dosage was 59% in treatment test. The results of significance test showed that the antibodies from duck yolk had significantly preventive effect and appropriate treatment effect on goslings infected with GPV.
2结果 2.1 免疫后血清抗体和卵黄抗体的变化规律
首次免疫后， 第 1 周血清抗体琼扩试验效价 1∶2，第二周达到高峰（琼扩试验效价 1∶8），持续 3 周，然后迅速下降至琼扩试验效价 1∶4，并趋于稳 定至第 8 周；卵黄抗体在第 2 周开始出现，第 3、4 两周处于高峰（琼扩试验效价 1∶4），第 5 周下降至 琼扩效价 1∶2，第 6 周之后，应用 AGP 试验无法检 出抗体。
加强免疫后， 第 1 周血清抗体既上升至高峰 （琼扩试验效价 1∶128）并持续 3 周，之后开始下降 至琼扩试验效价 1∶64，保持 3 周稳定。 卵黄抗体于 加强免疫后的第 1 周开始出现， 第 2 周到达高峰 （琼扩试验效价 1∶64）,持续 2 周后开始下降，加强 免疫后第 5 周趋于稳定 （琼扩试验效价 1∶16），血 清及鸭蛋黄中抗体的变化规律（见图 1）。
选取 1 日龄无母源抗体易感雏鹅 125 只，随 机分成 5 组（每组 25 只）隔离饲养。 第一组（空白 组 ），3 日 龄 时 背 部 皮 下 注 射 0.5 mL 生 理 盐 水 ； 第二组（对照组），3 日龄时背部皮下注射 GPV H 株 100×LD50；第三组（预防组），2 日龄时背部皮下 注 射 0.5 mL 琼 扩 效 价 1∶32 的 提 纯 的 卵 黄 抗 体 ， 3 日 龄 时 背 部 皮 下 注 射 GPV H 株 100×LD50； 第 四组 （治疗组），3 日 龄 时 背 部 皮 下 注 射 GPV H 株 100×LD50，攻毒 4 d 后存活雏鹅于背部皮下注 射 0.5 mL 琼扩效价 1∶32 的提纯的卵黄抗体。 第 五组（安检组），做安全性试验，2 日龄时 背 部 皮 下 分 点 注 射 3.0 mL 琼 扩 效 价 1∶32 的 提 纯 的 卵 黄抗体。 1.2.7 显著性检验
依 照 文 献 ［8］进 行 无 菌 检 验 ，将 提 纯 的 鸭 源 卵 黄抗体分别接种含硫乙醇酸盐培养基、酪胨培养 基、葡萄糖蛋白胨培养基各 6 只，每种培养基各 取 3 只分别在 25 ℃、37 ℃两种条件下培养，观察 3 d 内培养基中有无细菌生长。 1.2.6 预防试验、治疗试验和安全性试验
3~25 日 龄 雏 鹅 ，10 日 龄 前 后 的 雏 鹅 死 亡 率 最 高 可达 95%~100%［1］。 鹅 细 小 病 毒 病 防 制 主 要 以 预 防 为 主 ， 在 治 疗 方 面 ， 除 抗 血 清 和 卵 黄 抗 体 （IgY ） 以外尚无特效药物。 目前应用较多的为鸡源卵黄 抗体， 而鸭源卵黄抗体目前研究和应用相对较 少。 鸭与鹅同为水禽，分类上同属脊索动物门、脊 椎 动 物 亚 门 、鸟 纲 、 雁 形 目 、 鸭 科 ［2］， 有 较 近 的 种 系发生学关系。 在解剖结构上，鸭、鹅免疫系统中
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2011 年第 33 卷第 13 期
实验研究
China Poultrቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ Vol．33,No．13．2011
都有典型的淋巴结结构，而其它非水禽鸟类仅有 淋 巴 样 结 ［3］， 此 外 ， 鸭 、 鹅 抗 感 染 免 疫 的 主 要 抗 体— ——υ 链免疫球蛋白都有 IgY 和 IgY （ΔFc）两 种 形 式 ［4］，有 别 于 鸡 等 其 它 鸟 类 仅 有 IgY 一 种 形 式。 因此，从种系发生学、解剖学、分子结构 3 个 不同方面说明应用鸭源免疫球蛋白防治鹅传染 病比应用鸡源免疫球蛋白防治鹅传染病更具有 理论依据和可行性。 本研究利用鹅细小病毒不致 病的麻鸭所产蛋作为卵黄抗体的来源，应用活病 毒免疫非易感动物， 获得针对 GPV 的较高效价 的高免鸭蛋， 经水稀释-硫酸钠法提纯鸭源卵黄 抗体，以易感雏鹅为试验动物，进行预防和治疗 试验，并通过对死亡率进行了显著性检验，结果 表明鸭源卵黄抗体对鹅细小病毒感染具有极显 著的预防和治疗作用。 1 材料与方法 1.1 主要材料
应用 SDS-PAGE 分析提取物的 IgY 的组成， AlphalmagarTM 2200 凝胶成像分析系统分析含量， BCA 蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。 1.2.4 鸭源抗 GPV 卵黄抗体的效价测定
采 用 琼 脂 糖 双 扩 散 试 验 （AGP） 测 定 效 价 ， 方 法参见文献 。 ［6，7］ 1.2.5 鸭源抗 GPV 卵黄抗体的无菌检验
AGP 效价（log2）
8
7
■■■
6
●● ■■■
5
●
4
●
●●
3
■■■
2
●● ■■■ ■
■●
●
1
●●
0
●● ●
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
免疫后时间（周）
■ 混合血清 ● 混合卵黄
Key words：goose parvovirus；duck；IgY
鹅 细 小 病 毒 病 是 由 鹅 细 小 病 毒 （Goose parvovirus，GPV） 引起的是一种侵害雏鹅和雏番 鸭 的 高 度 接 触 性 传 染 疾 病 ， 该 病 又 称 Derzsy 氏 病、鹅细小病毒感染，俗称小鹅瘟。 主要发生于
DYCZ-24D 型垂直板电泳系统（北京市六一仪 器厂）、凝胶成像 分 析 系 统 （AlphalmagarTM 2200）、 无水硫酸钠 （天津博迪化工股份有限公司）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒 （碧云天生物技术研究所）、 蛋白分子质量标准（Ferments 公司 ）、GPV 琼 扩 抗 原 （黑 龙 江 省 兽 医 科 学 研 究 所 馈 赠 ）。 GPV 98E 株 鹅 胚 胚 毒 （ 本 实 验 室 保 存 ）、GPV H 株 胚 毒 （哈药集团生物制品一厂馈赠）、产蛋期金定麻鸭 （黑龙江省哈尔滨市某鸭场）、易感雏鹅（黑龙江省 大庆市大同区北方种鹅场）。 1.2 方法 1.2.1 鸭源抗 GPV 卵黄抗体的制备