番茄E8启动子乙烯应答元件克隆及DNA序列分析
基因克隆载体
I逆境胁迫因子主要有干旱、盐渍、低温、水涝等，是限制植物生长和区域分布以及影响农作物产量和质量的重要因素。
植物对这些逆境胁迫的适应主要被转录因子和调节基因（诸如控制多重抵御的酶、蛋白等）所介导。
现有研究证明，与转录因子活力有关联的是转录辅激活子，它能增强转录因子和顺式作用元件的结合。
MBF1是一个转录辅激活子，通过一个激活物和一个TA TA盒结合蛋白的桥连作用来调节转录激活。
MBF1基因最早是在蚕、果蝇等动物体中被发现，后来在植物中也发现了MBF1基因。
据报道，在拟南芥中的MBF1基因的超表达能增强其抵抗逆境胁迫的能力，而在番茄中关于此基因还没有相关的报道，本论文拟通过在番茄中超表达MBF1基因研究其对逆境胁迫的抗性能力，从而明确MBF1基因的分子作用机制，主要研究内容及结果如下：1.番茄MBF1基因的克隆以AC++番茄果实的总RNA为模板，体外反转录合成cDNA，以cDNA为模板，通过PCR扩增得到得632bp大小的片段，将其命名为LeMBF1，并登录NCBI GenBank，登录号为EF051474。
将其与拟南芥中的MBF1基因进行同源性比较，在DNA水平上的序列相似性为56%，在氨基酸水平上的序列相似性为82%，是一个新基因。
2.Northern杂交技术分析番茄LeMBF1基因的表达特性克隆番茄MBF1（LeMBF1）基因特异片段，以此作为探针,通过Northern杂交技术分析LeMBF1基因的表达特性，结果显示LeMBF1基因的表达能被高温、干旱诱导，被复水所抑制；伤害处理能诱导WT番茄叶片中该基因的表达，对Nr 番茄叶片中该基因的表达基本无影响，抑制rin番茄叶片中该基因的表达；外源乙烯处理绿熟期果实，LeMBF1基因的表达变化不明显，说明在这一时期外源乙烯并不诱导LeMBF1基因的表达。
3.双元超表达载体pBIN19-MBF1的构建验证的LeMBF1基因与经Pst I酶切的pDH51载体通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转经PCR以及酶切鉴定确为重组中间载体质粒，且外源片段方向正确，命名为pDH51-MBF1。
番茄SlMYB48_基因生物信息学及表达分析
中国瓜菜2024，37（4）：27-35收稿日期：2023-10-10；修回日期：2023-12-20基金项目：烟台市科技计划项目（2022XCZX091）；国家现代农业产业技术体系专项（CARS-23-G11）；重庆市巫山县科技项目（wskjdx-bxm2023004）；国家自然科学基金面上项目（32372737）；西南作物基因资源发掘与利用国家重点实验室开放课题（SKL-KF202224）作者简介：刘佳凤，女，在读硕士研究生，研究方向为番茄抗逆基因的验证。
E-mail ：*******************通信作者：李涛，男，正高级农艺师，研究方向为蔬菜育种及分子生物学。
E-mail ：****************DOI ：10.16861/ki.zggc.202423.0652番茄SlMYB48基因生物信息学及表达分析刘佳凤1，郭晓青2，王桂强3，王虹云4，朱桐1，曹守军4，姚建刚4，张丽莉4，张瑞清4，赵婧1，李涛1，4（1.烟台大学生命与科学学院山东烟台264000 2.烟台市农业技术推广中心山东烟台2654993.招远市张星镇农业综合服务中心山东招远2654034.山东省烟台市农业科学研究院山东烟台264500）摘要：MYB 转录因子是植物转录因子家族中数量最多、用途最广的成员之一，为挖掘更多番茄（Solanum lycopersi-cum ）MYB 转录因子家族成员信息，初步探究其表达模式及功能，以番茄Ailsa Craig 为试材，采用RT-PCR 的方法克隆SlMYB48基因，并对其进行生物信息学及表达、定位分析。
结果表明，番茄SlMYB48基因的开放阅读框（ORF ）长度为708bp ，编码235个氨基酸，在番茄的根中表达量最高，叶中次之。
SlMYB48蛋白含有保守的MYB 结构域，定位于细胞核中，属于不稳定、亲水性蛋白。
对SlMYB48启动子分析，发现其含有大量的逆境响应元件，qRT-PCR 及RNA-seq 数据库分析结果表明，高盐、生物逆境胁迫条件下，SlMYB48基因表达量均随处理时间延长而升高，干旱胁迫条件下表达量下降，推测其可能参与番茄生物及非生物逆境胁迫反应。
番茄抗青枯病基因的克隆及高通量分子标记的开发
基于TRBW-Marker的多态性分析结果，该标记有望应用于番茄抗青枯病育种中，提高育种效率 和准确性。
抗青枯病基因功能验证
TRBW基因过表达载体构建
构建TRBW基因过表达载体，并转化至感病番茄品种中，获得转基因植株。
TRBW基因过表达对番茄抗青枯病能力的影响
高通量分子标记技术应用
分子标记辅助育种
高通量分子标记技术可用于快速、准确 地检测抗病基因，提高育种效率。通过 分子标记辅助育种，可以将多个抗病基 因聚合到一个品种中，育成具有持久抗 性的番茄新品种。
VS
基因定位与克隆
高通量分子标记技术可用于抗病基因的定 位和克隆。通过构建高密度遗传图谱和关 联分析，可以精确地定位抗病基因，并克 隆其编码序列，为深入研究抗病机理和开 发新型抗病策略提供基础。
02
实验材料与方法
实验材料来源及准备
1 2
3
番茄品种选择
选用具有抗青枯病性状的番茄品种作为实验材料。
DNA提取
采集番茄叶片，利用CTAB法提取高质量DNA，用于后续实 验。
病原菌准备
从青枯病病区采集病原菌，进行分离、纯化和扩增，用于接 种实验。
基因克隆技术流程
目的基因筛选
利用生物信息学方法，从已知抗 病基因数据库中筛选候选目的基 因。
分布与危害
番茄青枯病广泛分布于世界各地番茄产区，尤其在温暖潮湿地区发病严重。该病害可导致番茄减产甚 至绝收，给农业生产造成巨大损失。
抗青枯病基因研究现状
抗病基因鉴定
目前，已有多个与番茄抗青枯病相关的基因被鉴定出来，如Pto、Prf等。这些 基因通过不同的机制赋予番茄对青枯病的抗性。
番茄ACO基因的克隆及其RNAi对乙烯产量的抑制
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(3):464~468*Fundation items:National Natural Science Foundation of China (No.39770521and 39200079),the State High Science and Techndogy Program(863) (No.2001AA212221)and Natural Science Foundation of Hainan Province (No.80540). **Author for correspondence.Professor,major research on molecular breeding. Received:20060830Accepted:20061115·研究论文· Cloning of Gene and Inhibition of EthyleneEvolution in Tomatoes with RNA Interfernce*CHEN Yinhua 1,3,4 ,OUYANG Bo 1 ,LI Hanxia 2 ,YE Zhibiao 1,2**A fragment of 1018bp of gene cDNA sequence was cloned from tomato ( )leaves incubated with pathogen using RTPCR with two PCR primers designed according to the sequence of tomato cDNA clone ( ).The result through BLAST search showed the sequence presenting a very high match with thegenes in the other plants and its homology was from 83%to 99%.Using this sequence,a RNA interference (RNAi)transformation vector (pD311)was constructed through the way of BP cloning and transformed into tomato.Twentyseven regenerated plants with kanamycin resistance were obtained,show ing that the transgene integrated into tomato genome was proved with PCR and Southern blot.The ethylene respiration amount of the RNAi transgenic tomato plants was measured by gas chromatography,resulting in that ethylene evolution was specifically inhibited in leaves and fruits of the transgenicplants.tomato;ACC oxidase gene;RNA Interfernce;transformation番茄 基因的克隆及其 RNAi 对乙烯释放的抑制陈银华 1,3,4 ，欧阳波 1 ，李汉霞 2，叶志彪 1,2 **（1.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室， 武汉 430070；2.华中农业大学国家蔬菜改良中心 （华中分中心）， 武汉430070； 3.教育部热带生物资源研究及利用重点实验室， 海口 570228； 4.海南大学生命科学与农学院， 海口 570228） 摘要： 筛选番茄（ ） 幼苗 cDNA 文库获得与番茄抗性相关的克隆， 设计引物，利用 RTPCR 方 法从受到病原侵染的番茄叶片中获得长 1018bp 的候选片段，同源性分析发现该片段与其它作物上发表的基因序列高度同源， 同源率 83%~99%， 推断该基因为番茄ACO 基因家族的新成员。
苹果中乙烯响应转录因子基因的克隆及序列分析
苹果中乙烯响应转录因子基因的克隆及序列分析蔡玉迎1，宫 钰1，王 娟2，于立帅2，陈广艳2，成妮妮1（1.临沂大学 生命科学学院，山东 临沂 276005；2.临沂大学 农林学院，山东 临沂 276005）摘 要：乙烯响应因子(AP2/ERF)转录因子家族是植物中广泛存在的一类转录因子，它们对植物的生长发育、次生代谢过程和植物的抗胁迫能力具有重要的调控作用。
通过对苹果中响应乙烯的转录因子(ERF)家族进行分析，选择具有代表性的转录因子基因进行设计引物。
以苹果果皮为试验材料，从中分离出响应乙烯的转录因子1、2、3、5的基因，并对其进行序列比对分析，发现这4个基因序列差别较大，但具有很保守的共同序列，初步确定其功能上有一定的相关性。
关键词：AP2/ERF；苹果；转录因子；乙烯疾病、高温、干旱、盐碱等环境胁迫对植物的生长发育、器官形成等过程具有不利的影响。
研究发现，当植物在生长过程中被环境胁迫刺激后，就会激活植物中含有的气体激素信号途径，像植物激素脱落酸、赤霉素、细胞分裂素、乙烯等，它们在植物体内的含量虽然不高，但却在植物的生长发育和环境适应中起着至关重要的作用[1,2]。
近年来，随着测序技术的发展和研究的深入，许多物种的基因组已经完成测序，例如拟南芥等模式生物，在基因组序列测定中发现了大量的转录因子编码基因，如AP2/ERF是植物中特有的转录因子，属于超家族因子，参与花[3]、果实[4]和种子发育[5]等植物生长发育的多种生物学过程，在植物抵抗干旱[2]、高盐[6]、低温[1]等非生物胁迫和真菌、细菌、病原体等生物胁迫方面有重要作用[7,8]，是目前研究的热点之一。
它们对植物的生长发育、次生代谢过程和植物的抗胁迫能力具有重要的调控作用。
乙烯作为一种激素能促进植物的成熟，乙烯响应因子在生长发育、器官形成、抗病虫害以及对胁迫环境的响应等方面具有重要作用[9,10]。
近年来，乙烯的研究已经延伸到下游转录因子的调控机制，转录因子在植物的次生代谢过程中参与多步反应，因而也具有重要的调控作用。
番茄果实特异表达启动子E8P1的克隆及功能研究
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(2):362~364*基金项目： 农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室及国际科技合作重点计划项目 （No.2002DFG00016） 资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.杜永臣， 研究员， 博士， 主要从事蔬菜育种研究。
Email ： <yongchen.du@>,Tel ： 01068919515； 王晓武， 博士， 主要从事蔬菜生物技术研究。
Email ： <wangxw@>,Tel ： 01062146163。
收稿日期：20060414 接受日期： 20060526 ·研究简报· 番茄果实特异表达启动子的克隆及表达 *郭淑华， 杨宝军， 杜永臣 **， 王晓武 **（中国农业科学院蔬菜花卉研究所， 北京 100081）关键词： 番茄； 果实特异表达； 启动子中图分类号： S188 文献标识码： A 文章编号：10061304(2007)02036202 Clone and Expression of Fruit Specific PromoterGUO Shuhua,YANG Baojun,DU Yongchen**,WANGXiaowu**tomato ； fruit specific expression ； promoter启动子是番茄果实成熟乙烯响应性基因的启动 子区。
这个区域中存在着一些响应乙烯以及在果实发育和成熟过程中起调节作用的顺式作用元件，调节 基因在果实成熟过程中表达(Deikman .,1998)。
本研究根据 GenBank中 基因的启动子区序列设计引物，从番茄基因组中克隆 了该启动子， 构建了番茄果实特异表达载体， 并通过 RTPCR和基因检测了该表达载体的果实特异表达活性。
植物果实特异性启动子E8基因的克隆
Ｃｌｎ ｆＰｌ ｎ ｕ ｔＳ ｅ ｉ ｃ Ｅ８ Ｐｒ ｍ ｏ ｅ ｏ ｇ ｏ ａ ｔＦｒ ｉ・ ｐ ｃｆ ｏ ｉ ｔｒ
２ ＬｅＳｉ ｃ ＩｓｔｅｏＧ ｎｕＡｒｕｔｒ ｎ ｅ ｉ ， ｚｏ ７０７ ，ｈ ａ ．ｉ—ｃ ｎｅ ｎｔｕ ｆ ａｓ ｇｃｌ ａＵ ｉ ｒｔ ￣ｎｈｕ ３００ Ｃｉ ） ｆ ｅ ｉｔ ｉ ｕｌ ｖｓ ｙ ｎ
Ａｂ ｔａ ｔ Ｔｈ ｓ ｒ ｃ ： ｅ ＤＮＡ ａ ｘｒｃｅ ｒｍ ｏｙｅ ｏ ｓｏ ｍａｏ Ｍａ ｆ ｎ８ ２ ｂ ｉｈ ｓ ｔａ ｄ ｌｗ Ｈ ，ｔｐ ｂ ｔｐ ａ ｅ — ｗ ｓｅ ｔａ ｔｄ ｆｏ ｃ ｔｌｄ ｎ ｆｔ ｔ ｏｅ ０ ｙｈ ｇ ａ ｎ ｏ ｐ ｓｅ ｙｓｅ ｃ ｎ ｏ ｌ ｔｉ ， ＤＳ， Ｔ ｎ ｍｐ ｏ ｅ ＡＢ ｍｅｈ ｄ． ｅ ｉ ｒｖ ｄ Ｃ ｒｃ Ｓ Ｃ ＡＢ ａ ｄ ｉ ｒｖ ｄ ＣＴ ｔ ｏ Ｔｈ ｍｐ ｏ ｅ ＴＡＢ ｍｅｈ ｄ ｗａ ｈ ｅｔｍｅｈ ｄ ｉ ｈ ｔｏ ｓｔ ｅ ｂ ｓ ｔｏ ｎ ｔｅ ＤＮＡ ｘｒｃ ． ｅ ｅｔ ｔ Ｗ ａ ｕ ｅ ｔｉ ｓ ｈｓ ＤＮＡ ｓｓｅ ｃｌａ ｄ ａ ｌ ｅ ｙ ＰＣＲ ，ｈ ｒ ｄ ｃ ｆｗｈ ｃ ｓｒｃａｍｅ ｎ ｕ ｃｏ ｅ ｎ ｏ ｐ ａ ｔｎ ｉ ｎ ｍｐ ｉ ｄ ｂ ｉ ｆ ｔ ｅ ｐ ｕ ｔｏ ｉｈ ｗａ ｅ ｌｉ ｄ ａ ｄ ｓ ｂ ｌｎ ｄ ｉｔ ＭＤ１ 一 Ｓ ｍｐｅ ｏ Ｔ ｉ ｌ ８
Ｗ ＡＮＧ Ｙｕ— ｉ ， ｅ 。 Ｗ ＡＮＧ ａ —ｉ ｎ ＬＩ Ｍｅ — ｅ。 ＣＨＥＮ Ｘｉ ｘ ａ ＬＩＷ ｉ Ｗ ｎｇ ｔａ ２ ｎｇ ｆ ｉ ｎ
巴氏杜氏藻番茄红素β-环化酶基因的克隆及其启动子的活性分析
（ １ ． 华南理工大学轻工与食品学院， 广东广州 ５ １ ０ ０ ０ ６ ） （ ２ ． 华南理工大学生物科学与工程学院， 广东广州 ５ １ ０ ０ ０ ６ ）
摘要 ：杜氏盐藻是迄今 为止工业化生产 ｐ ． 胡萝 卜 素最成功的经济微藻之一，番茄红素 ｐ ． 环化酶 （ Ｌ ｙ ｃ Ｂ） 是催化番茄红素合成 胡萝 卜 素的关键酶。本研究根据 实验室克隆得到的 Ｌ ｖ ｃ Ｂ的 ｃ Ｄ ＮＡ序 列，通过分析其保守序列设计 引物，通过分段克隆 Ｐ Ｃ Ｒ及基 因 组步移 的方法，克隆获得几乎完整的 Ｌ ｙ ｃ Ｂ基 因组序列。测序结果表明，克隆到的该部分 Ｌ ｙ ｃ Ｂ基 因组序列含有 ５ ８ ６ ３ ｂ ｐ ，由 １ １ 个外 显子和 １ ０个内含子组成 。再通过基因组步移的方法，获得 Ｌ ｙ ｃ Ｂ基因启动子和终止子序列。其 中，５ ’ 端上游序列长度为 ２ ５ ６ ６ ｂ ｐ ，３ ’ 端下游序列长度为 ８ １ ８ ｂ ｐ 。采用 Ｐ ｌ ａ ｎ ＆ Ａ Ｎ在线启动子预测工具进行 分析 ，结果表 明，该基 因启动子含有一些顺式作用元件如光响应 元件、盐响应元件等，表明巴氏杜 氏藻 Ｌ ｙ ｃ Ｂ基 因的表达可能受到光照及盐浓度等 因素的调控。 关键词：巴氏杜 氏藻；番茄红素 Ｂ ． 环化酶 （ Ｌ ｙ ｃ Ｂ）基因；启动子；终止子
八氢番茄红素脱氢酶基因超表达载体的构建及表达鉴定
八氢番茄红素脱氢酶基因超表达载体的构建及表达鉴定摘要:八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄中该酶的编码基因序列设计一对特异引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1 900 bp的全长cDNA片段｡对这个全长片段构建了超表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体｡采用农杆菌介导的方法转化番茄获得10株转基因植株,PCR检测表明外源基因已导入番茄基因组中｡转基因番茄果实的番茄红素含量分析结果表明,转基因后代株系番茄红素平均含量比对照增加了1.4倍,PDS编码基因的超表达有效促进了番茄果实中番茄红素的合成和积累｡关键词:番茄;八氢番茄红素脱氢酶;超表达;载体构建;遗传转化Construction of Overexpression Vector for Phytoene Dehydrogenase Gene and Its Expression Identification in TomatoAbstract: Phytoene dehydrogenase (PDS) is a key enzyme in the carotenoid biosynthetic pathway. A 1 900 bp full-length cDNA fragment was amplified by RT-PCR from tomato using a pair of specific primers based on the coding sequence of PDS. Using the amplified fragment, the overexpression vector was constructed and identified by digestion with appropriate enzymes. The vector was transformed into tomato by Agrobacterium-mediated method and ten transgenic plants were obtained. The result of PCR revealed that the target gene was integrated into the tomato genome. The lycopene contents in the fruits of transgenic lines were 1.4 times higher than that of the control, suggesting that overexpression of PDS significantly enhanced the lycopene biosynthesis and accumulation in transgenic tomato fruits.Key words: tomato; phytoene dehydrogenase; overexpression; construction of expression vector; genetic transformation番茄红素是一种天然植物色素,是许多类胡萝卜素生物合成的中间体｡番茄红素广泛存在于水果及蔬菜中,在番茄中的含量最高｡近年来国内外许多研究表明,番茄红素可以猝灭活性氧类物质,清除体内自由基,活化免疫细胞,具有防癌､抗癌作用｡番茄红素能消除香烟和汽车废气中的有毒物质,可以预防和治疗心脑血管疾病,保护皮肤｡番茄红素的抗氧化性能是天然类胡萝卜素中最强的,其独特的生理功能正越来越受到人们的重视[1]｡经过多年的研究,人们已基本清楚了植物类胡萝卜素的生物合成途径[2,3],也克隆了合成途径中的大多数关键酶基因[3-5],这使得人们可以通过基因工程的方法调控番茄红素的生物合成｡在植物类胡萝卜素的生物合成途径中,八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是促进番茄红素合成的关键酶,该研究的目的是通过RT-PCR的方法从番茄中克隆该关键酶基因,构建超表达载体并通过农杆菌介导对番茄进行遗传转化,以增加转基因后代植株中的番茄红素含量,提高番茄果实的营养价值｡1 材料与方法1.1 材料番茄品种中蔬5号､大肠杆菌DH5α､植物表达载体pMV(由pBI121改造而成,即将GUS片段缺失,引入含有5′-XbaⅠ-XhoⅠ-KpnⅠ-SacⅠ-3′多酶切克隆位点的片段)由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室番茄组提供｡TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司,克隆载体质粒pMD18-T购自TaKaRa公司,第一链cDNA 合成试剂盒､Taq DNA聚合酶､T4 DNA连接酶､限制性内切酶购自Fermentas公司,DNA纯化回收试剂盒及其他相关试剂购自上海生工生物工程有限公司｡1.2 方法1.2.1 RT-PCR扩增及基因克隆根据GenBank中番茄八氢番茄红素脱氢酶(PDS)编码基因序列(M88683)设计一对引物为F:5′-TTCAACTTCAACCCAACC-3′,R:5′-TCACCTCGCACTCTTCTT-3′｡从番茄组织中抽提RNA进行反转录,获得cDNA第一链｡以获得的cDNA为模板进行RT-PCR反应,反应体系为25 μL,内含1×PCR Buffer,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,基因特异引物0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶1U,模板约100 ng｡反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃､1 min,56 ℃､1 min,72 ℃､2 min,35个循环;最后72 ℃延伸10 min｡回收RT-PCR扩增得到的cDNA片段,克隆到pMD18-T载体上,方法见文献[6]｡重组克隆测序由上海英骏生物技术有限公司完成｡1.2.2 超表达载体的构建将含有PDS编码基因的pMD18-T载体用SalⅠ和KpnⅠ双酶切,回收小片段克隆到经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切的pMV载体上,构建成超表达载体(图1)｡将构建的载体通过电击法导入根癌农杆菌EHA105中｡1.2.3 番茄的遗传转化番茄的遗传转化参见文献[7]｡当卡那霉素抗性芽长到2~3 cm后切下抗性芽,插入到生根培养基中诱导生根｡当根长到3~4 cm后将小植株开瓶炼苗3~5 d,然后移栽到花盆中｡1.2.4 转基因植株的检测及番茄红素含量测定提取卡那霉素抗性植株及未转化植株的总DNA,用NPTⅡ引物(F:5′-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3′,R:5′-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3′)进行PCR检测｡PCR反应体系和扩增程序见文献[7]｡转基因植株及对照番茄红素含量测定参照万群等[8]介绍的方法｡2 结果与分析2.1 番茄PDS编码基因的克隆以番茄叶片第一链cDNA为模板,通过RT-PCR扩增出一大小在1 900 bp左右的片段(图2)｡回收目的片段克隆到pMD18-T载体上｡重组质粒经SalⅠ与KpnⅠ双酶切检测,可切下一大小在 1 900 bp左右的片段(图3),证明克隆成功,命名为pMDPDS｡重组子测序结果表明,所克隆的片段全长1 927 bp,其序列与GenBank中M88683的序列完全一致｡2.2 植物超表达载体的构建选择经测序验证的正义重组克隆子pMDPDS,先用SalⅠ和KpnⅠ双酶切,再与经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后的pMV载体连接,构建成超表达载体,定名为pMPDS ｡pMPDS经XbaⅠ和KpnⅠ双酶切检测,可切下一大小在1 900 bp左右的片段(图4),表明所构建的超表达载体完全正确｡2.3 转基因植株的获得与检测采用农杆菌介导的共培养法获得了11株卡那霉素抗性再生植株,这些抗性植株与对照相比没有明显的形态学差异｡以pMPDS载体为阳性对照,未转基因植株为阴性对照,利用NPTⅡ引物对卡那霉素抗性植株进行PCR的检测结果显示,10株再生植株能扩增出预期的740 bp的电泳带,而未转基因植株则无该特异带(图5),初步表明外源基因已整合到番茄的基因组中,PCR结果阳性的植株占抗性植株的比例为90.9%｡2.4 转基因植株后代番茄红素含量分析对转基因番茄植株T1代株系测定果实番茄红素含量,结果见图6｡从图中可看出,转基因植株果实番茄红素含量都比对照显著增加,最高的株系6比对照增加了2.1倍,平均增加了1.4倍｡3 小结与讨论植物类胡萝卜素生物合成途径是重要的色素合成途径,由于植物类胡萝卜素合成途径中几乎所有的基因均已被分离和鉴定,使得利用转基因技术提高一些主要农作物中类胡萝卜素的含量成为可能｡目前,植物类胡萝卜素基因工程进展很大[9-11],转基因“金稻”的培育就是一个突出的例子[12]｡本研究从番茄中克隆了植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的编码基因,并构建了该基因的超表达载体,通过农杆菌介导法获得了转基因番茄植株,转基因后代株系果实中番茄红素平均含量比对照增加了1.4倍｡由此可见,超表达PDS的编码基因成功地达到了增加番茄果实中番茄红素的含量和提高番茄果实营养价值的目的｡Fray等[13]的研究表明,组成型过量表达番茄PSY的编码基因导致转基因番茄植株矮化｡同样,Busch等[14]的研究表明,烟草PSY的编码基因组成型过量表达,也引起转基因烟草植株矮化､叶片形态变化等不良反应｡本研究中超表达载体采用的是CaMV 35S启动子,获得的10株转基因番茄植株是组成型超表达PDS的编码基因的,这些转基因植株与野生型相比没有明显的形态学差异,这与张建成等[15]的研究结果一致｡在转基因研究中,人们通常选择组织或器官特异性启动子,以减少对非靶器官或组织生长的影响｡Aluru等[16]利用特异性启动子,将类胡萝卜素合成途径中的3个基因PSY､PDS､ZDS同时过量表达,发现转基因玉米胚乳中积累的总的类胡萝卜素含量是对照的34倍｡因此,在应用基因工程技术调控类胡萝卜素生物合成途径时,应尽量选用组织或器官特异性启动子｡参考文献:[1] 李京,惠伯棣,裴凌鹏. 番茄红素——被关注的功能因子[J].食品科学,2005,26(8):461-464.[2] HIRSCHBERG J. 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番茄Trihelix家族SIP1亚家族基因(SlGT-33)克隆表达分析及功能研究
2022-2023学年山东省莱阳市一中高三第三次模拟考试生物试卷含解析
2023年高考生物模拟试卷考生请注意：1．答题前请将考场、试室号、座位号、考生号、姓名写在试卷密封线内，不得在试卷上作任何标记。
2．第一部分选择题每小题选出答案后，需将答案写在试卷指定的括号内，第二部分非选择题答案写在试卷题目指定的位置上。
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考试结束后，请将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题：（共6小题，每小题6分，共36分。
每小题只有一个选项符合题目要求）1．下列有关性别决定与伴性遗传的叙述（不考虑突变），正确的是A．性染色体上的基因都与性别决定有关B．性染色体上基因的遗传遵循自由组合定律C．伴X染色体隐性遗传病，人群中女患者远远多于男患者D．伴X染色体显性遗传病，男患者的女儿均患病，男患者的儿子可能患病2．图所示为氢元素随化合物在生物体内代谢转移的过程，其中分析合理的是：（）A．①过程只能发生在真核生物的核糖体中B．在缺氧的情况下，③过程中不会发生脱氢反应C．M物质是丙酮酸，④过程不会发生在线粒体中D．在氧气充足的情况下，②③过程发生在线粒体中3．下列为达成实验目的而进行的相应实验操作，不正确．．．的是（）选项实验目的实验操作A 观察花生子叶细胞中的脂肪颗粒用苏丹Ⅲ染色后，再用酒精洗去浮色B 除去粗提DNA中的蛋白质杂质将析出物置于二苯胺试剂中并加热C 观察洋葱根尖分生区细胞有丝分裂依次进行解离、漂洗、染色、制片D 诱导外植体脱分化为愈伤组织在MS培养基中添加所需植物激素A．A B．B C．C D．D4．下列关于“肺炎双球菌离体转化实验”的叙述，错误的是（）A．该实验研究早于“T2噬菌体侵染大肠杆菌实验”B．实验中用细菌培养液对R型菌进行了悬浮培养C．S型菌的DNA使R型菌发生稳定的可遗传变异D．R型菌的转化效率仅取决于S型菌DNA的纯度5．如图中的曲线表示人体内某抗体在两种免疫接种方式后的含量变化。
下列说法正确的是（）A．疫苗必须通过注射进入人体B．采用方法1会使人体产生细胞免疫应答C．方法2中注射的可以是减毒的微生物D．注射天花疫苗属于方法1的免疫接种6．某人从未感染过甲型H7N9流感病毒，下列有关叙述正确的是A．流感病毒可以发生基因突变、基因重组和染色体变异B．浆细胞可以接受流感病毒的刺激，使其分泌特异性抗体C．一旦甲型H7N9流感病毒侵入该人体，记忆B细胞就会迅速增殖分化D．抗体只能作用于细胞外的流感病毒，不能直接作用于细胞内的流感病毒二、综合题：本大题共4小题7．（9分）ACC合成酶是乙烯合成过程中的关键酶，由ACC合成酶基因（简称A基因）控制合成。
番茄SlGAMYBL2基因启动子的克隆及表达载体的构建
番茄SlGAMYBL2基因启动子的克隆及表达载体的构建李姗姗;赖馥茜;蓝春莲;王小敏;莫昭展【摘要】采用5'端系列缺失分析法,利用PCR方法对SlGAMYBL2基因上游序列进行特异性扩增,分别克隆1368bp、1127bp、990bp和730bp的启动子片段并构建到pLPlp100载体,经鉴定,构建了4个含SlGAMYBL2启动子不同区段融合GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌转化烟草愈伤组织,转化植株经PCR和GUS染色法鉴定,表明构建的表达载体已经转化进烟草植株,为确定SlGAMYBL2基因上游片段中的顺式作用元件响应非生物胁迫诱导中的作用机理以及后期研究该启动子的组织特异性及诱导表达模式奠定基础.【期刊名称】《玉林师范学院学报》【年(卷),期】2017(038)002【总页数】5页(P70-74)【关键词】番茄;启动子;载体构建;顺式作用元件【作者】李姗姗;赖馥茜;蓝春莲;王小敏;莫昭展【作者单位】广西大学林学院,广西南宁 530004;广西高校桂东南珍稀经济物种保护利用重点实验室培育基地,广西玉林 537000;玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林537000;广西高校桂东南珍稀经济物种保护利用重点实验室培育基地,广西玉林 537000;玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林537000;广西高校桂东南珍稀经济物种保护利用重点实验室培育基地,广西玉林 537000;玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林537000;广西高校桂东南珍稀经济物种保护利用重点实验室培育基地,广西玉林 537000;玉林师范学院生物与制药学院,广西玉林537000;广西高校桂东南珍稀经济物种保护利用重点实验室培育基地,广西玉林 537000【正文语种】中文【中图分类】Q945.78番茄营养丰富，风味香郁，适应性广，产量高，生长期短，在世界各地被广泛种植，番茄的遗传转化一直受到各国科研工作者的关注，从1986年Mc-Cormick[1]等人首次报道获得番茄转基因完整植株以来，番茄遗传转化得到了不断发展.非生物胁迫是制约作物生长并导致农业减产的一个重要因素，利用基因工程技术提高作物的抗非生物胁迫性已成为植物分子生物学领域的一项重要研究课题.植物为了生存，在遭遇非生物胁迫时，必须通过形态及生理生化代谢等方面的调整，以适应环境的胁迫. 近年来的研究表明，许多植物基因的表达，都受逆境胁迫的诱导，抗逆基因的表达又是依靠其上游启动子的调控来实现的[2].启动子是起始基因转录的一段DNA序列，是基因表达调控的关键点，也是生物学上的一个研究热点.Mariani 等将烟草的花粉绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29和核酸酶Barnase、Rnase T1 基因融合后转化到植物中，核酸酶基因在花药中特异性表达，破坏绒毛层，获得雄性不育的烟草和油菜[3，4]，该技术创造的不育系至今已经在烟草[5]、油菜[6]、水稻[7]、拟南芥[8]等植物中取得成功.与非生物胁迫相关的启动子为诱导型启动子，而目前研究最广的非生物胁迫的条件是干旱.低温和盐碱等.如拟南芥rd29A基因启动子[9]可被脱水诱导，苋属植物的CMO基因[10]、辽宁碱蓬BADH基因启动子[11]及盐芥的TsVPI基因启动子[12]等作为盐诱导启动子.而大豆的GmDREB3启动子[13]有低温响应序列.在前期研究中，我们克隆了番茄GAMYB基因SlGAMYBL2并获得了该基因在外源激素和非生物胁迫中的表达调控特征.本研究旨在SlGAMYBL2启动子的分离，找到影响SlGAMYBL2启动子功能发挥的基因片段，并构建含有该目的片段的重组截短载体.分析启动子的组织特异性及在胁迫中的诱导模式，阐明启动子诱导与基因表达的关系，为今后研究逆境诱导启动子提高植物的抗逆性提供材料和奠定基础.1.1 材料RNA提取试剂盒、快速凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；pEasy-Blunt载体、 TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶，限制性内切酶Kpn I、Xho I购自 TakaRa公司；Easy Pfu聚合酶、PCR Mix、大肠杆菌，pEasy-Blant载体购自北京生物全式金生物公司E. Coli DH5a为本室保存菌种；目的片段测序由南京金斯瑞测序完成.1.2 方法1.2.1 引物的设计根据GenBank序列，利用软件 PrimerPremier5.0设计4对不同的引物，为了方便后续载体的构建，在上下游引物5'端分别引入XbaⅠ和KpnⅠ限制性内切酶的识别序列.每对引物的下游引物均为：R: 5'GGGGTACCGAGTAATAAGGCATCACATCCAAGA3'，（下划线为Kpn I酶切位点）.4条上游引物分别为：F1：5'GCTCTAGATGAGGCATTTTCACGCAATAGAC3'，F2：5'GC TCTAGATGGGGAGAATCCGAAAGCACG3'，F3：5'GCTCTAGAGGTGCACGAGGTTCCCTTATGT3'，F4：5'GCTCTAGACTTGAATCCTCTGCTCGCCGT3'（下划线为Xba I酶切位点）.由上海生工生物有限公司合成.启动子序列顺式作用元件分析采用PlantCARE分析（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）.1.2.2 番茄DNA的提取与PCR扩增将番茄成熟种子用70%的酒精消毒30S，用无菌水洗涤3次，再3%次氯酸钠消毒5min，用无菌水洗涤3次，放置于MS培养基上发芽，培养温度为25℃.取适量的番茄幼苗，按照北京康为世纪生物技术有限公司的通用型柱式基因组提取试剂盒的说明书对番茄进行DNA的提取.以DNA为模板进行PCR扩增，反应的体系为：F引物（5μM）4μL，R引物（5μM）4μL，Buffer 5μL，dNTP 5μL，DNA聚合酶1μL，DNA 2μL；反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 4min，扩增30个循环，最后72℃充分延伸10min.1.2.3 PCR产物凝胶电泳及目的片段的回收PCR产物，用1%的琼脂糖电泳鉴定后，按照北京康为世纪生物技术有限公司的胶回收试剂盒回收说明书进行PCR扩增产物的回收.1.2.4 中间载体pEasy-SlGAMYBL2QF1的构建PCR回收产物作为目的基因与pEasy-Blunt载体连接，连接体系：PCR产物2μL；pEasy-Blunt cloing Vector 1μL，室温反应5min后将离心管置于冰上.连接产物转化大肠杆菌E.Coli Trans-T1感受态细胞中，涂板在含卡那霉素的平板进行选择培养，挑选白色饱满的单菌落，于LB液体培养基过夜培养后按照北京康为世纪生物技术有限公司的质粒提取试剂盒说明书进行小质粒的提取，经酶切验证和南京金斯瑞测序验证，命名为pEasy-SlGAMYBL2QF1.1.2.5 截短基因的PCR扩增与回收以中间载体为模板，进行截短基因的PCR扩增.反应的体系为：F引物（5μM）4μL，R引物（5μM）4μL，Buffer 5μL，dNTP 5μL，DNA聚合酶1μL，DNA2μL；反应条件为：94℃变性5min；94℃ 30s，55℃30s，72℃ 4min，扩增30个循环；最后72℃充分延伸10min.PCR产物，用1%的琼脂糖电泳鉴定后，按照北京康为世纪生物技术有限公司的胶回收试剂盒回收说明书进行PCR扩增产物的回收.1.2.6 表达载体的构建将四条不同长度的目的基因与pLP100质粒用XbaⅠ和KpnⅠ分别进行酶切，电泳，然后回收目的片段及pLP100载体片段.按照pLP100载体片段4μL，目标片段DNA 4μL，Buffer 1μL，T4DNA Ligase 1μL的连接体系4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E.Coli Trans-T1感受态细胞中，涂板选择培养，挑选白色饱满的单菌落，LB液体培养基培养后按照北京康为世纪生物技术有限公司的质粒提取试剂盒说明书进行质粒的提取，进行酶切鉴定出含目的片段的阳性克隆，分别命名为pLP-SlGAMYBL2QF1、pLPSlGAMYBL2QF2、pLP-SlGAMYBL2QF3、pLP-SlGAMYBL2QF4.1.2.7 转基因植株的获得及GUS组织染色获得的表达载体经冻融法转化农杆菌菌株C58，按照Wang[14]等方法进行转化，转化植株利用GUS组织染色法进行染色鉴定.2.1 启动子顺式作用元件分析通过PlantCARE程序分析了该序列的一些顺式作用元件.在这些顺式作用元件中，有2个作用预测的响应水杨酸胁迫的TCA-elements（cis-acting element in volved in salicylic acid responsiveness）顺式作用元件，分别定位在-500/-509和-1956/-1965位置；有一个预测的响应干旱胁迫的MBS（MYB binding site in volved in drought-inducibility）顺式作用元件定位在-601/-606位置（图1）.说明SlGAMYBL2启动子有可能响应非生物胁迫.2.2 SlGAMYBL2启动子目的基因的扩增以番茄DNA为模板，进行PCR扩增，所产生的条带与预期的：L2QF1:1368bp；L2QF2:1127bp；L2QF3:990bp；L2QF4:730bp目的基因片段大小接近（图2），表明我们设计的引物是合理的，扩增所得条带经上海生工测序验证后，对其进行回收，用于后面的实验.2.3 表达载体的酶切验证与分析以我们实验室保存的pLP100质粒为载体，以截短型L2QF1、L2QF2、L2QF3、L2QF4的PCR扩增产物为目标片段，以经过XbaⅠ和KpnⅠ酶切回收后进行连接转化，涂板培养后挑选单菌落于LB液体培养基培养，提取质粒用酶切验证目的片段是否已经构建到该载体上，结果如图3所示，酶切出来的片段的大小：L2QF1:1368bp；L2QF2:1127bp；L2QF3:990bp；L2QF4:730bp与预期的完全相同，表明pLP-SlGAMYBL2QF1、pLP-SlGAMYBL2QF2、pLP-SlGAMYBL2QF3、pLP-SlGAMYBL2QF4表达载体构建成功.2.4 转基因烟草植株的获得及GUS活性检测将4个缺失片段重组质粒分别导入农杆菌C58中，通过叶盘转化法转化烟草叶片，经抗性筛选，并对所获得的转基因烟草植株叶片进行GUS活性检测.结果显示，转化的4启动子片段均能驱动GUS基因表达，烟草叶片组织染色呈现蓝色（图4）. 我们利用Prime5.0设计了特异性的引物，构建SlGAMYBL2 5'端系列缺片段经回收、纯化、酶切回收后，分别连接到pLP100载体上，最后成功构建了pLP-SlGAMYBL2QF1、pLP-SlGAMYBL2QF2、pLPSlGAMYBL2QF3、pLP-SlGAMYBL2QF4 4个驱动GUS基因表达的载体，并转化烟草植株获得了转基因植株并检测到GUS表达，说明即使是730bp的片段也含有了启动子所必须的基本原件，尽管在检测的转基因植株中都有GUS基因表达，然而，对于启动子上的顺式作用元件的作用仍需通过对GUS活性的定量检测才能进一步的确定.本实验结果为下一步确定SlGAMYBL2启动子的组织诱导模式和非生物胁迫响应模式奠定基础.【相关文献】[1]McCormick S, Niedermeyer J, Fry J, et al. Leaf disc transformation of cultivated tomato (L. esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. [J]. Plant Cell Rep, 1986, (5):81-84. [2]郑晓瑜，郭晋艳，张毅，李秋莉，植物非生物胁迫诱导启动子顺式作用元件的研究方法[J].植物生理学报2011，47(2)：129-135.[3]Mariani C, De Beuckeleer M, Truettner J, et al. Induction of male-sterility in plants by a chimeric ribonuclease gene [J].Nature, 1990, 347: 737-741.[4]Mariani C, Cossele V, De Beuckeleer M, et al. A chimaeric ribonuclease-inhibitor gene restores fertility to male-sterile plant[J]. Nature, 1992, 357-384.[5]李胜国，刘玉乐，朱峰，等。
乙烯受体基因LeETR1 在番茄突变体Epi 及其野生型中的表达
园 艺 学 报 2001,28(2):128~132Acta Horticulturae Sinica乙烯受体基因LeETR1在番茄突变体Epi及其野生型中的表达郑铁松1 应铁进1* 何国庆1 曹家树2(1浙江大学食品科学与营养系,杭州310029; 2浙江大学园艺系,杭州310029)摘 要:采用核酸酶保护分析(RPA)方法对番茄乙烯过表达单基因突变体Epi和野生型VFN8中LeETR1mRNA的表达特征进行了研究。
结果表明,在正常番茄中LeE TR1mRNA不受内源乙烯含量的影响,呈组成性表达。
LeE TR1mRNA在Epi部分组织中的表达强度发生了改变,并与Epi的形态特征变化相吻合,提示LeE TR1在叶片的形态建成、果实成熟和顶钩发育中可能起着重要的作用。
关键词:番茄;乙烯受体;LeETR1;核酸酶保护分析;基因中图分类号:S641.2;Q786 文献标识码:A 文章编号:0513 353X(2001)02 0128 05乙烯是调控植物生长发育、成熟衰老的重要激素,从种子萌发、叶片衰老、根茎伸长到果实成熟与软化等无不为乙烯所调节。
随着植物体内乙烯生物合成途径的阐明和分子生物学的深入研究,通过分子生物学途径调控植物内源乙烯的合成已取得了显著的成绩。
但相比而言,乙烯受体系统的研究则刚刚起步。
在拟南芥乙烯受体基因研究的基础上,最近在番茄上也分别克隆到了与拟南芥乙烯受体基因E TRI、ERS和ETR2同源的LeETR1、LeE TR2、NR、LeE TR4和LeERT5等5个乙烯受体基因 1~4。
但目前尚不了解这些基因在整个乙烯受体系统中的确切功能,因而难以实现乙烯受体基因调控的实际应用。
Epinastic(Epi)是美国加州大学的Bradford于1984年在番茄品种VFN8群体中发现的一个乙烯过表达的单基因突变体,Epi的表现型与其野生型亲本有着极大的差异 5。
我们拟通过研究Epi及其野生型中LeETR1基因的表达特性,对该基因在番茄乙烯受体系统中的功能进行初步探索。