鸡生长分化因子GDF-8 cDNA的克隆、表达及蛋白纯化
肌肉生长抑制素基因在重要经济动物育种中的研究进展
2023·05XUMUSHOUYI 畜牧兽医摘要：肌肉生长抑制素（myostain ，MSTN ）又称生长分化因子8，是转化生长因子-β超家族的一员，是动物体正常运作所必需的蛋白质，也是肌肉发育的负性调节因子，决定了动物的整体肌肉质量。
由于MSTN 的突变，许多大型动物，包括牛、羊、狗和人类，都表现出“双肌”表型。
本文首先概述MSTN 的结构特征、表达规律、生物学功能和作用机制，然后介绍了肌肉抑制素基因的多态性在动物育种领域的重要意义，以及MSTN 基因编辑技术在牛、羊、猪等经济动物生产中的应用情况。
关键词：肌肉生长抑制素；双肌表型；多态性；基因编辑肌肉性状是影响畜牧生产中的重要经济性状，提高家畜肌肉品质是家畜育种工作者的毕生追求。
肌肉生长抑制素（myostain ，MSTN ），又名生长分化因子8（growth and differentiation factor 8，GDF8），是目前唯一明确的对骨骼肌生长发育和再生起负向调节作用的分泌性糖蛋白，对肌肉发育和稳态维持都起着重要作用，其自然突变或敲除导致的蛋白功能失活或者表达量下降都会导致肌肉异常发达，反之，其表达上升则会引起肌肉萎缩。
MSTN 缺失型家畜骨骼肌重量增加，使得肌肉与其他组织相比，比例大大提高。
自然界中存在MSTN 天然突变体动物：如比利时蓝牛、皮埃蒙特牛、特克赛尔羊，其肌肉异常发达的“双肌”表型引起了遗传育种研究领域的高度关注。
1MSTN 基因的结构特征MSTN 基因编码的MSTN 蛋白因其具有转化生长因子β（transforming growth factor beta ）超家族的典型结构特征而成为了TGF -β超家族的成员之一，但相较于其他家族成员，其C 端的氨基酸序列要更短一些。
MSTN 基因在不同物种中结构相似且高度保守，包括三个相似大小的外显子以及两个内含子，但其在不同脊椎动物物种中的染色体定位并不相同。
MSTN 位于人、黑猩猩、牛、绵羊和山羊的2号染色体上，位于小鼠1号染色体上，位于大鼠9号染色体上，位于猪15号染色体上，位于马18号染色体，位于狗37号染色体，而兔、鸡的该基因定位在7号染色体。
肌肉生长抑制素基因的研究进展
肌肉生长抑制素基因的研究进展杨瑾;周播江【摘要】生长分化因子-8,亦称肌肉生长抑制素(Myostatin,Mstn),是转化生长因子β超家族的一员.Mstn基因是一种主要表达于肌肉组织的分泌蛋白,也存在于脂肪组织、心脏及脑组织等多种组织中,其主要功能是调节肌细胞的生长与分化,在哺乳动物生长发育过程中起关键作用,并可能存在性别、年龄相关性.由于近年来发现Mstn基因还有很多潜在功能,且与很多疾病发生密切相关,故Mstn基因一直受研究者密切关注.本文主要对近10年关于Mstn基因的结构特点、在动物体内的表达、作用机制、基因表达调控和信号转导等方面的相关研究进展进行综述,以便为骨骼肌纤维类型转换相关机制的研究提供资料.【期刊名称】《遵义医学院学报》【年(卷),期】2018(041)004【总页数】6页(P513-518)【关键词】肌肉生长抑制素(Mstn)基因;骨骼肌纤维;新进展【作者】杨瑾;周播江【作者单位】遵义医学院解剖学教研室,贵州遵义563099;遵义医学院解剖学教研室,贵州遵义563099【正文语种】中文【中图分类】R322生长分化因子-8，也被称为肌肉生长抑制素(Myostatin，Mstn)，是转化生长因子β超家族的一员。
Mstn基因是一种主要表达于肌肉组织的分泌蛋白,其主要功能是调节肌细胞的生长与分化，在哺乳动物生长发育过程中起关键作用。
近来一直倍受研究者密切关注。
在动物体出生后，肌肉生长抑制素基因主要通过限制骨骼肌纤维数量和大小对骨骼肌生长发育起着重要的抑制作用[1]。
因此，在许多哺乳动物和鱼类体内，该基因损伤或目的性抑制肌细胞生长抑制素蛋白可以引起肌肉大量增生的相应表型出现，并引起肌纤维类型发生变化。
除了影响骨骼肌生长发育外，近年来还发现Mstn基因还参与糖类代谢，并对脂肪沉积起抑制作用[2-3]；在骨密度调控及雌性哺乳动物的生殖调控中，Mstn基因也起到一定作用[4-6]。
本文主要对有关Mstn基因的结构特点、在动物体内的表达、作用机制、基因表达调控和信号转导等的方面相关研究进展进行综述，以便为骨骼肌纤维类型转换相关机制的研究提供资料。
肌肉生长抑制素基因的研究进展1
专论与综述肌肉生长抑制素基因的研究进展王 芳,赵春丽,郝艳红(东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030) 中图分类号:S811.3 文献标识码:C 文章编号:1004-7034(2003)04-0041-02关键词:肌肉生长抑制素;基因;双肌摘 要:肌肉生长抑制素(Myostatin)是骨骼肌生长发育的负调节因子,属于TGF-β超家族成员。
Myostatin基因的结构与功能的深入研究对畜牧业、医疗医药业具有重要意义和应用前景。
本文主要对肌肉生长抑制素基因(Myostatin)的结构、同源性、组织特异性及生物学功能的研究现状进行了综述,并讨论其应用前景。
1997年McPherron等[1]通过简并引物PCR(简并PCR)方法,扩增出一个约280kb的新产物,以此为探针筛选小鼠骨骼肌cDNA文库,得到全长的cDNA序列。
同源性实验证明此基因属于转化生长因子β(TGF-β)超家族成员,对骨骼肌生长有负调控作用,并具有肌肉组织特异性表达的特点,因此命名为肌肉生长抑制素(Myostatin,Mstn),又称为生长分化因子8 (growth differentiation factor-8,G DF-8)。
1 Myostatin基因的结构S onstegard等[2]通过荧光原位杂交,将猪的Myostatin基因定位于染色体15q2.3,并用第2内含子多态性和相关微卫星标记,构建了第15号染色体的连锁图谱。
Myostatin cDNA由一个可读框(opening reading frame, ORF)和编码376个氨基酸的核苷酸序列组成,包含三个外显子和两个内含子。
欧阳红生等[3]对猪的Myostatin基因进行克隆和序列测定,猪Myostatin cDNA序列为1756bp,其中1～1125bp编码氨基酸,起始密码子位于308bp处,外显子1编码第1～124氨基酸及第125氨基酸残基密码子的第1个碱基;外显子2为371bp,编码第125氨基酸残基的密码子的第2、3个碱基及第126～249氨基酸;外显子3编码第250～375氨基酸;终止密码子位于外显子3内。
肌肉生长抑制素_MSTN_基因的研究进展_张增荣
细胞浆内,也可在细胞核内发现。
用多克隆抗血清对NS1的抗原性进行研究,结果发现,不同亚型毒株之间存在明显的交叉反应,但是用竞争R I A (放射免疫电泳)可检测到抗原漂移现象。
用单克隆抗体对A /W SN /33(H I N I)株的NS1进行研究,发现在该蛋白分子上有3个重要的抗原位点。
有研究报道,NS1蛋白N 氨基酸残基端第1~40位氨基酸为CD8+CTL 细胞所识别的抗原表位,用表达此段基因的重组痘苗病毒免疫小鼠可表现一定的流感病毒细胞毒活性,但不能够产生中和抗体。
当用致死剂量的A I V 进行攻击时,10只免疫的小鼠与对照组相比,第一批出现死亡的时间推迟了2d ,死亡率也大大降低(P <0105)。
Gac ia-sastire 运用反向遗传学的手段构建了1个缺失NS1基因的流感病毒。
通过研究这种缺失病毒的生物学活性,发现NS1蛋白对于抑制干扰素介导的宿主的抗病毒免疫应答起了关键作用。
研究证实,用同源或异源病毒攻毒后得到42%~50%的存活率,大部分免疫鸡排毒,表现明显的病征,这些结果与其他用重组DNA 疫苗免疫试验得到的结果相似[3]。
2 结论禽流感是一种全球性的烈性传染病,可在宿主中不断发生变异和基因重组,是21世纪我国养禽业将面临的最大的瘟疫性威胁。
禽流感可在禽、猪和人中进行传播。
A I V 不仅作为人流感的最大基因库而间接威胁人类健康,而且还可作为人类的新病毒而直接构成人类的威胁。
因此,预防禽流感具有重要的公共卫生意义和经济意义。
疫苗免疫是预防和控制禽流感的重要手段,各种蛋白在免疫中发挥的作用,对研制疫苗具有重要意义。
加大对禽流感防治方面的研究力度,采取广泛的国际合作,加强学术交流,不断推广新方法和新技术,从而使禽流感早日得到有效地控制。
参考文献:[1] CHEN W,CAL VOL P A ,M ALI DE D ,et a.l A novel i n fl u enza A V -irus m it ochondrial protei n t hat i ndu ces cell death[J].Nat u re M ed-i ci ne ,2001,7(12):1306-1312.[2] 朱建国,陆苹.禽流感病毒核蛋白研究进展[J].中国预防兽医学报,2003,25:72-73.[3] 程坚.表达和共表达H 9亚型禽流感病毒HA 基因和鸡I FN -Ⅱ基因的重组鸡痘病毒[D].扬州大学图书馆,2002.(011)收稿日期:2006-01-10作者简介:张增荣(1980-),男,硕士.通讯作者:朱 庆(1959-),男,教授,博士,博士生导师.肌肉生长抑制素(M STN )基因的研究进展张增荣,朱 庆*(四川农业大学动物科技学院,四川雅安625014)中图分类号:S852123文献标识码:A文章编号:1004-7034(2007)01-0019-03 肌肉生长抑制素(m yostati n ,M STN )是一类在骨骼肌中广泛表达的糖蛋白,其功能和表达量的变化可能会通过调节靶基因的表达来改变肌肉的纤维组成及造成肌肉重量的变化。
基于转录组分析对中国对虾Myostatin基因调控的肌肉生长相关基因的筛选
中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)作为无脊椎 动物甲壳类的典型代表，具有较高的经济价值，但其 海捕量极低，基本依靠养殖供给市场，而养殖产量远 远满足不了市场消费的需求，加之群体的生长性状选 育进展缓慢且规格整齐度较差，利用分子手段来提高 产量已迫在眉睫。我们前期对中国对虾的初步研究表 明，Mstn可能与脊椎动物类似，负向调控中国对虾
1.2.4 转录组测序分析 通过qRT-PCR分析对照
组和实验组相对表达量，确保实验组中FcMstn基因 表达被有效抑制后，取出液氮中保存的样品，使用
RNA提取试剂盒(TaKaRa)进行总RNA的提取，用 1.5%的琼脂糖电泳检查RNA完整性，NanoDrop2000 超微量分光光度计检测RNA浓度，所有指标经检测 合格后，根据qRT-PCR的检测结果选取抑制效果最 好的3个样品，交送至数据(raw reads),对原始数据进行接头及低质 量reads去除处理，获得高质量的clean数据，使用 短reads组装软件Trinity对高质量clean数据进行de novo 组装(Liang et al, 2013)得到 unigeneo
Mstn对肌肉生长发育的作用为促进动物生产、增加
市场利润提供了新途径，随着对Mstn研究的不断深 入，其肌肉调控机制和相关基因功能也越来越完善。 Mstn作为胞外信号分子，可与成肌细胞膜上的受体 结合引起受体自身的磷酸化，启动细胞内一系列信号 传导过程，作用于生肌分化抗原(MyoD)靶基因的调 控区，进而调控肌肉的形成和分化(Morikawa et al,
肌肉适能及其评价定稿
第二章肌肉适能及其肌肉适能训练关键术语肌肉适能（muscular fitness）：是指机体依靠肌肉收缩克服和对抗阻力维持身体运动的能力。
肌肉力量（muscle strength）：又称最大肌肉力量或者绝对肌肉力量，是肌肉收缩产生最大收缩力的能力。
肌肉耐力（muscle endurance）：是肌肉持续收缩对抗疲劳的能力。
肌肉功率（muscle power）：又称快速力量，是肌肉在短时间内快速发挥其收缩力量的能力。
中枢激活（central activation）：中枢神经系统动员肌纤维参加收缩的能力。
肌肉适能训练（Muscular Fitness Training）：遵照一定的规则和要求，运用相应的方法和手段，有计划和有目的的发展人体神经-肌肉系统的过程。
训练方法（Training Methods）：为达到训练目的采取的有计划和有组织的方法和手段。
训练计划（Training Planning）：根据训练目标和训练的条件预先制定的训练计划，是对训练全过程的设计，包括训练目标、任务、方法与手段、负荷和检测等内容。
肌协调性（Muscular Cooperation）：肌肉收缩时，不同肌肉之间的协作能力。
一般被分为肌内协调（一块肌肉中不同肌纤维之间的协作）和肌外协调（不同肌肉之间的协作）。
抗阻力训练（Resistance Training）：最常用的力量训练形式，通过给肌肉施加外部阻力以提高肌肉适能水平。
第一部分肌肉适能骨骼肌是由具有收缩功能的肌细胞构成的人体最大的组织，占体重约40%左右。
骨骼肌收缩克服和对抗阻力维持身体姿势和运动是骨骼肌的基本功能，人体各种形式的体力活动如劳动、体育运动和日常生活中的身体活动等都是通过骨骼肌的收缩和舒张实现的。
第一节肌肉适能概述一、肌肉适能的概念肌肉适能（muscular fitness）是指机体依靠肌肉收缩克服和对抗阻力维持身体运动的能力，通常表现为肌肉力量（muscle strength）、肌肉耐力（muscle endurance）和肌肉功率（muscle power）等方面。
广东省湛江市2020-2021学年高二下学期期末调研考试生物试题含答案
湛江市2020－2021学年度第二学期期末调研考试高二生物试题（本卷满分100分，考试用时75分钟）注意事项：1．答卷前，考生务必用黑色字迹的钢笔或签字笔将自己的姓名、考号等信息填写在答题卡上，用2B铅笔填涂相关信息，并将考号条形码粘贴在答题卡上的指定位置。
2．作答选择题时，选出每小题答案后，用2B铅笔把答题卡上对应题目选项的答案信息点涂黑；如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案，答案不能答在试卷上。
3．非选择题必须用黑色字迹钢笔或签字笔作答，答案必须写在答题卡各题目指定区域内相应位置上；如需改动，先划掉原来的答案，然后再写上新的答案；不准使用铅笔和涂改液。
不按以上要求作答的答案无效。
4．作答选考题时，请先用2B铅笔填涂选做题的题号对应的信息点，再作答。
漏涂、错涂、多涂的，答案无效。
5．考生必须保持答题卡的整洁。
考试结束后，将答题卡交回。
一、选择题：本题共16小题，共40分。
第1-12小题，每小题2分；第13-16小题，每小题4分。
在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的。
1．下列有关新型冠状病毒的叙述，错误的是A．该病毒没有细胞结构，不属于生命系统结构层次B．该病毒进入宿主细胞与膜的结构特点有关C．该病毒的遗传物质是RNA，较易发生变异D．为了获得大量该病毒，可用牛肉膏蛋白胨培养基直接培养2．关于“孤村芳草远，斜日杏花飞”的叙述，正确的是A．所有的“芳草”构成了种群B．诗句体现了生命系统最基本的结构层次C．叙述的场景中最大的生命系统结构层次是生态系统D．“孤村”“芳草”“斜日”“杏花”都属于生命系统的结构层次3．将光学显微镜观察到的视野A转换为视野B，以下叙述正确的是A．可以直接转动转换器更换高倍物镜B．将甲物像移到视野中央，应将装片向右移动C．换成高倍镜后可调节粗准焦螺旋获得清晰的物像D．换成视野B时，只能通过反光镜调节视野亮度4．关于细胞学说建立的过程，下列说法正确的是A．目前，施莱登和施旺提出的细胞学说只适用于动物细胞和植物细胞B．细胞学说揭示了生物界的统一性和差异性C．列文虎克用自制的显微镜首次观察到了活细胞D．科学家魏尔肖提出“新细胞是从老细胞中产生”5．下列有关化学元素和化合物的说法，正确的是A．某口服液中含有丰富的N、P、Zn等微量元素，可提高人体的免疫力B．自由水能参与许多化学反应，如光合作用、呼吸作用C．染色体和核糖体都是由DNA和蛋白质组成D．用32P作标记可以检测出细胞膜的蛋白质成分6．脂质与人体健康息息相关，下列叙述错误的是A．分布在内脏器官周围的脂肪具有缓冲作用B．缺钙的婴幼儿服用鱼肝油有助于钙的吸收C．摄入过多的脂质会增加患心血管疾病的风险D．蛇毒中的磷脂酶因水解红细胞膜蛋白而导致溶血7．“世界杂交水稻之父”袁隆平院士成功硏种出“海水稻”，海水稻是耐盐碱水稻的形象化称呼，可在条件恶劣的盐碱地生长，灌溉可使用半咸水，其矿物质含量比普通水稻髙。
肌肉生长抑制素对动物肌肉、脂肪和骨骼的影响
肌肉生长抑制素对动物肌肉、脂肪和骨骼的影响杨永生;贺建华;邓惠中;谢红兵;江碧波;罗佳捷【摘要】肌肉生长抑制素是转化生长因子β超家族成员之一,具有众多的生理功能.近来的研究表明,肌肉生长抑制素除对肌肉生长有负调控作用外,还对脂肪的沉积和骨骼的生长发育具有调节作用,甚至还能影响肌腱和韧带的强硬度.本文主要从肌肉生长抑制素的结构、基因表达及其对动物肌肉、脂肪和骨骼的作用等方面进行综述.%Myostatin (MSTN) , a member of the transforming growth factor-p superfamily, has many physiological functions. Besides the negative regulation of muscle growth by MSTN, recent researches showed that MSTN could regulate the fat deposition and skeletal growth, and even control the strength of tendon and ligament. Structure and regulation of gene expression of myostatin and its effects on muscle, fat and bone of animals were mainly reviewed in this paper. [Chinese Journal of Animal Nutrition, 2012, 24(2) : 220-225]【期刊名称】《动物营养学报》【年(卷),期】2012(024)002【总页数】6页(P220-225)【关键词】肌肉生长押制素;肌肉;脂肪;骨骼;抑制【作者】杨永生;贺建华;邓惠中;谢红兵;江碧波;罗佳捷【作者单位】湖南农业大学动物科技学院,长沙410128;湖南农业大学动物科技学院,长沙410128;湖南农业大学动物科技学院,长沙410128;湖南农业大学动物科技学院,长沙410128;湖南农业大学动物科技学院,长沙410128;湖南农业大学动物科技学院,长沙410128【正文语种】中文【中图分类】S811肌肉生长抑制素(myostain，MSTN)简称肌抑素，即生长分化因子8(growth differentiation factor 8，GDF－8)，为转化生长因子β(transforming growth factor－beta，TGF－β)超家族成员之一。
肌肉生长
肌肉生长发育的表观调控摘要:肌肉生长发育是一个复杂的过程，涉及到大量基因的表达与调控。
如，HMGCS1、MSTN、MyoD、Myf6等基因都对肌纤维的生长发育有关，除此之外，还有许多其它参与肌肉生长发育调控的基因尚未被发现。
肌肉细胞增殖、分化受一些正向调控因子和负向调控因子的双向调节。
本文将对，现已知与肌肉生长发育相关的部分基因对肌肉生长发育的调控机理进行述。
关键词:肌肉发育； MyoD；Myf6；MSTNMuscle growth and development of apparent regulationAbstract:Muscle growth and development is a complex process that involves a large amount of gene expression and regulation. Such as HMGCS1, MSTN, MyoD, Myf6 genes are all associated with the growth and development of muscle fibers. In addition, there are many other involved in muscle growth and development regulation of the gene has not yet been found. Muscle cell proliferation and differentiation is bidirectional regulated by the some positive factors and negative regulation factors . This article will tell the known genes associated with muscle growth and development on the regulation mechanism of muscle growth and development.Key words:Muscle development ；MyoD；Myf6；MSTN1 前言动物肌肉主要由肌束组成，肌束又由肌纤维和一些相关蛋白及脂肪等组成。
禽多杀性巴氏杆菌PlpB基因克隆、表达及表达蛋白生物学特性研究
的 家禽和野禽的 一种急性、接触性、败血性传染病。不同 血清型的 Ｐ Ｍ所引起的 禽 霍 互相之间无 乱 交叉保护作用。 表明， 研究 位于Ｐ Ｍ菌体表 面的Ｐ Ｂ 抗原是一 ｌ 蛋白 ｐ
可通过血清被动传递给非免疫小鼠， 使后者获得对强毒的抵抗力。
本 首次构建多杀巴氏 研究是国内 杆菌Ｐ Ｂ ｌ 基因的原核克隆 体和表 体， ｐ 载 达载 并
将表达产物进行了初步的动物保护试验，为下一步的交叉保护性试验和禽霍乱亚单 位疫苗的研制莫定了基础。
关键词： 多杀巴氏杆菌； 禽霍乱； 交叉保护因 子；Ｐ Ｂ基因 ｌ ｐ
检测表明，该表达蛋白 具有良 好的反应原性。
２多 ． 杀巴 杆 Ｉ 表 氏 菌Ｐ Ｂ 达蛋白 疫 护 初步研究 ｐ 免 保 作用 以 ｐ 表达蛋白ｐＢ乳化后免疫小鼠 连续免 ， 疫３ 第一次间 ４， 次， 隔１ 第二次间 ｄ 隔７， ｄ 并用琼脂双向 试验检测血清抗体效价． 扩散 结果， ｐ 蛋白 抗血 ｐＢ 的 清效价 达
ｐ ｔｎ ｉ ｌ ａ ｄ ｔ ｂｃ ｒｍ ｔ ｍ ｍ ｒ ｅ ｐ ｖ ｅ ｔ ｔｎ ｔ ｒ ｅ ｗ ｃ ｏ ｔ ｉ ｈ ａｔｉ ｏ ｅ ｅ ｂａ ｃｎ ｉ ｐｏ ｃｏ ｔ ｈ ｏ ｉ ｈ ｈ ｅ ｎ ｃ ｅ ｅｕ ｕ ｒ ｎ ａ ｒ ｄ ｒ ｅ ｉ ｏ ｏ ｅ
ｃａｅｇ ｏ ｈｔｏ ｇｕ ｓｏ ｐ ｓａ ｓＩｉｉ ｉ ｉ ａｔ ｔ ｒ ｅ ｃｉ ｏ ｔ ｈｌｎｅ ｅ ｒ ｏｏｓ ｔ ｅ ｉ ． ｎ ｇ ｆ ｎ ｏ ｈ ｅ ａ ｈ ｇ ｈ ｆ ｌ ｅ ｅ ｙ ｔ ｎ ｔ ｓ ｎ ｃ ｎ ｓ ｒ ｎ ｆ ｒ ｒ ｓ ｉ ｅ ｅ
实时荧光定量PCR筛选鸡基因表达最佳内参基因
中国农业大学学报 2021，26(4) :71-78 h ttp:// Journal of China Agricultural University DOI：10. 11841/j.issn. 1007-4333. 2021. 04. 07实时荧光定量PC R筛选鸡基因表达最佳内参基因李毅毅张彦华吴俊锋张晨曦康相涛李文婷•(河南农业大学动物科技学院，郑州450000)摘要为筛选在鸡基因表达时稳定表达的内参基因，本试验以6、14、22及30周龄的地方品种固始鸡与6周龄的商业品种罗斯308肉鸡为试验动物，以拟从、285、0八尸0付、分沉如及只5/570为候选内参基因，利用91^1'-?0?对这5个候选内参基因的相对表达量进行测定，通过独立评价软件g e N o r m、No r mF i n d e r、S P S S和C t值分析法筛选出在不同组织、不同发育时期和不同品种间稳定表达的最佳内参基因。
结果表明：在鸡不同组织中，烈S为最佳 内参基因；在鸡不同发育时期中，G A P D H为最佳内参基因；在不同品种鸡中最佳内参基因组合为G A P D H和 25S。
综上所述，在以地方品种固始鸡为例的不同组织，不同时期间最佳内参基因分别为冴S和G A P D H;以地方品种固始鸡和商业品种罗斯308肉鸡为例的不同品种间最佳内参基因为G A P D H+28S基因组合。
综上，本研究筛选出了鸡不同试验条件下的最佳内参基因，为规范鸡基因定量表达分析中内参基因的使用提供参考依据。
关键词鸡；内参基因；g e N o r m;NormFinder中图分类号S831 文章编号1007-4333(2021)04-0071-08 文献标志码AScreening optimum reference gene for gene expression inchicken by quantitative real-time PCRLI Y iyi, ZHANG Yanhua. WU Junfeng, ZHANG Chenxi, KANG Xiangtao, LI Wenting'(College of Animal Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450000, China)Abstract In order to screen the internal reference genes stably expressed in chicken, the local Gushi chicken of 6, 14, 22, and 30-week-old and the commercial variety Ross 308 of 6-week-old were used as experimental animals. Using B2M, 28S, GAPDH, ^-actin and HSP70as candidate reference genes, the relative expression levels of these five candidate reference genes were determined by qRT-PCR. by the three softwares (geNorm, NormFinder and SPSS) and Ct value analysis. The best internal reference genes were screened out in different tissues, different development stages and different varieties. The results showed that 28s was the best internal reference gene in different tissues of chicken；GAPDH was the best internal reference gene in different development stages；GAPDH and 28s were the best combination of internal reference genes in different chicken varieties. In summary, the best internal reference genes under experimental conditions were identified in this study, which provided a reference for standardizing the use of internal reference genes in chicken genes for quantitative expression analysis.Keywords chicken；internal reference gene；geNorm；NormFinder实时焚光定量 PCR (Q u a n t i t a t i v e r e a l-t i m e P C R,qRT-PCR)由于其众多的优点，在基因表达研 究中得到了广泛的应用，已成为量化基因转录表达、揭示基因表达模式的有效方法[1]。
MSTN基因在动物生产中的研究进展
612020年 第12期MSTN 基因在动物生产中的研究进展董诗琳，张梦帆，李耀东*（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）摘 要：肌肉生长抑制素（MSTN）是调节骨骼肌发育的因子之一，属于TGF-β超家族的成员，能够对肌肉生长起负调控作用。
该基因在骨骼肌中广泛表达，基因缺失或突变能够导致动物体表现出“双肌”表型。
在畜牧生产中，MSTN基因的多肽可以作为选择肌肉性状的分子标记。
文章对MSTN基因的结构特点、生物学功能、作用机制以及在动物生产中的应用进行阐述，展望该基因的研究前景。
关键词：肌肉生长抑制素；骨骼肌；TGF-β超家族；研究进展中图分类号：S 813 文献标识码：A 文章编号：1672-9692（2020）12-0061-04Research progress of MSTN gene in animal productionDong Shilin, Zhang Mengfan, Li Yaodong *(College of Life Science and Engineering, Northwest Minzu University, Gansu Lanzhou 730030)Abstract: Myostatin (MSTN) is one of the factors that regulate skeletal muscle development. It is a member of the TGF-βsuperfamily and can negatively regulate muscle growth. The gene is widely expressed in skeletal muscle, and deletion or mutation can cause animals to exhibit a 'bicuscular' phenotype. In livestock production, the polymorphism of MSTN gene can be used as a molecular marker for the selection of muscle traits. In the paper, the structural characteristics, biological function, mechanism of action and its application in animal production of MSTN gene are reviewed, and the research prospect of MSTN gene is prospected.Key words: Myostatin; Skeletal Muscle; TGF-βsuperfamily; Research progress 收稿日期：2020-06-15作者简介：董诗琳，本科，研究方向为动物科学。
Split-GFP双分子荧光互补技术在鸡MSTN基因RNAi检测中的应用
54卷收稿日期：2023-04-27基金项目：国家自然科学基金项目（32060738，31660653）；广西自然科学基金重点项目（2018GXNSFDA281026）；广西重点研发计划项目（桂科AB16380098）通讯作者：郑喜邦（1964-），https:///0009-0006-7317-9381，博士，教授，主要从事家禽基因编辑研究工作，E-mail ：xibang-*************.cn 第一作者：杨磊（1995-），https:///0009-0006-0598-5410，研究方向为家禽转基因，E-mail ：*****************Split-GFP 双分子荧光互补技术在鸡MSTN 基因RNAi 检测中的应用杨磊，朱正，王博永，梁谦学，吴文德，李恭贺，郑喜邦*（广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004）摘要：【目的】以Split-GFP 双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因（MSTN ）RNA 干涉（RNAi ）效果，并与其他常用检测方法比较，以验证Split-GFP 双分子荧光互补技术在RNAi 效果评估中的有效性和可行性。
【方法】将合成的3个shRNA 慢病毒载体（shRNA-a 、shRNA-b 和shRNA-c ）分别转染稳定表达GFP11-MSTN 融合蛋白的HEK 293T GFP11-MSTN 细胞，经实时荧光定量PCR 筛选出最佳shRNA 慢病毒载体并包装为慢病毒，然后以慢病毒感染HEK 293T GFP11-MSTN 细胞，采用潮霉素B 筛选mCherry 阳性（mCherry +）细胞，再以实时荧光定量PCR 和Western blotting 检测RNAi 效果；得到的mCherry +细胞再转染pcDNA3.1（+）-GFP1-10质粒，通过荧光显微镜观察和流式细胞术评估RNAi 效果。
【结果】3个shRNA 慢病毒载体对MSTN 基因表达均有极显著的抑制作用（P <0.01，下同），其中又以Anti-MSTN shRNA-a 慢病毒载体的干涉效果最佳。
Myostatin对成肌细胞糖代谢的影响
中国协和医科大学博士学位论文称为Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ（ＭＳＴＮ）［１】。
而且，Ｓｈｙｕ等在２００５年在体外培养的心肌细胞中的一项研究结果证实，在ＭＳＴＮ和ＩＧＦ．１之间明确存在着一种负反馈调控机制：受机械牵拉后，心肌细胞内ＩＧＦ．１表达上调，一方面刺激细胞生长，另外还可以激活ｐ３８·ＭＡＰＫ＿ＭＥＦ．２通路，导致ＭＳ＇ＩＮ表达上调【２】。
据Ｂｕｌｌｏｕｇｈ早在３０多年前就提出的抑素（ｃｈａｌｏｎｅ）假说，认为生物体内存在～种能抑制细胞功能的分泌性分子，而生物体组织的大小是由特异的抑素单独控制的，特定组织产生抑素并抑制该组织的生长，抑素在体内的局部浓度或在系统内的浓度将影响特异组织的大小［３】。
据此观点，Ｇａｕｓｓｉｎ等认为ＭＳＴＮ可能也是机体内的抑素之一，它的表达方式及与其它细胞因子间的相互作用对生物体生长发育过程中的稳态平衡（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）起着重要的调控作用【４】。
ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ等鉴定分析Ｙ４，鼠ＭＳＴＮ基因，该基因编码３７６个氨基酸的蛋白质。
结构上分析这个因子具有ＴＧＦ—Ｂ超家族成员结构上共同的特点，但是由于其ｃ末端区域的碱基序列与ＴＧＦ．ｐ家族的其他成员（如：Ｉｎｈｉｂｉｎｓ，ＴＧＦ．ｐ和ＢＭＰ等）的同源性很低，它仅与Ｖｇｒ－１有４５％的同源性，因此目前无法把ＭＳＴＮ归入已有的亚家族中，而将其列为ＴＧＦ－ＩＢ超家族中的一类新因子，即Ｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ－８（ＧＤＦ．８）。
ＭＳＴＮ主要在骨骼肌中表达，ＭＳＴＮ基因敲除小鼠的骨骼肌是正常野生型小鼠的３倍以上（图１．１），而在其他生长发育性状上没有任何表现型的差异【ｌ】。
这是自１９８２年Ｐａｌｍｉｔｅｒ等［５】将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内产生“超级小鼠”之后的又一只“超级小鼠”。
ＭＳＴＮ基因的功能因此受到广泛的关注。
根据ＧＤＦ一８因子对骨骼肌生长具有抑制作用，后将它正式定名为肌肉抑制素（Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ，ＭＳＴＮ）。
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镍离子柱亲和层析， 分步洗脱并收集目的蛋白洗脱液， 所得 纯化产物的 $%$&’()* 结果如图 C 所示。
# 实验结果
#"! 鸡半长 )%+%& @%A( 的克隆和重组表达质粒的构建 并以此为模板进行 从鸡的骨骼肌组织中提取总 BA(， B-&’>B 反应扩增得到 CD一侧的半长 )%+&, 基因。扩增片段 与设计基本相符。电泳回收的 ’>B 产物 长度相当于 3"EF/， 与 /-4@G7HI 载体连接并转 化 感 受 态 大 肠 杆 菌 -./!0 后， 经 !"# GJ 和 $%& J 双酶切以及 ’>B 鉴定重组质粒。琼脂糖凝 胶电泳结果表明， 插入片段长度约为 3"EF/， 与预期基本一 致。结果见图 !。
!" 卷 # 期 $%%! 年 " 月
生 物 工 程 学 报 !"#$%&% ’()*$+, (- .#(/%0"$(,(12
&’() !" *’) # +,(- $%%!
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［$］ 上 ， 这是继 !E/$ 年 L6(9:?3M 等将大鼠的生长激素基因转入
其总 R*D 的提取按 Z "%[ 保存的鸡的肌肉组织至粉末状， A:W@’ 公司 2RQ=’( R36U3F? 操作说明书进行。根据 K@L<3MM’F，
［ ，］ 我们利用 D) N) !EE" 年 发 表 的 鸡 AB5./ 的 @B*D 序 列 $ 1 ，
［4］ 人 ， 提示人类中的某些肌萎缩疾病很可能与 AB5./ 因子表
达异常直接相关。 目前世界范围内对 AB5./ 基因及其功能的研究还较少， 但其重要性已日益得到生物学、 医学及动物育种学界的广泛 关注。本研究主要是以鸡的骨骼肌为实验材料， 利用 R2. LNR 的方法从鸡的骨骼肌总 R*D 中扩增得到半长 AB5./ 的 并克隆到 H2M@G:JS 表达载体上。从而诱导表达 @B*D 片段， 通过金属螯合亲和层析得到大量纯化的 AB5./ 融合蛋白， 为制备 AB5./ 抗体和进一步研究 AB5./ 的功能 AB5./ 蛋白， 与抑制骨骼肌生长的作用机制打下了良好的基础。
收稿日期： 修回日期： $%%%.!$.!/， $%%!.%$.$0。 基金项目： 国家 /01 高技术研究与发展计划项目基金资助 （$!.%#.%0） 和黑龙江省攻关项目。 /0.#4!.0#!$/04； 567： /0.#4!.0#!$/04； 8.96:(： ;6<6:=<,> <’?96:( ) @’9 " 通讯作者。 23(：
图C
鸡 > 端半长 )%+&, 表达产物亲和层析 $%$&’()* 分析 $%$&’()* MHHMW .P MPP787OW @:4.6MO.K4M/:W /4.QR@OH .P @:7@TN8 >&ON4678M; )%+&,
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=L ’4.ON78 H7YN 6M4TN；(L Z:.;N FM@ON47M /4.ON78H FNP.4N ;.MQ78K A7 [ &A-( MPP787OW @:4.6MO.K4M/:W @.;R68；IL +;.S&.RO ;7VR7Q P4.6 A7 [ &A-( MPP787OW @:4.6MO.K4M/:W @.;R68； 图! +7KL ! B-&’>B 与酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳 >L ZMH: ;7VR7Q S7O: !066.;5< 767QMY.;N =>(>； %L ZMH: ;7VR7Q S7O: "066.;5< 767QMY.;N =>(>； *L ZMH: ;7VR7Q S7O: "0066.;5< 767QMY.;N =>(>； +L ZMH: ;7VR7Q S7O: 30066.;5< 767QMY.;N =>(> (KM4.HN KN; N;N@O4./:.4NH7H .P B-&’>B /4.QR@O .P )%+&, KN8N =L %A( 6.;N@R;M4 SN7K:O 6M4TN4；(L B-&’>B /4.QR@O .P CD:M;P&;N8KO: @:7@TN8 )%+&,；IL BN@.6F78M8O /;MH67Q Q7KNHONQ S7O: !"# GJ M8Q $%& J
’ 材料与方法
’(’ 材料 菌株及组织样品： 原核高效表达载体 H2M@G:JS ’(’(’ 质粒、 质粒与大肠杆菌 2’H!% 均购自 QFT:?M’U3F3 公司。实验中用到 的肌肉组织样品采自于 1% 日龄的肉用仔鸡。 所用限制酶、 ’(’() 酶和试剂： 26V B*D 聚合酶为 A:W@’ 公
图"
鸡 )%+&, 基因表达产物的 $%$&’()* 分析 $%$&’()* MHHMW .P NX/4NHH7.8 /4.QR@OH .P @:7@TN8 )%+&, KN8N 78 , L +&*-
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=L ’4.ON78 H7YN 6M4TN4；(、 )L , L +&*- -./!0 @M44W78K /;MH67Q /-4@G7HI&)%+, S7O:.RO 78QR@O7.8； I ? +L , L +&*- -./!0 @M44W78K /;MH67Q /-4@G7HI&)%+, MPON4 78QR@O7.8 P.4 1 L 3:
中图分类号
［ ］ !EE" 年 +’<F G’HI:FJ 大学的 K@L<3MM’F DN 等 ! 从小鼠骨
骼肌 @B*D 文 库 中 克 隆 得 到 ! 个 新 基 因 AB5./ （ AM’O?< 6F; ， 从蛋白结构来看， B:PP3M3F?:6( 56@?’M./） AB5./ 因子具有 2A5. ! 超家族的典型结构特征， 其中包括分泌用的信号肽、 蛋白酶 水解加工位点及含 E 个半胱氨酸残基的高度保守的 N 端区 域。进一步研究发现 AB5./ 主要在小鼠的骨骼肌中表达， 并 且 AB5./ 基因敲除鼠的骨骼肌是正常野生型小鼠的 1 倍以
M8Q Q7KNHO7.8 .P 4N@.6F78M8O /;MH67Q S7O: !"# GJ M8Q $%& J
*
讨
论
#"#
鸡半长 ’()%& 在大肠杆菌中的诱导表达 高效原核表达载体 /-4@G7HI 的启动子为来源于 ’() 与
本研究 试 图 通 过 B-&’>B 的 方 法 扩 增 得 到 并 克 隆 鸡 再进行诱导表达， 然而检测结果并 )%+&, 基因的全长 @%A(， 不理想。这可能是由于完整 )%+&, 蛋白的结构对宿主菌的 生长发育具有一定的毒害作用。因此选用 )%+&, CD 端半长 表达量仍然不是很高， 但可以通过大量 @%A( 进行诱导表达， 培养与亲和层析纯化的方法得到较多量的目的蛋白， 从而为 进一步研究 )%+&, 的功能奠定了基础。 产蛋鸡和肉用仔鸡经过长期的遗传选育在生长发育上 有着根本的差异， 特别是在骨骼肌的生长发育方面， 肉用仔 鸡骨骼肌的发达程度远远高于产蛋鸡。这种骨骼肌生长发 育的差异使禽类成为我们研究动物肌细胞的生长和分化的
鸡生长分化因子 !"#./ $"%& 的克隆、 表达及蛋白纯化
杨威 王海霞 陈岩 张勇 朱大海"
（哈尔滨工业大学生命科学与工程系， 哈尔滨 !4%%%!）
关键词
AB5./，融合蛋白，表达，纯化 C"/ 文献标识码 D 文章编号 !%%%.1%0! （$%%!） %#.%#0%.%1 司产品； 异丙基. （ QL2A） 为 2#B*D X:U6J3、 .B 硫 代 半 乳 糖 苷 ! 氨苄青 LM’93U6 公司产品； R2.LNR 试剂盒购自 N(’F?3@< 公司； 霉素、 核酸分子量标准为 Y:U96 公司产品； 镍.*2D 琼 LKY5、 脂糖介质为 C:6U3F 公司产品； B*D 胶回收试剂盒购自原平 皓公司。其它常用化学试剂均为国产分析纯。 ’() ’()(’ 方法 骨骼肌组织总 R*D 的提取。在液氮中研磨 R2.LNR：
基因时发现， 骨骼肌高度发达的比利时蓝牛其 AB5./ 基因由
［1， #］ ， 因此推测比利时 于突变不能合成有活性的 AB5./ 因子
蓝牛骨骼肌的超量生长可能是由于在骨骼肌细 胞 中 缺 少 在 GQ& 感染所引起的骨 AB5./ 因子的抑制作用所致。另外， 骼肌萎 缩 而 消 瘦 的 病 人 中， AB5./ 基 因 的 表 达 高 于 正 常
1期
杨威等： 鸡生长分化因子 )%+&, @%A( 的克隆、 表达及蛋白纯化
19!
蛋白经 !"# $%$&’()* 电泳， 考马斯亮蓝染色进行检测。 !"#"$ 经鉴定半长的 )%+&, 重 )%+&, 重组蛋白的分离纯化： 组蛋白为可溶性蛋白。因此大量培养及诱导经转化的 -./!0 大肠杆菌， 收获的菌体在冰浴中超声破碎， 离心收集上清液 （12 ， 。用镍亲和层析的方法分离带有 9 !300045678， !3678） 个组氨酸的重组 )%+&, 融合蛋白： 将样品与镍&琼脂糖介质 用含 !066.;5< 及 "066.;5< 咪 在 12 条件下作用 !: 后装柱， 再用含 !0066.;5< ? 30066.;5< 咪 唑的 =>(> 溶液洗杂蛋白， 唑的 =>(> 溶液洗脱目的蛋白， 最终分离得到纯化的鸡 > 端 半长 )%+&, 重组蛋白。